文摘gydF4y2Ba

除了细胞的动力源泉,也含有线粒体细胞死亡机制,包括高度管制过程,如膜通透性转换孔(PTP)和活性氧(ROS)的生产。在这种背景下,本文提供的结果提供的证据表明,肝脏线粒体分离gydF4y2BaGracilinanus microtarsusgydF4y2Ba一个小和短寿命(一年)有袋类动物,老鼠相比,更容易受到PTP开放与一个贫穷的NADPH相关的抗氧化能力。有袋类动物的肝脏线粒体分离耦合和占用gydF4y2Ba但表现出低得多gydF4y2Ba保留能力比鼠标线粒体。虽然已知PTP抑制剂环孢菌素A、ADP和ATP显著增加的有袋类动物线粒体保留的能力gydF4y2Ba老鼠,它们的影响是更大的比有袋类动物线粒体。荧光和高效液相色谱法分析线粒体烟酰胺核苷酸还原显示内容和状态(主要是NADPH)较低的有袋类动物线粒体比小鼠线粒体尽管谷胱甘肽过氧化物酶的活动相似/还原酶系统。总的来说,这些数据表明,PTP开放过程是一个重要的事件gydF4y2Ba细胞死亡信号由线粒体氧化还原失衡gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

证实CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}调节许多重要过程通过瞬态的增加其免费浓度在不同的细胞箱内(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。这包括几个能量代谢通路,突触传递、基因表达和细胞生存或死亡(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为了满足这些生理角色CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}运动在等离子体细胞膜是直接或间接由ATP水解;因此,细胞ATP供应流程缺陷可能导致失调在CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}暗示可能会影响细胞的正常生理功能(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。关于生存或死亡的机制,提供了证据,intramitochondrial CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}的控制信号(i)的氧化磷酸化,所需细胞的功能(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),和(2)活性氧生成,需要生存和死亡(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。的确,现在人们普遍认为,超氧化物以及其他活性氧(ROS)可以功能有益或不利gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在生理水平逐步提高他们可能先后调节细胞增殖和分化等过程,激活自适应程序如抗氧化基因和转录upregulation,上级,他们可能意味着衰老和调节细胞死亡gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。直接的破坏性影响自由基可能只发生在极端条件下(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。除了生理过程,似乎线粒体氧化应激负责开发和发展的一系列疾病如癌症、糖尿病、炎症性疾病、高血压、神经退行性和ischemia-related疾病和衰老gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在这种背景下,一个事件可能通过线粒体途径参与这些过程的细胞死亡,细胞凋亡或坏死,是所谓的线粒体膜通透性转换(MPT) [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

MPT状态的特点是特异性的内膜的开放孔隙引起高矩阵[Ca的结合gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和氧化应激gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。考虑如何Ca的理解gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和活性氧协同作用的过程中渗透过渡孔(PTP)打开,提供的证据表明线粒体更容易MPT当他们的抗氧化系统,主要由NADPH表示,是疲惫gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。事实上,可以诱导MPT prooxidants和预防甚至逆转抗氧化剂gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

完全上述因素表明,线粒体是多功能控制生产ATP细胞器,参与细胞内CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}体内平衡,作为活性氧的主要来源。因此,它可能是合理的考虑,这些重要的线粒体基因变异和障碍,在任何属性可能本质上修改对许多疾病的易感性和老化gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。在这方面,巴西纤弱的负鼠(gydF4y2BaGracilinanus microtarsusgydF4y2Ba)是一个短寿命有高死亡率与高水平的压力由于攻击性行为在交配期间(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba有一个最不寻常的和非凡的生殖模式,大多数的男性死亡第一交配期后,一个条件称为部分semelparity进化生态学(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。现有证据表明,再生产的成本是有害的的生存gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba相关的,可以想象这个物种寿命很短。gydF4y2Ba

当前工作的目的,首先,分析线粒体分离肝线粒体的生物能学gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba,考虑到这些细胞器的可能作用寿命的关键球员的监管这袋,其次,以验证是否MPT在这个过程中扮演任何角色。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。化学物质gydF4y2Ba

大部分来源于Sigma-Aldrich使用的试剂。钙Green-5N hexapotassium盐从英杰公司购买(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。gydF4y2Ba

2.2。动物gydF4y2Ba

C57BL / 6 / JUnib老鼠提供的坎皮纳斯大学多学科生物研究中心的实验室动物(CEMIB /由、坎皮纳斯、巴西)。C57BL / 6小鼠/ JUnib substrain不携带突变的烟酰胺核苷酸transhydrogenase (gydF4y2Ba例数十分gydF4y2Ba)基因gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)影响其他C57BL / 6小鼠的线粒体功能substrains [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba例数十分gydF4y2Ba是一种守恒的基因存在于有袋动物(gydF4y2Ba把gydF4y2Ba,基因身份证:100012732)。标准的实验室条件下饲养的老鼠(20 - 22°C和12 h / 12 h光/暗周期)与自由访问标准饮食(Labina /上贴,坎皮纳斯、SP、巴西)和自来水。虽然老鼠过去遥远的有袋动物,鼠标功能类似的体型gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba特征明显,是一种最物种的线粒体生物能疗法。gydF4y2Ba

有袋动物(gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba)被抓获的直辖市Americo Brasiliense,gydF4y2BacagydF4y2Ba西北300公里的巴西圣保罗东南部(收集许可证数量从巴西研究所的环境(环保局):SISBIO # 36133)。在位置由森林植被的残余塞拉多表现为致密semideciduous森林林冠覆盖不同从50 - 90%,树米8 - 15日,和小草本植被。该地区的气候有两个定义良好的季节:一个温暖潮湿的季节从10月至3月,从4月到9月一个凉爽的季节。陷阱是连续四个晚上每个月从2012年2月到11月。动物被使用了gydF4y2Ba捕获网格与88年相隔10米的诱捕站。一个谢尔曼住陷阱(gydF4y2Ba厘米)被设置在每个捕获站在树上gydF4y2BacagydF4y2Ba1.75地上和饵香蕉、花生酱和鱼肝油。gydF4y2Ba

有袋动物(gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba)返回到Estadual德坎皮纳斯大学(由)和位于单独的笼子里的动物房间保持在大约23°C和12 h / 12 h光/暗周期。有袋动物被提供gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba水和食物的拨款金额(干猫和狗粮和芒果)维持体重增加类似于预期在自然条件下。个人被关在这种动物的空间大约3个月前开始实验。gydF4y2Ba

使用实验协议经当地伦理委员会批准在动物研究(CEUA-UNICAMP)。动物实验指南后发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH出版85 - 23,1996年修订)。gydF4y2Ba

2.3。隔离肝线粒体gydF4y2Ba

肝脏线粒体被差速离心分离与此同时从老鼠和袋鼠(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba不连续Percoll梯度)和部分纯化。雄性动物被用于所有实验除了量化线粒体NAD (P)的内容。动物被斩首,肝脏被迅速删除,切碎,和均质冰冷的绝缘介质包含250毫米蔗糖,1毫米EGTA, 10毫米消息灵通的缓冲区(pH值7.2)。匀浆是离心10分钟800gydF4y2BaggydF4y2Ba。上层清液离心机在7750gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。线粒体颗粒纯化使用不连续Percoll梯度根据Lopez-Mediavilla et al。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。离心10分钟后在7750年gydF4y2BaggydF4y2Ba,线粒体分数从接口获得19 - 52% Percoll层resuspended在缓冲区包含250毫米蔗糖,EGTA 0.3毫米,10毫米消息灵通的缓冲区(pH值7.2)和recentrifuged享年7750岁gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。最后的颗粒含有肝线粒体是resuspended EGTA-free缓冲区在近似蛋白质浓度的50毫克/毫升。整个过程是在4°C。线粒体蛋白质含量的悬浮体是由缩二脲测定的0.2%脱氧胆酸盐gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)与牛血清白蛋白标准。gydF4y2Ba

2.4。标准孵化程序gydF4y2Ba

线粒体氧消耗的测量,膜电位,CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}吸收、氧化还原状态的内生烟酰胺核苷酸,谷胱甘肽过氧化物酶的活性在28°C / redutase系统进行连续磁搅拌在一个标准的反应介质包含125毫米蔗糖,65毫米氯化钾,KH 2毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba1毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba10毫米,消息灵通的缓冲区(pH值7.2),和~ 15gydF4y2BaμgydF4y2BaM污染物CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}。其他补充表示在图中传说。除了阿gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba消费测量,执行1.4毫升室,2毫升最终成交量在试管实验,进行使用。gydF4y2Ba

2.5。耗氧量测量gydF4y2Ba

耗氧量的线粒体(0.5毫克/毫升)在一个温度测量室配有电磁搅拌器控制,使用Clark-type电极(黄色的春天仪器公司,黄色的春天,哦,美国)包含0.3毫米EGTA标准反应介质和NADH-linked基质混合物(2 mM苹果酸,1毫米丙酮酸,1毫米gydF4y2BaαgydF4y2Ba酮戊二酸和谷氨酸1毫米)。gydF4y2Ba

2.6。跨膜电势的测量gydF4y2Ba

线粒体膜电位变化后被监控5gydF4y2BaμgydF4y2BaM碱性藏红荧光(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),记录在日立f - 4500荧光谱仪操作在激发和发射波长的495和586海里,分别与狭缝宽度5海里。gydF4y2Ba

2.7。线粒体钙的测量gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留能力gydF4y2Ba

CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留能力确定肝脏线粒体(0.5毫克/毫升)孵化包含0.2标准的反应介质gydF4y2BaμgydF4y2Ba米钙Green-5N探针。外部自由Ca的水平gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}测量通过记录上的荧光钙Green-5N荧光谱仪(日立f - 4500)操作在激发和发射波长的506和532海里,分别与狭缝宽度5 nm和连续磁搅拌。五分钟后的线粒体(0.5毫克/毫升)试管,丸的5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米(控制条件)或30gydF4y2BaμgydF4y2Ba(当环孢菌素、ADP或ATP +毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}是CaCl存在)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba是按顺序添加每2.5分钟直到线粒体开始释放Ca吗gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}介质。CaCl的数量gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba线粒体Ca之前添加gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}线粒体钙释放了gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留能力,之间的定量方法比较MPT组。gydF4y2Ba

2.8。测定NAD (P)在完整的线粒体氧化还原状态gydF4y2Ba

氧化还原状态的变化烟酰胺核苷酸(NAD (P))线粒体悬浮液(0.5毫克/毫升)在标准反应介质与300年补充gydF4y2BaμgydF4y2BaM EGTA, 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米鱼藤酮、5毫米琥珀酸在荧光谱仪监测(日立f - 4500)使用的激发和发射波长366 - 450纳米,分别和狭缝宽度5海里gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。值得注意的是,只有NAD (P)的形式表现出很强的内源性荧光信号。作为参考,大量的NADPH被添加到反应介质在缺乏线粒体。琥珀酸被选中作为一个激励衬底允许内源性底物的内容,这显然是不同的物种之间,扮演一个角色的新陈代谢叔丁基氢过氧化物(gydF4y2Ba-BOOH),一个用于挑战线粒体的过氧化外生抗氧化系统。gydF4y2Ba

2.9。线粒体谷胱甘肽过氧化物酶的活性/还原酶系统gydF4y2Ba

肝脏线粒体(1毫克/毫升)是细胞溶解的存在0.1% Triton x - 100标准中包含500反应gydF4y2BaμgydF4y2Ba谷胱甘肽和100gydF4y2BaμgydF4y2BaM NADPH。线粒体谷胱甘肽过氧化物酶的活动/还原酶系统被NADPH氧化后的速度估计的0.5毫米叔丁基氢过氧化物(gydF4y2Ba-BOOH;一个氧化剂代理)gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。NADPH氧化之后,监控的荧光激发和发射波长的366和450海里,分别和狭缝的宽度5海里。在这个试验,添加谷胱甘肽循环被认为两个氧化还原酶消耗NADPH的作用,从而揭示了最大通量这酶系统。gydF4y2Ba

2.10。烟酰胺核苷酸Transhydrogenase(例数十分)测定gydF4y2Ba

例数十分是化验前进行在我们实验室gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。简单地说,微分吸光度的变化(375 - 425 nm)由于减少APAD,河畔gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba模拟,在监测5分钟37°C(日本岛津公司uv - 1800分光光度计,京都,日本)。试验介质包含100毫米磷酸钠(pH值6.5),1毫克/毫升溶血卵磷脂,Brij-35 0.5%, 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba鱼藤酮,300gydF4y2BaμgydF4y2BaM APAD, 400gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL肝线粒体蛋白质;反应开始与300年gydF4y2BaμgydF4y2Ba5分钟预培养后M NADPH。山坡上的吸光度随时间被转换为nmol APAD减少使用的摩尔消光系数5.1毫米/分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}×厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}为减少APAD。gydF4y2Ba

2.11。量化线粒体NAD (P)的内容gydF4y2Ba

氧化和减少形式的NAD和辅酶ii是由荧光检测使用高效液相色谱法(HPLC)作为描述Klaidman et al。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)与少量修改(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。校准曲线与已知的标准建造。所有样品与此同时隔绝有袋动物,老鼠立即冻结和维护−80°C,直到一周后分析。gydF4y2Ba

2.12。统计数据gydF4y2Ba

结果提出了代表或平均值±标准错误(SEM)至少三个实验不同的准备。Mann-Whitney(非参数)测试或学生的gydF4y2Ba以及用于统计分析。一个gydF4y2Ba值小于0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。呼吸系统耦合gydF4y2Ba

为了评估分离线粒体的功能完整性准备,呼吸实验(数字gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。袋和小鼠肝线粒体证明well-coupled呼吸虽然呼吸在寡霉素(国家4呼吸;V4)明显高于有袋类动物肝脏线粒体。平均呼吸控制比(RCR)在老鼠身上略高于袋。gydF4y2Ba

3.2。电膜电位(gydF4y2Ba):Ca的效果gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}

实验图中描述gydF4y2Ba2gydF4y2Ba证明激发这两种类型的线粒体是紧随其后的是碱性藏红吸收和吸附极化内膜,流程与碱性藏红荧光降低(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。它可以观察到,最初的减少荧光定量相似在线粒体和稳定在膜电位接近−180 mV(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。ADP除了鼠肝线粒体引起预期的瞬态ΔΨ下降,回到前一个值在短时间内ADP磷酸化。ADP的有袋类动物线粒体也引起预期的ΔΨ减少缓慢回到初始值。ΔΨ估计通过校准钾滴定后离子载体缬氨霉素是包含在中gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

有趣的是,图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba表明,有袋类动物线粒体迅速发布了ΔΨ之后添加一个小脉冲的CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}(30gydF4y2BaμgydF4y2Ba环孢菌素a . M)通过一个机制敏感相比之下,小鼠肝线粒体后持续一个非常稳定的膜电位暂态减少ΔΨ相同的脉冲引起的CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

3.3。CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留能力gydF4y2Ba

考虑到CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}全身的MPT是一个氧化还原敏感的事件,可以促进细胞死亡gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),我们确定了线粒体CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留能力的两种类型的线粒体的评估对MPT的易感性。图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba实验描述代表线粒体氧化NAD-linked基质,ADP的存在,并受连续增加的CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}脉冲,MPT-mediated CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}释放。可以看出,有袋类动物肝脏线粒体表现出显著降低CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留能力比鼠标线粒体。尽管已知MPT抑制剂环孢菌素A、ADP和ATP +毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)显著增加的容量有袋类动物线粒体保留阳离子,其影响在小鼠线粒体(图的要大得多gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。例如,在ADP Ca的能力的存在gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留的有袋类动物肝脏线粒体几乎十倍低于小鼠肝线粒体。gydF4y2Ba

3.4。线粒体烟酰胺核苷酸含量和氧化还原状态gydF4y2Ba

它早就知道gydF4y2Ba33gydF4y2Ba),减少线粒体烟酰胺核苷酸的状态,主要是NADPH [gydF4y2Ba14gydF4y2BaCa),支持gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留了线粒体。评估这些核苷酸在这些机制的参与,我们监控fluorimetrically线粒体的氧化还原状态变化NAD (P) H在体内的解毒添加叔丁基氢过氧化物(gydF4y2BatgydF4y2Ba-BOOH)两种类型的线粒体。首先我们分析了谷胱甘肽过氧化物酶的活动/还原酶体系催化这个反应利用NADPH的减少等价物(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba提供的证据表明,这些酶的活动非常类似的有袋动物和小鼠线粒体但是结果呈现在图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba表示,(i)在线粒体的反应介质中,小鼠烟酰胺核苷酸荧光的最大价值和保持高原而袋烟酰胺核苷酸没有最大价值但稳步增加了荧光对高原低价值比老鼠烟酰胺核苷酸荧光,(ii)引起的氧化还原变化的程度gydF4y2BatgydF4y2Ba-BOOH的有袋类动物线粒体和(iii)恢复的时间gydF4y2BatgydF4y2Ba-BOOH诱导NAD (P) H氧化是有袋类动物线粒体更长。综合这些结果表明,减少内容和状态都是较低的有袋类动物线粒体的小鼠线粒体。与琥珀酸作为能源基质条件下,用于获得数据如图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba,需要例数十分的功能(如在[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba支持辅酶ii])gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba减少。出于这个原因,因为rereduction NAD (P)后袋比小鼠线粒体慢得多gydF4y2BatgydF4y2Ba-BOOH之外,我们化验例数十分活动从两个物种分离出肝线粒体。例数十分不不同的测量活动袋(gydF4y2Baμ/毫克;gydF4y2Ba)和鼠标(gydF4y2Baμ/毫克;gydF4y2Ba),从而排除例数十分的参与活动相比,有袋类动物线粒体的过氧化代谢缓慢的老鼠。gydF4y2Ba

为了进一步研究线粒体氧化还原状态和烟酰胺核苷酸的内容,我们进行了高效液相色谱法分析这些核苷酸。图中给出的酒吧gydF4y2Ba5gydF4y2Ba表明,在袋总NAD含量高于在小鼠线粒体(gydF4y2Ba与gydF4y2Banmol /毫克),相比之下,总辅酶ii的内容是低得多的有袋类动物线粒体(gydF4y2Ba与gydF4y2Banmol /毫克)。最有趣的,在协议与数据呈现在图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba,烟酰胺核苷酸都更有袋类动物线粒体氧化。总的来说,数据中的数据gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba似乎表明,有袋类动物肝脏线粒体具有内源性底物的含量低于与NAD (P)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba减少比老鼠。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

线粒体功能障碍和开放的PTP彻底卷入一些疾病和衰老的发展,在各种动物模型(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在这方面,目前的研究表明,孤立的肝脏线粒体的短寿命有袋类动物gydF4y2Bag . microtarsusgydF4y2Ba提出了三个主要的功能差异相比,小鼠线粒体,这里使用作为一个建立的哺乳动物模型,用于比较。首先,有袋类动物线粒体表现出相当高的休息(状态4)呼吸;其次,他们更容易受到PTP开放;第三,他们有一个低得多的本构NADPH /辅酶ii所代表的抗氧化能力gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内容和氧化还原电位。gydF4y2Ba

较高的状态4呼吸出现在所有的有袋类动物肝脏线粒体准备比鼠标。从氧化还原调控的角度的MPT走近,它可能是值得一提的,更高的线粒体呼吸率与线粒体超氧化物自由基产生的低利率(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。以来最常用的技术来评估从线粒体ROS生产(Amplex红/辣根过氧化物酶测定)可能不适合比较孤立肝线粒体从不同物种gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),我们进行分析线粒体的抗氧化系统。这些评估确实显示主要的线粒体氧化还原这两个物种之间的差异对MPT的监管。它可能推测更高的状态4呼吸袋可以链接到一个受损的线粒体清除旧的或损坏的过程,可能导致快速的衰老过程相关的短寿命袋(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。除了这个假定族群分开线粒体和Ca的高敏感性gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}全身的MPT袋和小鼠肝线粒体表现出类似的生物能学属性时在相同的实验条件下进行。结果部分所示,肝脏线粒体从物种都是耦合的,可比的电膜电位值和最大ADP-stimulated呼吸。因此,药物敏感性的差异之间的质量差距MPT不能归咎于两个线粒体的准备工作。的确,在这个实验室的研究进展表明,鱼肝脏线粒体出现下呼吸道控制比例和更高的状态4比鼠肝线粒体呼吸;但与这些有袋类动物线粒体、鱼肝线粒体有更高的能力保留CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}比老鼠(g . a . Dal 'Bo f . g .桑帕约a . e . Vercesi未发表的结果)。事实上,目前的实验证明袋和老鼠线粒体分享一些MPT属性和其他一些属性不同。图中所示的结果gydF4y2Ba3gydF4y2Ba表明,有袋类动物线粒体呈现较低的阈值gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}诱导PTP开放。然而,应该强调,即使PTP抑制了CsA的能力有袋类动物线粒体积累和留住CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}明显低于小鼠线粒体。此外,有袋类动物线粒体MPT是较不敏感的抑制腺嘌呤核苷酸ATP和ADP,尤其是后者。例如,尽管小鼠线粒体积累和留存十脉冲60 nmol CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}/ mg之前打开PTP在ADP的存在,有袋类动物线粒体能够积累并保持只有一个脉冲(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

尽管大量的研究接近PTP结构,其成分仍然悬而未决和争议。组成的一些研究显示,这是最低限度或调制矩阵,内在和外在膜蛋白等还有CsA-binding蛋白D (CypD),腺嘌呤核苷酸运输车(ANT)、ATP合酶,己糖激酶、磷酸运营商和电压依赖性离子通道(VDAC)(最近评论者[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba])。其他的研究使用亚线粒体粒子,丝状体、线粒体自然或提供证据表明转基因PTP开放可能发生虽然具有不同特点的即使没有这些蛋白质(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。因此,目前的结果显示袋和老鼠PTP之间不同的属性可以被考虑不同的可塑性和蛋白质组成的孔隙。此外,氧化应激可能还有助于降低抑制腺嘌呤核苷酸对Ca的影响gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}诱导MPT [gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba在有袋类动物线粒体。gydF4y2Ba

也许最有趣的有袋类动物肝脏线粒体的特点是他们的低钙的能力gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}保留。这次召回开创性Lehninger实验室的数据证明gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}释放肝脏线粒体的氧化状态的内生烟酰胺核苷酸(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。理解这些数据的进展提供了证据,PTP开放与膜蛋白硫醇通过硫醇氧化交联与线粒体的氧化还原状态辅酶ii (gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。事实上,MPT可以刺激在CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}线粒体等prooxidants加载gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaBOOH、肼、苏拉明和/或通过各种实验条件,导致氧化应激在孤立的线粒体,完整的细胞,或孤立的器官gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在目前的工作,更多的线粒体的氧化状态辅酶ii在高效液相色谱分析得到强烈支持的线粒体NADPH-dependent谷胱甘肽抗氧化系统和硫氧还蛋白氧化酵素/还原酶更有效的有袋类动物由于降低NADPH(图提供的还原能力gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba)。进一步证实了这一假设实验图中描述gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba显示的速度慢得多gydF4y2Ba-BOOH代谢由袋比小鼠肝线粒体。这也同意这个实验室的最新研究表明,肝线粒体隔绝expontaneously突变C57BL / 6 j小鼠缺乏功能性线粒体烟酰胺核苷酸transhydrogenase(例数十分),一种酶,这种酶可以减少辅酶iigydF4y2Ba^+gydF4y2Ba利用NADH的减少等价物,更容易受到MPT [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。虽然袋和NNT-mutated老鼠表现出妥协NADPH还原能力通过不同的机制,他们有共同的线粒体特征即低抗氧化剂线粒体容量和高对MPT的易感性。gydF4y2Ba

复杂的表型,短寿命的有袋类动物,可能取决于许多变量之间的相互作用,其中观察线粒体特征可能构成一种内在的生化因素减少生存环境挑战。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

ADP:gydF4y2Ba	二磷酸腺苷gydF4y2Ba
ATP:gydF4y2Ba	三磷酸腺苷gydF4y2Ba
客服人员:gydF4y2Ba	环孢菌素一个gydF4y2Ba
氯化钾:gydF4y2Ba	氯化钾gydF4y2Ba
LM:gydF4y2Ba	肝脏线粒体gydF4y2Ba
MPT:gydF4y2Ba	线粒体通透性转换gydF4y2Ba
NAD:gydF4y2Ba	βgydF4y2Ba烟酰胺腺嘌呤二核苷酸gydF4y2Ba
NADH:gydF4y2Ba	减少NAD的形式gydF4y2Ba
河畔gydF4y2Ba+gydF4y2Ba:gydF4y2Ba	NAD的氧化形式gydF4y2Ba
辅酶ii:gydF4y2Ba	βgydF4y2Ba烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸gydF4y2Ba
NADPH:gydF4y2Ba	减少形式的辅酶iigydF4y2Ba
辅酶iigydF4y2Ba+gydF4y2Ba:gydF4y2Ba	氧化形式的辅酶iigydF4y2Ba
例数十分:gydF4y2Ba	烟酰胺核苷酸transhydrogenasegydF4y2Ba
益生元:gydF4y2Ba	寡霉素gydF4y2Ba
元:gydF4y2Ba	渗透过渡孔gydF4y2Ba
ROS:gydF4y2Ba	活性氧gydF4y2Ba
-BOOH:gydF4y2Ba	叔丁基氢过氧化物gydF4y2Ba
瓦尔:gydF4y2Ba	缬氨霉素。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢Prianda r . Laborda博士讨论有袋类动物遗传学。研究经费是由FAPESP(2011/50400-0)和CNPq必须占州政府提供。b·亨宁斗篷和CNPq奖学金的支持。gydF4y2Ba