文摘
低氧环境的分子机制导致肠粘膜屏障损伤(IMB)被广泛知晓。为了解决这个问题,汉族人从高海拔100米的高度和藏人(超过3650)招募了。组织学和转录组分析。结果显示肠道绒毛被减少,出现不规则,海事局和腺上皮被摧毁的藏族与汉族相比。转录组分析显示2573个基因表达水平改变了。1137个基因的水平增加,1436个基因在藏族与汉族相比下降。基因本体论(去)分析表明大多数免疫反应降低海事局的藏族与汉族相比。基因微阵列显示有25 - 22,对生长因子receptor-bound差别和18倍对这些蛋白2 (GRB2)、表皮生长因子受体(EGFR)和酪氨酸受体磷酸酶nonreceptor类型11 (PTPN11)海事局的藏族与汉族相比。表皮生长因子受体的差别,对这些GRB2, PTPN11将减少活性氧的产生和防止氧化应激损伤肠。因此,转录组分析显示IMB病人的保护功能对低氧诱导氧化损伤肠的藏人通过影响GRB2 /表皮生长因子受体/ PTPN11通路。
1。介绍
肠道粘膜更容易损坏,如果这个人是生活在海拔3000米以上。动物实验表明,高海拔缺氧诱导肠粘膜屏障受损(IMB) (1,2]。消化系统疾病的发病率据报道增加的居民住在高海拔环境(3]。受损IMB威胁到居民生活在高处。治疗受损海事局复杂。机制的主要问题是高海拔诱导IMB受伤仍然广泛的未知,没有实用的治疗方法可以使用。
肠道是一个重要的障碍防止细菌移位和内毒素进入人体器官。众所周知,肠道粘膜损伤可能会降低海事局的功能。最重要的氧气水平的变化在生活环境中,比如normobaric normoxia低比重的缺氧陆地海拔(3450米),将导致增加活性氧(ROS)当prooxidant之间的平衡和抗氧化活性受损后接触地面低比重的缺氧(4]。ROS慢性肠道炎症性疾病中起着重要的作用生产增加内皮的通透性和炎症的粘膜和允许渗透白细胞进入肠道。清除ROS有益于肠道疾病(5]。大多数藏人生活在高海拔高原低氧环境(6]。在环境中,许多组织产生活性氧,可能出现缺氧的条件下7]。另一方面,据报道,高层活性氧诱发肠细胞凋亡(8]。因此,它几乎像是ROS水平异常的肠道粘膜屏障的藏人。ROS是众所周知的与氧化应激有关(9- - - - - -12)通过破坏脂质、蛋白质和DNA (13]。氧化应激是一个重要的贡献者血管细胞的损伤(14和缺氧/复氧损伤的发病机制15]。肠道氧化压力也是一个主要因素导致肠道损伤,导致内毒素易位(16]。肠道屏障功能障碍已经被报道与高层肠道有关氧化应激(17]。高海拔经常诱发氧化应激影响生化代谢,如脂质代谢障碍(10]。因此,IMB受损的人生活在高海拔可能与改变控制氧化应激。
氧化应激引起的损伤肠组织通过多种信号通路。例如,增加氧化应激诱发男性Sprague-Dawley老鼠的小肠损伤的途径通过激活p38增殖蛋白激酶(18]。另一个例子,缺血/再灌注导致氧化损伤动物的肠道。枣树多糖表现出良好的酶活性和改善小肠受伤的兔子与缺血/再灌注(19]。然而,大多数实验已经完成了对氧化应激损伤肠动物和分子机制仍不清楚低比重的缺氧促进肠屏障功能障碍的居民在高海拔。此外,低比重的缺氧导致的分子机制受损的肠道屏障功能障碍和发展IMB仍然未知。
氧化应激的肠道损伤可能与许多信号通路有关。是不可能解决这些复杂的问题用一个信号通路。转录组已被广泛用于探索相关通路在人类各种疾病(20.- - - - - -22]。全面了解缺氧的影响在海事局居民在高海拔,转录组实验进行。这些使用DNA微阵列基因表达的差异进行了分析。工作将为缺氧诱导受损海事局提供重要信息的病人在高海拔和基本知识导致海事局的受伤。肠粘膜的基因表达谱的藏人在高海拔超过3650米,汉族在100米的高度进行了分析调查潜在的分子参与的病理生理学IMB由缺氧造成的损害环境。数据库基因本体论(去)或《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)是指预测基因涉及重要功能和信号转导。同时,我们观察到的微观结构肠粘膜的藏人在高海拔和从平原地区汉族正常和电子显微镜。
2。材料和方法
2.1。材料
试剂盒试剂购自生活技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。所有由豆类引物合成生物技术(大连)有限公司有限公司(中国大连)。互补脱氧核糖核酸逆转录工具包和豆类生物SYBR预混料交货Taq来自豆类。苏木精和伊红())染料都购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.2。参与者
本研究中所有的协议被人类研究伦理委员会特别批准从西藏人民医院(中国西藏)。所有实验都是符合世界医学协会赫尔辛基宣言》关于道德行为涉及人体受试者的研究。从2013年6月和2013年8月,3从平原地区汉族招募在广州第一人民医院(广州),和3藏人在高海拔超过3650米招募从西藏人民医院(中国西藏)。每个病人有类似的参数一个健康的参与者在性别、出生地,工作强度,等等。研究对象是本土藏人在拉萨降价的时代。每个参与者将肠道粘膜前签署知情同意书。
2.3。样本提取
粘膜活检的拍摄在西藏人民医院(中国西藏)和广州第一人民医院(广州),分别。六个肠活检得到海事局的藏人在高海拔超过3650米作为实验组和10汉族在100米高度作为对照组。所有的参与者都突显出正常黏膜。样本使用液态氮冷冻,保存在−80°C。
2.4。扫描电子显微镜的观察肠粘膜
乙状结肠粘膜标本得到从所有参与者在结肠镜检查。20个样本用于现在的工作。样本用福尔马林固定。十毫米的样本清洗和使用四氧化锇固定。所有的模块都是为随后的组织学分析。三十部分是由一个街区,脱蜡,干,涂用金钯真空蒸发器。最终样品的微观结构由范广达400扫描电子显微镜观察(范公司晚宴过后,或者,美国)。
2.5。组织学分析
所有肠道样本与生理盐水冲洗,固定在百分之十甲醛在4°C一天,并与PBS洗。四个处理样品μm物种和染色使用)染色(苏木精和伊红)。在显微镜下观察样品的微观结构。绒毛的数量在一个视觉计算。海事局评估双盲。粘膜受伤如果肠道表面不连续,腺体扩张,或表面的细胞受损12]。
2.6。RNA提取
肠道10藏族和汉族的样本收集。所有样品都消化在三毫升试剂盒使用homomixer和地面。收集的氯仿添加,rna的乙醇。最后RNA样本resuspended缓冲区十毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0,一个mM EDTA。RNA的数量验证NanoDrop 1000分光光度计V3.7 (NanoDrop Technologies, Inc .威尔明顿,德)。
2.7。核糖核酸微阵列
基因组低聚糖微阵列代表了基因和转录,这是由基因组测序。微RNA逆转录后往往被视为互补脱氧核糖核酸数据库。所有的序列都从六个参与者(3汉族和藏族)和校准验证了这些序列从所有已知的信使rna序列。
2.8。核糖核酸扩增、标记和杂化与安捷伦芯片
样品标签和杂交进行基于基因表达芯片的协议。所有的rna被Cy3-UTP增加,标志着。cRNAs活动和数量被确定使用NanoDrop 1000分光光度计V3.7 (NanoDrop技术,Inc .威尔明顿DE)。一个μg标记cRNAs中断,然后孵化60°C在半小时内。随后,cRNA被通用电气杂交缓冲稀释。核糖核酸微阵列被增加100组装μL杂化解决方案。最后的样本加热在65°C和测量使用安捷伦芯片扫描仪。
我们使用软件安捷伦特征提取来评估所有最终的数据。度(不同表达基因)证实了火山的阴谋。层序聚类分析是由安捷伦GeneSpring GX的软件。分析了信号转导和浓缩在微阵列进行了计算。
2.9。浓缩的分析基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)
工作提供了控制词汇来表示度函数。有3部分:生物处理(BP)、电池组件(CC)和分子功能(MF)。值显示的丰富度。如果有显著统计学差异。缓解分数,费舍尔的值,或者hypergeometer礼物的意义相关的通路。
2.10。实时定量PCR(存在)
进一步确认以上核糖核酸微阵列数据,存在被用来分析前度10个汉族在100米的高度和10个藏人在高海拔3480米以上,包括表皮生长因子受体(EGFR),生长因子receptor-bound蛋白2 (GRB2),酪氨酸受体磷酸酶nonreceptor类型11 (PTPN11)。上面的rna提取使用肠道粘膜的试剂盒。五μ使用反转录试剂盒g RNA是相对地转录。所有的引物都得到如表2显示,存在由SYBR®绿色rt - PCR设备实时PCR系统。放大的情况给出了如下:94°C 5分钟,45个周期95°C的20年代,30年代65°C, 40年代的65°C。
2.11。免疫印迹分析
兔子反多克隆表皮生长因子受体抗体(猫。ab2430数量)、兔反多克隆抗体GRB2 (ab32037),兔子反人类单克隆抗体PTPN11(猫。ab32083数量),兔子反beta-actin抗体(猫。ab8227)和山羊anti-rabbit合(免疫球蛋白g h和l)(猫。ab6721数量)从Abcam上海办事处购买发射(上海,中国)。肠道采集标本从所有参与者使用内窥镜技术的无创性方法。所有组织都是地面使用无菌研钵和研杵。收集样品蛋白,离心分离,sds - page然后electrophoretically转移到PVNF膜。挡住了膜后free-fat牛奶,然后他们被孵化主要抗体。成员被洗了三次和孵化HRP-linked二级抗体。 The protein expression level was normalized by beta-actin expression. The immunoreactive result was visualized by using an enhanced chemiluminescence system (Amersham Pharmacia Biotech, Stockholm, Sweden).
2.12。对人类染色体的位置度
度对人类染色体的位置标记在人类染色体利用RNA微阵列的数据结果。信使RNA表达谱分析在基因组层面使用上面的结果。24日约400显著不同的基因表达标记人类染色体。褶皱的变化都标有不同的颜色。
2.13。数据分析
所有数据显示使用平均值±道。一个方差分析分析比较不同群体之间的差异,验证了统计意义。如果有显著统计学差异。
2.14。基于微阵列数据的基因网络的建设
显著差异表达的基因微阵列数据。软件被用来检索字符串相互作用的基因(http://string-db.org/)。,或从微阵列表达下调的基因在这个网络可视化。根据实验结果和计算预测,信心得分是用来证实microrna之间的交互和度。信心得分> 0.5被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。基线特征的参与者
基线和物理特征研究的人口是列在表中1。为生活高度的分布有显著差异(),但多年来在他们的位置(没有区别藏族人和汉族人之间)。相比之下,没有发现显著差异,其他参数包括年龄、吸烟、饮酒、体重指数(、表1)。相比之下,对Hb和舒张期压力有显著差异(、表1)。血氧饱和度较低的居民的水平比在低海拔从高海拔(在藏人),尽管心率高于汉族。
3.2。Hematoxylin-Eosin染色分析肠道组织
Hematoxylin-eosin染色结果表明圆柱状的和杯细胞大多是毁在藏人(图箭头表示1(一)),圆柱状的汉族和杯细胞正常结构(图1 (b))。有更多的毛细管在肠黏膜微血管腔比汉族地区的藏民(图1 (c)),而没有更多的毛细管在肠黏膜微血管腔地区汉族(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。扫描电子显微镜(SEM)分析肠道粘膜
从空肠肠粘膜的SEM图所示2,揭示肠道组织的基本特征。肠道症状的特点被认为在这些标本。Electromicroscopy表明,西藏人肠道粘膜损伤而汉族正常肠道粘膜。肠道绒毛通常是减少,出现不规则海事局的藏民(图2(一个)),而肠道绒毛通常是富裕和常规形式的国际海事局汉族(图2 (b))。腺上皮被毁海事局的藏民(图2 (c)),而腺上皮在罚款汉族的国际海事局(图的情况2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。筛选差异表达基因
层序聚类分析进行如图3说明了这一点。三个汉族和三个高空藏人显示不同的基因表达模式。1237年的水平,1336个基因表达增加减少肠道组织从藏族与汉族相比。有25 - 22 -,GRB2,差别18倍对这些表皮生长因子受体,PTPN11 IMB从藏族与汉族相比。
3.5。中存在
我们测量了水平的三个显著改变使用实时PCR基因。GRB2、表皮生长因子受体和PTPN11有类似的表达概况与获得的RNA转录组分析。GRB2、表皮生长因子受体和PTPN11超过20倍下调在藏人比较汉族()(图4)。结果显示类似的变化趋势,从微阵列分析,而他们的基准字符也类似患者分析微阵列方法(表1)。
3.6。蛋白质的表达GRB2、表皮生长因子受体和PTPN11
GRB2的蛋白质含量、表皮生长因子受体和PTPN11有相似的变化趋势与获得中存在的分析。GRB2、表皮生长因子受体和PTPN11明显下调在藏人比较汉族()(图5)。结果显示类似的变化趋势与微阵列分析。
3.7。度的全面Peptidome剖析
度都是使用由peptidome分析方面去分析解释。中的所有事件阐明肠道粘膜海事局的藏人相比,汉族。去,调节DE基因参与活性氧的活动,氧离子和过氧化物,脂质过氧化作用等;表达下调的基因参与的减少免疫能力。所有的改变都可以由氧化应激引起的,比如癌症抑制(23),细胞正常功能(24),特殊响应病原体(25),最大的行动,和抗原表达26)(图6)。路径分析显示,在肠粘膜组织的参与者从高海拔,许多通路基因异常表达,也可能与氧化应激有关,尤其是在炎症性肠病(27,28),髓过氧化物酶(29日],ROS生产[10),凋亡细胞死亡(30.),组织损伤(31日],interleukin-1 [32氧化修饰[],33),囊性纤维化34),自然杀伤细胞活性(35),淋巴细胞(36),纤维蛋白溶解(37等等(图7)。
(一)团体去调节DE gene-BP方面
(b)团体去DE gene-BP表达下调
(一)团体通路的调节基因
(b)团体表达下调基因的途径
3.8。集群的不同表达基因在人类染色体
就像图8显示,四百度映射使用人类染色体上。基因表达的不同染色体上13、14、15、18、20、21、22岁,和Y度位置较少参与活性氧的活动。度的高密度聚集在染色体1、6、7、11、14、17、19。基因表达的最重要的是有超过10倍都位于三个不同的染色体:表皮生长因子受体(EGFR),染色体7 p12.3-p12.1;生长因子receptor-bound蛋白2 (GRB2), 17号染色体q24-q25;和酪氨酸受体磷酸酶nonreceptor 11型(PTPN11), 12号染色体q22-qter(图8)。
3.9。通过使用度网络的可视化微阵列数据
微阵列数据主要显示和表达下调基因和可视化网络上(图9),主要是在有趣的蛋白质氧化压力的保护功能和表达了藏族和汉族之间显著不同。在网络上,基因表达下调是显示为绿色的圆圈和基因调节显示为红圈(图9)。在藏人,三个主要与GRB2相关信号通路,表皮生长因子受体,PTPN11显示网络上与汉族相比显著下调(图9)。
4所示。讨论
许多因素可以导致肠道粘膜的损伤和缺氧是一个重要的风险引起肠道组织的损伤1,38- - - - - -42]。首先,低氧压力影响的基本代谢过程(43),导致许多生物功能的变化。其次,hypoxia-caused碳酸酐酶,这是一种酸性微环境(44),居民在高海拔是有害的。第三,缺氧环境扰乱居民在高海拔的肠道菌群失衡导致肠道损伤(45]。低比重的缺氧会抑制免疫球蛋白的分泌,这是一个重要的几种分子在肠46,47]。此外,低比重的缺氧也抑制胆汁分泌和减少肝肠循环,导致肠道功能障碍和细菌overproliferation和增加肠道生物屏障的破坏48]。尤其是第一点,低氧压力影响基本代谢过程和高层ROS产生,导致氧化应激的增加(49,50]。氧化应激是组织损伤的一个重要因素,包括肠损伤(18,51]。
智人基因组低聚糖微阵列有最著名的人类基因。所有数据可以用明确的功能而足智多谋的序列(52- - - - - -54]。我们用数据来探索肠组织的表达概要文件从藏人在高海拔。与此同时,数据与汉族相比使用基因微阵列分析了平原地区,1137度增加,而1436度降低有超过两倍的藏人的变化。基于这些数据,然后我们研究了差异表达基因的功能。我们的研究结果表明,IMB包括氧化剂反应。
目前研究结果表明GRB2 /表皮生长因子受体/ PTPN11-associated通路显著下调(折叠变化= 25,22日和18)。在以前的研究报道,GRB2有关活性和氧化产品的形成(55,56]。ROS是直接参与胃肠损伤。高浓度的活性氧在肠道粘膜可能减少粘膜organ-protective功效。许多因素,如肠道的食物,更容易破坏粘膜结构当肠道粘膜处于脆弱的状态(57]。与此同时,ROS增加小肠上皮细胞的通透性,导致肠道粘膜损伤在早期阶段(58]。
GRB2可以显著减少脂肪积累的抑制,提高葡萄糖代谢,改善氧化应激(55),并激活增殖蛋白激酶通路(59]。此外,灭活caspase-3 GRB2缺陷减少细胞凋亡。减少GRB2改善肝脂肪变性和葡萄糖代谢,减少氧化应激。所有这些活动将改善肠道损伤引起的低氧诱导氧化应激。
尽管在肠道上皮细胞表皮生长因子受体的重要作用[60),研究表皮生长因子受体在肠道损伤的影响非常有限。根据以前的报告,表皮生长因子受体的过度增加活性氧的水平,DNA链损伤累积到一定程度,并使基因组不稳定。表皮生长因子受体的激活与氧化应激相关的水平(61年]。因此,失活的EGFR通路将减少ROS水平,减少氧化应激。EGFR通路差别的对这些将改善肠道损伤的保护作用。
PTPN11通路的作用很少报道肠组织。从网络,PTPN11木菠萝和STAT信号通路密切相关(图9),它由蛋白质酪氨酸激酶和磷酸酶活性,和响应各种细胞因子在调节细胞活动是必要的。JAK和STAT通路的失调会导致造血和免疫疾病。在木菠萝PTPN11中扮演一个重要的监管作用,STAT信号通路(62年]。JAK2和STAT通路已报告在细胞保护和损伤。JAK2抑制剂和超表达的显性负JAK2蛋白改善内皮细胞对抗过氧化和超氧化物阴离子。失活的JAK2已被证明是一个潜在的方法对氧化压力诱导内皮细胞死亡(63年]。Parthenolide报道抑制JAK1和STAT3活动。ROS产品将抑制STAT3信号通路通过瞄准JAK1 [64年]。从网络,PTPN11可以调节木菠萝和STAT通路,其抑制作用将有助于防止oxidative-induced损伤肠的藏人。另一方面,也为PTPN11不同的报告。功能获得突变的PTPN11造血细胞细胞因子引起的超敏反应增强活性氧的水平。PTPN11突变将改善线粒体有氧代谢与一个新的分子通过交互。PTPN11突变的治疗效益通过改善抗氧化活动(65年]。
一个问题应该在这里。有1336个基因表达下调,但只有三个表达下调基因GRB2 /表皮生长因子受体/ PTPN11被选中。三个top-changed基因进行分析,因为所有人都超过20倍下调表达下调而左小于10倍。此外,与活性氧的生产相关的三个基因被关闭。ROS的生成是由GRB2严格监管在结直肠肿瘤发生[56]。ROS生产将有利于表皮生长因子受体激活(66年]。有条件地删除等位基因PTPN11将导致降低ROS水平(67年]。因此,这项工作的三个基因进行了分析。
从上面的结果,很容易发现这三个途径对控制ROS水平也有类似的功能和抑制oxidative-induced损伤人体组织或细胞。此外,我们的网络还显示GRB2之间的密切关系,表皮生长因子受体,PTPN11通路(图9),这与先前的报道是一致的(68年,69年除了PTPN11通路。需要进一步研究来证实三通路之间的具体关系。
本研究有一定的局限性:(1)我们只从每个小组招募了一些参与者(生活在海拔比)。这不是远程的代表更大的人口居住在这个地区。避免造成的偏差值小样本大小,结果证实了使用中存在10个汉族在100米的高度和10个藏人在高海拔超过3480米,是稳定相比与微阵列分析(图4)。(2)目前的结果只反映一个方面的差异研究中指出。还有其他的分子机制存在,如藏族和汉族表型差异或完全不同的生活方式。这将是更多的有关研究同一个人从平原到西藏,反之亦然。为了解决这个问题,我们尝试多次这样的工作,总是最后失败了。的主要原因是由于这样的事实,大多数人从普通不能在高海拔的地方呆得更久。此外,减少干扰,生活方式(类似的日常活动,食物的卡路里摄入量,等等)和职业(办公室人员)团体之间是相似的。实际上,藏族和汉族人群差异小于3000年70年),这表明大部分基因是稳定的。
5。结论
现在发现是通过比较基因表达谱从高海拔和平原地区的参与者,提供这个条件的分子发病机制的线索。全基因组转录分析表明,低氧诱导氧化应激导致的藏人通过抑制肠道损伤GRB2 /表皮生长因子受体/ PTPN11通路。分子机制的研究提供了重要的信息导致IMB损伤在高海拔和后续的验证和功能基因研究奠定了基础。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
所有作者设计和解释本研究和分析数据,并回顾了全文。李康进行实验和写论文。李康和Luobu Gesang同样导致了工作。
确认
目前颁发的工作是国家“十二五”科技计划的支持,中国(2013 bai05b04),广东省自然科学基金,中国(2014 a030313679),关键在西藏自治区自然科学基金项目,中国(2012年)。