punicalagin诱导血清低密度脂蛋白流入巨噬细胞

抽象的

高水平的循环低密度脂蛋白（LDL）是动脉粥样硬化发展的主要启动事件。最近，已显示多酚的抗真菌菌效应通过与其抗氧化能力无关的机制施加并源于与特异性细胞内或血浆蛋白质的相互作用。在这项研究中，我们研究了主要多酚在石榴中的相互作用，瞳孔旁白蛋白，与载脂蛋白B-100（Apob100）呈现LDL。Punicalagin在低浓度下与Apob100结合（0.25-4 μm）。结合后，它以浓度依赖性方式诱导LDL流入巨噬细胞，高达2.5倍。相反，与Apob100结合的另一种多酚，无比蛋白，不影响LDL流入。我们进一步表明，LDL流入特定通过LDL受体发生，然后LDL累积在细胞细胞质中。与Aviram等人的结果一起服用，即2000年，石榴汁和瞳孔诱导血浆LDL去除和抑制巨噬细胞胆固醇合成和积累，我们的结果表明，在结合后，PunicalicAGIN刺激LDL流入巨噬细胞，从而减少循环胆固醇水平．

1.介绍

低密度脂蛋白(LDL)颗粒是人体循环中提供胆固醇的主要外周组织，在动脉粥样硬化的发生中起着关键作用[1］．LDL是通过载脂蛋白B-100（的ApoB-100）的单个副本包围[2]其结合靶组织的细胞表面[根据LDL受体1］．

PunicalAGIN是一种可溶性多酚，从石榴，具有有效的抗氧化性能。Punicalagin保护巨噬细胞免受脂质积累和泡沫细胞形成[3.- - - - - -5］．同样地，紫癜金与他汀共同作用可显著抑制巨噬细胞泡沫细胞的形成，并抑制巨噬细胞胆固醇的生物合成。在高胆固醇血症患者中，他汀类药物与石榴汁联合使用可降低前者的剂量，从而防止其副作用，如肝酶升高、肌肉问题、认知丧失、神经病变、胰腺和肝脏功能障碍和性功能障碍[6，7］．石榴汁补充动脉粥样硬化小鼠减少巨噬细胞脂质过氧化、细胞胆固醇积累和动脉粥样硬化的发展[5］．紫红素的抗动脉粥样硬化作用是由于它的抗氧化能力[8］．然而，抗氧化活性也不能多酚细胞效应的唯一解释体内因为它们通过肠道进入血液的吸收很差，在小肠、肝脏和结肠中广泛代谢;因此，它们的生物利用度通常很差[9，10.］．

另一种抗真菌剂多酚是甘草蛋白，从甘草根中分离。假设其抗真菌性能从其强烈的抗氧化能力衍生[11.］．最近，我们表明，除了它是抗氧化剂外，Glabridin可以通过特异性结合保护血浆蛋白[12.］．事实上，与我们的研究一起，文献中的积累证据表明，多酚直接与酶，膜，受体和细胞或血浆蛋白相互作用，并调节细胞信号传导中涉及的关键蛋白的活性[13.- - - - - -16.］．因此，可以通过不一定与其抗氧化能力相关的机制来施加多酚的有益效果。

细胞通过吸收脂蛋白和通过的摄取来获得胆固醇新创合成。然而(类固醇生成组织除外)，它们不能分解它。由于过量的未酯化胆固醇对细胞是有毒的，生物已经发展了几种方法来保护自己不受胆固醇积聚的影响[17.］．巨噬细胞是这种“自我保护”的最好例证;它们占用大量含有胆固醇的，改性的脂蛋白，和其他细胞外碎片死细胞。巨噬细胞占用每单元多胆固醇比任何其他细胞类型和通过两种途径保护自己免受胆固醇毒性：一个是胆固醇与胆甾醇酯的酯化反应。然而，高含量的胆固醇酯的积累可能导致泡沫细胞的形成，并且，以后，动脉粥样硬化。针对胆固醇毒性防御的第二和主要线路是高密度脂蛋白（HDL）胆固醇流出。另外，相比于其它细胞，巨噬细胞具有胆固醇流出的附加的途径[17.］．过量的“外周”胆固醇返回到肝脏，在那里维持全身稳态水平的胆固醇。

在本研究中，punicalagin可能与ApoB100的相互作用及其生物学后果进行了研究。结果表明，punicalagin与ApoB100特异性结合，并诱导LDL通过LDL受体流入巨噬细胞;另一方面，光磊落，也结合ApoB100，不影响LDL内流。这些结果提供了一种新的机制——不同于经典的“抗氧化作用”机制——惩罚金通过降低血液循环中的胆固醇水平和减轻动脉粥样硬化。

2.材料和方法

2.1。J774A.1巨噬细胞线

J774A.1小鼠巨噬细胞从美国组织培养物保藏中心（ATCC，罗克维尔，MD）购买。将细胞在37℃，5％CO生长₂Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)含有葡萄糖(4500 mg/L)， 2 mM谷氨酰胺，10% w/v胎牛血清(FCS)， 1% w/v丙酮酸，0.5% w/v青霉素，链霉素和制霉菌素(所有化学品均购自Sigma-Aldrich)。

2.2。人类LDL隔离

LDL是从空腹血脂正常的志愿者（由赫尔辛基委员会法规批准用于研究）采取人血浆制备的。它是从等离子体由不连续密度梯度超离心分离[18.然后用乙二胺四乙酸二钠(EDTA) (1 mM, pH 7.4)对生理盐水进行透析。LDL在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至1mg蛋白/mL，透析两次，每次1小时，在4°C的PBS中再透析一次，以去除EDTA (PBS和EDTA购自Sigma-Aldrich)。

2.3。LDL氧化

将LDL（100mg蛋白质/ L）与10孵育 μ摩尔CuSO₄/ L（Sigma-Aldrich）在37℃下温和摇动3小时。通过测量234nm处的吸光度的增加来监测共轭二烯的形成。使用Spectramax M2读取器进行测量[8］．

2.4。荧光淬火测量

测量使用以前报道过的程序[19.］．简单地说，溶液在96孔黑色酶联免疫吸附试验(ELISA)板(Greiner Bio-One, Germany)中制备。每口井，2μL多酚[光甘草定、儿茶素或槲皮素(乙醇)或双蒸馏水(DDW)]加入5μL LDL或载脂蛋白B-100（Apob100）在PBS缓冲液中稀释，得到最终的多酚浓度在0.25至4的范围内 μm以及最终的LDL或apob100浓度为25或10 μG蛋白/ ml分别。Apob100购自Abcam，USA，槲皮素和儿茶素从Sigma-Aldrich购买，从甘草根提取物中分离出Glabridin [11.而punicalagin则是来自海法以色列理工学院医学院脂质研究实验室的Michael Aviram教授的慷慨礼物。

在加入多酚或Apob100溶液（25或37℃，REAC）的30分钟内测量荧光发射强度。

Fluorescence measurements were performed with an Infinite M200 PRO fluorescence spectrophotometer (Tecan) with emission spectra recorded from 320 to 450 nm at an excitation wavelength of 290 nm. If needed, the inner filter effect, which can decrease the fluorescence intensity, was corrected by using the following relationship: 在哪里和分别为校正后和观测到的荧光强度，是0.0165 μ米⁻¹ cm⁻¹和是0.0034 μ米⁻¹ cm⁻¹,为井径长度[20.，21.］．荧光猝灭可以通过两种不同的主要机制发生：静态和动态。两个淬火途径由Stern-Volmer方程描述： 在哪里和分别为无猝灭剂和有猝灭剂时的荧光强度，是斯特恩-沃尔默淬火常数吗为淬灭剂浓度。对于动态猝灭,可以写成： 在哪里双分子的猝灭速率常数是和吗在没有淬灭器的情况下，荧光团的寿命大约是10吗⁻⁸年代for a Trp residue [22.］．绑定参数如前所述计算[12.］．对于静态淬火，游离的和结合分子之间的平衡可以用被描述 在哪里是结合常数，反映了ApoB100/LDL与多酚的相互作用程度是结合位点确定结合到大分子多酚分子的数目的数目。如先前所述计算的热力学参数[12.］．为了表征ApoB100-punicalagin的相互作用，热力学参数焓(),熵(）和自由能（）进行了计算。可以通过检验并使用（5)．估计（6)，根据不同温度下的结合常数是根据他们的关系估计的(见7））： 在哪里和是温度下的结合常数和分别和是气体常数。

2．5．LDL内流J774A.1巨噬细胞

低密度脂蛋白(1 mg蛋白/mL)与10μG / ml氟代苯二氰酸酯（FITC）（从Pierce，USA购买）在室温下在黑暗中透析两次，每次透析1小时，并在4°C下抵抗碳酸盐缓冲液（pH9）再次过夜。去除多余的FITC。FITC缀合的LDL（LDL-FITC）用于细胞吸收研究。J774A.1巨噬细胞在37℃下用LDL-FITC孵育3小时，最终浓度为25 μg蛋白/mL，以20% (w/v) BSA富集的DMEM代替FCS。采用流式细胞仪测定LDL摄取[23.］．在488 nm氩气离子激光激发后，在510-540 nm处用荧光激活细胞分选(FACS) (FACSCalibur 4CA)测定细胞荧光。为了确定多酚(光蓟马定、儿茶素、槲皮素或紫金花素)对LDL内流的影响，将LDL- fitc与多酚共孵育15分钟，然后将其加入DMEM中3小时。

为了证实内流是通过LDL受体发生的，巨噬细胞与LDL- fitc同时孵育(25μ克蛋白质/ ml）和未标记的LDL（12，25，或50 μg蛋白/mL)产生竞争抑制。

2.6。共焦显微镜分析

巨噬细胞were incubated at 37°C for 3 h with LDL-FITC at a final concentration of 25 μ克蛋白质/ ml在2存在或不存在 μM Punicalagin，并在63倍放大率下使用Zeiss LSM 700共聚焦激光扫描显微镜观察。垂直堆叠穿过用488 nm激光在细胞-轴上生成图像，在1μ米的间隔。Axio观察者。使用Z1对图像进行处理。

2.7。统计分析

统计分析进行使用GraphPad Prism 5.01。学生的配对-检验比较两组的均数。每个实验至少分别重复3次，并始终以3个重复进行。结果以平均荧光强度(MFI)表示，显著性为（)或（)．

3.结果

3．1.色氨酸(Trp-)荧光猝灭

Punicalagin(计划1)和光甘草定与LDL颗粒及其ApoB100蛋白结合的可能性。数字1显示了ApoB100在不同浓度的punicalagin存在下的发射光谱(图1(一)）和光甘草定（图1 (b))和LDL在不同浓度的punicalagin存在下(图1 (c)）和光甘草定（图1 (d))在320-415 nm范围内，激发波长为290 nm ( K, pH 7). Both glabridin and punicalagin quenched the Trp-fluorescence of ApoB100 and LDL in a concentration-dependent manner. Other polyphenol antioxidants that were examined, such as catechin and quercetin, did not quench the Trp-fluorescence of ApoB100 or LDL (data not shown). The Stern-Volmer curve (与多酚浓度)，如图所示2，仅在测试浓度下用Apob100与Apob100相互作用的线性，表明静态或动态单型猝灭[24.］．

猝灭常数(）使用旁斑蛋白发起的apob100，使用（3.），是3.895×10^13.米⁻¹年代⁻¹，远远大于各种药物与蛋白质的最大扩散碰撞猝灭速率常数(2 × 10)^10.米⁻¹年代⁻¹)．这表明的ApoB-100由淬火punicalagin不是由动态碰撞但通过形成稳定的络合物发起[21.，24.］．然而，ApoB100-glabridin的相互作用以及与LDL颗粒的相互作用并不稳定，而是依赖于扩散，不能确定相互作用的结合参数(图)2)．

３．２．结合常数和结合位点

ApoB100与punicalagin的相互作用是静态猝灭的，事实是Stern-Volmer图没有显示出任何明显的线性偏离- 或者- 轴在所报告的punicalagin浓度（图2)和淬火常数价值（见（3.),部分2)．这些结果表明Apob100和PunicalAGIN之间的特定相互作用，并且可以确定结合参数。然而，Glabridin的Apob100和LDL荧光的猝灭涉及静态和动态淬火，所以通过船尾波特图偏离线性度朝向的事实证明轴，这表明一些部位不易接近[20.］．因此，光甘草定，相互作用的结合参数不能被确定。

对于静态猝灭和复合物形成，punicalagin和ApoB100之间的结合参数可以通过以下方法确定:4),部分2．的一块与， 在哪里为多酚浓度，用于确定结合常数()， 3.78 × 10⁶米⁻¹和结合位点的数量（)，接近于1，且不受pH和温度的显著影响。这些值表明在ApoB100中，punicalagin有一个高亲和力相互作用的单一结合位点(表1)1)．

3.3。热力学参数与自然的结合力的

采用(5)， (6)和(7），中科2．桌子1显示负值为正数和．这样的热力学结果表明，相互作用是自发的，主要是由熵驱动的[21.］．

3.4。LDL涌入J774A.1巨噬细胞

各种多酚对巨噬细胞LDL流入的影响如图所示3.．数字3(一个)结果表明，2μM punicalagin, LDL-FITC内流(细胞荧光强度)从36%增至88%。同样浓度的光甘草定对LDL内流无影响(从36.18%到36.09%)。有趣的是，只有punicalagin(紫色)影响LDL内流，与对照曲线(红色、黑色和棕色)相比，曲线移位显示了这一点。蓝色、绿色和浅蓝色的曲线没有偏移，分别代表光甘草定、槲皮素和儿茶素。值得注意的是，LDL流入巨噬细胞增加了2.5倍，平均荧光强度(MFI)从13到35(图)3 (b))，只在与2μm punicalagin，但不含细胞孵育的细胞。这种发现是出乎意料的，因为Glabridin和Punicaligin都以相同的浓度结合LDL颗粒。值得注意的是，在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)与巨噬细胞的培养下，巨噬细胞的内流不受punicalagin的影响(在没有和存在2的情况下，MFI值分别为15.06和16.66μM punicalagin职责)。这是因为，氧化低密度脂蛋白通过不同受体穿透巨噬细胞，称作“清道夫”受体（图3 (c))．PunicalAGIN增加LDL流入巨噬细胞的能力浓度依赖性。数字4(一)展示了2 μ4 . M punicalagin与LDL结合使细胞MFI增加60%μ黄芩苷使LDL内流增加80%。

接下来，我们试图通过LDL受体确定是否具体地发生LDL涌入。首先，将细胞与LDL和LDL-FITC同时孵育，以各种比率产生竞争。当将细胞与LDL孵育时（12 μG蛋白/ ml）+ LDL-FITC（25 μg蛋白/mL)，巨噬细胞MFI降低30%;当细胞与LDL- fitc浓度的两倍培养时，MFI降低≈45%(图)4 (b))．最后，垂直的图像LDL-FITC处理的两个巨噬细胞在2μ培养M punicalagin孵育。该图像证实LDL颗粒确实渗透并积聚在细胞细胞质中。在图中4 (c)，一个中央形象堆积显示在细胞核周围的细胞质中聚集了LDL-FITC颗粒。值得注意的是，在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)与巨噬细胞的培养下，巨噬细胞的内流不受punicalagin的影响(在没有和存在2的情况下，MFI值分别为15.06和16.66μM punicalagin职责)。这是因为oxLDL穿透巨噬细胞是通过一种不同的受体，称为“清道夫”受体。

4.讨论

膳食多酚存在于水果、蔬菜、坚果和茶中[25.］．摄入多酚的好处通常被认为是源于其抗氧化活性，这可能有助于预防疾病，如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病[26.，27.］．由于其抗氧化能力，紫红素具有抗动脉粥样硬化的作用。然而，它的作用机制有很多不确定性，因为punicalagin在血液中的浓度很难达到有效的抗氧化活性所需的水平(10-100μm）[15.］．最近的研究表明，多酚的细胞效应是由它们与特定的细胞内或血浆蛋白的相互作用介导的[28.］．例如，punicalagin与BSA相互作用[14.］．本研究旨在探讨紫斑金与ApoB100可能的相互作用及其生物学后果。

TRP-荧光技术已被广泛应用于蛋白质 - 药物相互作用的研究，因为TRP的发射光谱的变化可以响应配体结合或变性而看到[24.］．Apob100（和LDL）有37个TRP残留物[29.]和自然荧光猝灭均可用于测定其结合亲和力。光甘草定和黑斑苷结合LDL或ApoB100(无转移），而儿茶素和槲皮素没有（图1)．

类型的ApoB-100和punicalagin之间的相互作用，从他们的荧光猝灭光谱解释[24.]，发现是唯一的强大和稳定的一个。获得值表明Apob100中旁斑的单个结合位点（表1)．热力学参数表明，疏水部队在punicalagin-的ApoB-100的相互作用中起主要作用[21.］．

巨噬细胞是动脉粥样硬化的起始和进展的中心，可以是非常合适的治疗靶点。为了检测多酚与LDL颗粒相互作用的生物学后果，巨噬细胞在LDL- fitc溶液与每种多酚共孵育后，再与后者共孵育，以检测每种多酚对LDL内流的影响。同样，作为阴性对照，细胞首先与不含任何LDL的多酚孵育，洗涤以去除游离多余的多酚，然后与LDL- fitc溶液孵育，以检查单独的多酚对细胞(特别是细胞LDL受体)的可能影响。未观察到对细胞或LDL内流的影响。补充图(可在网上获得的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7124251）所示的是，所研究的细胞与LDL / LDL-FITC进行3小时的孵育后，没有形成泡沫细胞是明显的。这些细胞并没有改变其形态，即使LDL / LDL-FITC培养16小时后。我们可以得出结论，在本实验条件下，随着LDL引线punicalagin具体地涉及LDL涌入到的巨噬细胞，而不将其转化成泡沫细胞的相互作用。

这一结果突出了多酚和蛋白质相互作用的特异性结果(在与2μ同样浓度的光甘草定对LDL内流没有影响3 (b)））和LDL涌入该punicalagin感应处于浓度依赖的方式（图3 (c))．

巨噬细胞是吞噬细胞碎片和病原体的细胞。我们感兴趣的是证实LDL内流是通过LDL受体特异性发生的，巨噬细胞不会通过非特异性的内吞作用作为防御活动的一部分来吸收这些颗粒。FITC试剂以与LDL-FITC相同的程序与BSA结合(LDL-FITC没有已知受体)，结果表明，与punicalagin孵育后，BSA没有流入细胞(图)3 (b))．在另一个实验中，是通过将与LDL和LDL-FITC同时巨噬细胞产生的用于LDL受体的竞争。在1/1的比例与LDL-FITC添加LDL导致LDL-FITC流入减少了30％。增加LDL的LDL到-FITC的比率至2/1导致LDL-FITC流入减少了45％（图4 (b))．这些结果验证了LDL流入通过LDL受体发生的假设。

我们假设punicalagin与ApoB100紧密结合在LDL受体结合位点附近。结合后，punicalagin改变了蛋白质的构象，可能增加了LDL对LDL受体的亲和力。同样，ApoB100在LDL颗粒表面的构象可能取决于核心脂质的组成、表面磷脂含量和LDL颗粒的直径[30.］．因此，punicalagin可能与LDL颗粒的脂质部分和蛋白质相互作用，从而诱导LDL流入巨噬细胞。最后,一个垂直堆巨噬细胞细胞确认了细胞中的LDL渗透和积聚（图4 (c))．

由于低密度脂蛋白流入肝细胞可能导致脂肪肝[31.]，LDL吸收到在2存在或不存在的肝细胞 μ同时也检测了紫红蛋白(数据未显示)。与巨噬细胞不同，LDL流入肝细胞(hepG2)时，当细胞暴露于类似的LDL浓度时，不受紫红蛋白的影响。

值得注意的是，摄入石榴汁或提取物后的石榴红素在血液中的浓度并不高[15.］．它主要通过小肠水解代谢为鞣花酸，并随时间推移由肠道细菌代谢为循环尿石[32.］．因此，优先的瞳孔治疗瞳孔不应是口服，而是静脉内的。本文提出的结果是收集的在体外实验。我们现在正在检查体内punicalagin效果，使用皮下植入渗透迷你泵。小鼠血清脂蛋白参数将在28天的暴露punicalagin确定。

这项研究表明，punicalagin结合到的ApoB-100及LDL疏水性网站，这可能会改变LDL的结合蛋白，的ApoB-100的构象，并增强其对LDL受体的亲和力。LDL流入被诱导和胆固醇在巨噬细胞的聚集而不泡沫细胞形成。在以后的研究中，punicalagin对HDL对来自这些细胞的去除过量胆固醇至肝脏能力的影响将探讨，以确定由punicalagin降低胆固醇血液浓度如在文献中报道的机制[4，5，8，并能减缓动脉粥样硬化的发生。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

补充材料

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