红景天甙刺激线粒体生物起源和防止H₂O₂全身的内皮功能障碍

文摘

红景天甙(SAL)是一个活跃的组成部分红景天的有抗氧化的性质。本研究的目的是探索SAL的保护作用的机制在过氧化氢(H₂O₂-)诱导内皮功能障碍。预处理的人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)萨尔显著降低带来的细胞毒性H₂O₂。功能研究大鼠主动脉发现萨尔救了endothelium-dependent放松和减少超氧化物阴离子()生产引起的H₂O₂。与此同时,萨尔预处理抑制H₂O₂全身的一氧化氮(NO)的生产。底层机制包括抑制H₂O₂全身的激活内皮一氧化氮合酶(以挪士)、腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK),和一种蛋白激酶,以及氧化还原敏感的转录因子,NF -κB (NF -κB)。萨尔也增加了线粒体质量和调节线粒体生物起源因素,过氧物酶体proliferator-activated受体gamma-coactivator-1alpha (PGC-1α),线粒体转录因子(TFAM)内皮细胞。H₂O₂全身的线粒体功能障碍,通过减少线粒体膜电位(Δψ米)和ATP生产,由萨尔预处理获救。总的来说,这些发现表明,萨尔可以保护内皮对H₂O₂全身的伤害通过促进线粒体生物起源和功能,从而防止氧化应激相关的overactivation下游信号通路。

1。介绍

氧化应激作用的内皮功能障碍的发展也已经有了很广泛的研究(1- - - - - -4]。过多的活性氧(ROS)不仅可以减少可利用一氧化氮(NO)通过直接反应形成过氧硝酸盐,但也会导致以挪士解偶联,进一步诱发更多的活性氧产量(5]。

作为一个主要的细胞活性氧的来源,线粒体的贡献心血管风险因素的不利影响最近受到更多的关注(6- - - - - -8]。过度线粒体ROS (mtROS)法激发病理条件下细胞信号级联综合过度氧化应激(9- - - - - -11]。NF -κB (NF -κB)激活内皮细胞线粒体活性氧发生二次过度生产,参与一系列促炎和凝血改变内皮细胞(12,13]。

内皮细胞线粒体在血管path-physiology发现有至关重要的作用[14- - - - - -16),越来越多的证据表明线粒体功能障碍的重要性在不同的血管疾病,如动脉粥样硬化、心力衰竭和心肌缺血/再灌注损伤(17- - - - - -19]。之前的研究表明,线粒体生物起源的失调是内皮功能障碍的早期表现,改变细胞代谢对动物代谢缺氧受损没有生物利用度(14]。损伤的线粒体生物起源是经常观察到动脉粥样硬化,从而可能导致细胞能量失衡,氧化应激、内皮功能障碍在这些病理条件20.]。以来增加了线粒体活性氧的生产由于受损的线粒体生物起源似乎也是一个关键事件发展的体内血管疾病(13,21,22)的识别机制,促进内皮细胞的线粒体生物起源可能对血管疾病的发病机制提供了新的线索。

健康的线粒体部分由他们的生物起源和过氧物酶体proliferator-activated受体gamma-coactivator-alpha (PGC-1α)被视为关键调节器23]。在内皮细胞,PGC-1α也协调细胞抵抗氧化应激(24]。线粒体转录因子(TFAM)负责mtDNA及其易位的转录控制线粒体是重要的启动mtDNA转录和复制(25]。

如上所述,线粒体是高度动态的细胞器,和他们的生物起源可能参与调节内皮细胞代谢,氧化还原调控和信号转导6,16,26]。通路调节线粒体生物起源是潜在的治疗靶点改善内皮功能障碍和血管疾病(27]。

红景天甙(SAL)是一种活性成分的根源红景天的著名草用来缓解高海拔病(28]。萨尔也被用于增强物理和精神表现。萨尔上调抗氧化谷胱甘肽酶的水平peroxidase-1和thioredoxin-1对抗氧化应激(29日]。以前的研究已经表明萨尔促进DNA修复酶Parp-1对抗氧化应激(30.]。与此同时,最近的一项研究报道,萨尔减毒homocysteine-induced内皮功能障碍通过减少氧化应激(31日]。如上所述,有严格减少线粒体生物起源与内皮功能障碍之间的关系;目前的研究,以确定SAL复苏的内皮功能障碍引起的H₂O₂通过刺激线粒体生物起源和抵消氧化应激相关以挪士和NF -κB信号通路。

2。材料和方法

2.1。动物

动物治疗按照指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院和当地动物保护委员会的批准。健康Wistar鼠(200 - 250 g)购买的实验动物中心(同济医科大学,华中科技大学,中国)和维护在一个受控环境的光/暗周期12 h,温度°C,湿度的%。

2.2。细胞培养

人类脐带的集合是同济医学院伦理委员会的批准,华中科技大学(武汉,中国),按照[宣言32]。主要培养的人脐静脉内皮细胞中描述的准备(通过传代形成细胞(33]。总之,脐带被冷PBS然后充满0.25%胰蛋白酶。消化后停止,收集的细胞使离心10分钟1 000 rpm。这些细胞被resuspended然后在内皮细胞培养介质(ECM、Sciencell卡尔斯巴德,CA)在孵化器37°C调湿大气的5%股份有限公司₂。在所有的实验中,细胞被用于段落2胜7负。

2.3。细胞生存能力分析

研究SAL在H的效果₂O₂全身的细胞毒性,HUVECs接种密度的2×10⁴每一夜之间在96孔板和培养;细胞的生存能力是评估使用细胞计数Kit-8 (Dojindo实验室、熊本)[34]。短暂,HUVECs治疗H₂O₂(σ4 h)或萨尔(国家食品和药物控制研究所,纯度> 98%,24 h)在OPTI-MEM表示浓度(Gibco)在细胞生存能力测量。此外,研究SAL在H的效果₂O₂全身的抑制细胞生存能力,细胞培养如上所述;治疗后与萨尔20 h, h₂O₂(100μM)添加到介质为另一个4小时。的最后时期,培养基被移除。这些细胞被洗两次与PBS和孵化CCK-8解决方案在37°C为30分钟。吸光度测量使用标测试波长450纳米。

2.4。自由基测量无细胞系统

萨尔在清除羟基自由基的影响(),超氧化物自由基()和H₂O₂与商用测定试剂盒(南京建成生物工程研究所、中国)根据制造商的指示。在短暂的,芬顿反应生成的,然后处理显色底物nitrotetrazolium蓝色氯(电视台)产生一个稳定的有色物质,这是衡量使用标测试波长450纳米。是由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统生成的,由亚硝酸盐检测方法,在550 nm测定吸光度。H的反应产物₂O₂在405纳米和钼酸可以被检测到。去离子水和抗坏血酸(Vc)作为空白和积极控制,分别。抑制率=(光密度的空白控制groups-optical密度治疗组)/光密度的空白对照组。

2.5。血管功能的测量

大鼠主动脉胸段的解剖和周围结缔组织被擦掉了。每个主动脉环切成段2 ~ 3毫米的长度。主动脉环安装在机关室充满Krebs-Henseleit (KH)解决方案在37°C不断冒泡95%氧气/二氧化碳的5%。4.75 KH解决方案包含(133毫米)氯化钠,氯化钾,1.5 CaCl₂1.25 MgCl₂25 NaHCO₃,11 d -葡萄糖。等长张力记录与测力传感器(RM6240C、成都仪器厂)。20 mN的基底压力被应用到每一个血管环。放置在器官浴后90分钟,0.5μM苯肾上腺素(PE、σ)是第一个管理测试他们的收缩性,然后1的戒指μM乙酰胆碱(靠,σ)管理评估内皮细胞层的完整性。戒指只有不到80%的放松反应ACh被丢弃。主动脉环使用或没有10μ萨尔H前30分钟₂O₂100年μ添加到浴。预约后PE (0.1μ米),乙酰胆碱(1×10⁻⁸~ 1×10⁻⁴米)添加累计到浴唤起endothelium-dependent放松。放松利率之间的比率是紧张放松ACh, PE收缩的张力。

2.6。没有测量和超氧化物阴离子()

测量细胞内没有水平,没有和特殊技能荧光染料4,5-diaminofluorescein二乙酸(DAF-FM-DA Beyotime生物技术研究所)35)和dihydroethidium(她Beyotime生物技术研究所)36被用来测量细胞内没有和水平,分别。简单地说,支流HUVECs 96 -孔板,在萨尔(10μ米)或PBS治疗24 h,与PBS洗两次染色2.5紧随其后μM DAF-FM-DA或5μ米她30分钟37°C。与PBS洗两次后,荧光强度测量作为基底,然后100年μM H₂O₂是补充道。使用荧光分光光度计(TECAN无限F200PRO), DAF-FM-DA测量荧光强度的激发波长的发射波长485 nm和535 nm,分别测量和她在一个激发波长的发射波长535 nm和610 nm,分别。

2.7。NF -κB活性测定

ELISA-based试验是用来测量NF -κB活动,如前所述37- - - - - -39]。总之,刺激后,细胞与冷PBS冲洗两次,然后里帕含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏、巴塞尔、瑞士)补充道。冰孵化后30分钟,15分钟的溶解产物是离心机在14 000 rpm和上层的收集。量化后用BCA试剂(皮尔斯,罗克福德,IL),细胞提取物被孵化96孔板涂上含有NF -寡核苷酸κB consensus-binding网站(5′-GGGACTTTCC-3′)。激活转录因子的提取具体绑定到各自的固定寡核苷酸。NF -κB活性检测与主抗体NF -κProteintech B p65(1: 1000年,中国)和二级抗体结合辣根过氧化物酶(Abbkine 1: 10 1000年,CA)。Tetramethylbenzidine (100μL,σ)添加在每个microwell 37°C前增加100μL停止解决方案(2 m H₂所以₄)。NF -κB活动终于决定作为吸光度值与标仪测量的波长450纳米。

2.8。线粒体质量的测量

线粒体质量决定利用MitoTracker绿色mitochondrial-selective膜potential-independent染料(40]。细胞生长在覆盖会涂上2%明胶与萨尔(1,10孵化μ米)24 h。最后孵化,悬浮液被拆除,这些细胞被孵化以200海里MitoTracker绿色(Beyotime生物技术研究所、中国)37°C为30分钟。用荧光显微镜捕获的图像(奥林巴斯FV500)使用40×放大目标(41]。集成的荧光强度测量使用Image-Pro +软件和归一化细胞的数量。

2.9。测量细胞内ATP的水平

治疗后,从每个的HUVECs 6-well盘(5×10⁵/)用冷洗两次PBS和细胞溶解0.5米高氯酸和短暂用(1秒破裂的5 - 10倍),直到细胞明显中断。样本2 M KOH中和后然后离心去除沉淀。ATP含量分析了高效液相色谱法(安捷伦,帕洛阿尔托,CA) LC-18T反相柱(安捷伦,帕洛阿尔托,CA)在0.3毫升/分钟的流量,和254海里的吸光度被记录。洗脱峰与ATP标准(国家食品和药物控制研究所,北京)确认其身份。

2.10。评估线粒体膜电位(Δψ米)

JC-1带正电的荧光化合物是由线粒体比例内线粒体膜电位(42]。红色(J-aggregate) /绿色的比率(单体的JC-1)发射Δ成正比ψm。HUVECs被种植在96孔板处理萨尔(10μ米)20 h, h₂O₂(100μ米)添加另一个4 h。100年细胞冲洗PBS和孵化μL JC-1染色溶液在37°C为20分钟。细胞被冲洗两次JC-1清洗解决方案用荧光分光光度计和分析。J-aggregates记录激发波长的发射波长535 nm和610 nm,分别和单体的JC-1记录激发波长的发射波长485 nm和535 nm,分别。

2.11。免疫印迹分析

细胞在冰冷的均质里帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和phosSTOP(罗氏、巴塞尔、瑞士)。等量的蛋白质(60μg)混合加载缓冲区(Beyotime生物技术研究所),煮10分钟,通过sds - page分离。蛋白质电泳后,被转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF微孔,泰梅库拉,CA)。1 h的膜被封锁5%牛奶。膜被孵化一夜之间在4°C以下具体主要抗体之一:兔子anti-eNOS ser1177, anti-eNOS anti-AMPKαthr172, anti-AMPKα,反β肌动蛋白(1:1 000年,细胞信号技术,贝弗利,MA), anti-Akt ser473 (EPITOMICS 1: 1 000年,CA), anti-Akt(1: 600年,Proteintech) anti-TFAM(1: 300年,Proteintech)和anti-PGC-1α(1:200年,圣克鲁斯,CA)。洗后,膜被孵化2 h在室温下与二次抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白,山羊anti-mouse免疫球蛋白g, 1: 10 000年,Abbkine, CA),然后洗净。最后,这些墨迹开发与增强化学发光检测试剂(热科学、沃尔瑟姆,MA)。膜进行扫描使用MicroChemi bioimage分析仪(NDR,以色列)和量化使用图像J程序和规范化β肌动蛋白。

2.12。统计分析

在这项研究中所有数据表示为均值±SEM从至少三个独立的实验。使用SPSS 13.0统计分析。个人组统计对比分析未配对的学生的以及与Bonferroni调整,和多个组比较被单向方差分析与事后测试评估。的概率值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。萨尔缓解细胞毒性引起的H₂O₂在HUVECs

在这项研究中,H₂O₂被用来在HUVECs诱导氧化应激。在暴露于H₂O₂(100 - 1000μ米)4 h, HUVECs可行性降低(图1(一))。萨尔的浓度低于10μM细胞生存能力没有明显的影响与控制(图1 (b))。预处理与萨尔可以减少细胞死亡引起的H₂O₂浓度的方式(图1 (c))。

3.2。萨尔对活性氧的影响无细胞系统

萨尔已经清除的效果但不是或H₂O₂在表示浓度(数字2(一个),2 (b),2 (c))。

3.3。萨尔复苏H₂O₂全身损伤大鼠主动脉的Endothelium-Dependent放松

治疗H₂O₂(100μ米)30分钟明显减毒ACh-induced endothelium-dependent放松(EDR)在大鼠主动脉。萨尔(10μ米,30分钟)之前的H₂O₂部分获救EDR功能受损(图3(一个))。与此同时,预处理萨尔(10μ米,24 h)抑制没有和生产由H₂O₂(100μ米)(图3 (b)和3 (c))。

3.4。萨尔减少以挪士激活引起的H₂O₂在HUVECs

与控制相比,H₂O₂(100μ米,4 h)或萨尔(10μ米,24 h)治疗显著增加以挪士磷酸化ser1177和一种蛋白激酶磷酸化在HUVECs Ser473。预处理与萨尔(10μ米)24 h减毒以挪士的激活,AMPKα在100年,Akt诱导μM H₂O₂(数据4(一),4 (b),4 (c),4 (d))。

3.5。萨尔抑制转录因子的激活NF -κB H引起的₂O₂在HUVECs

激活的转录因子NF -κB已经与炎症和血管内皮细胞功能障碍在动脉粥样硬化形成中的作用[43]。与之前的研究一致,暴露在H₂O₂可能导致短暂激活NF -κB(图5(一个)),而萨尔(10μ米)表示时间显著减少转录因子NF -的活性κB在时间的方式(图5 (b))。与萨尔预处理抑制NF -的激活κ0.1 B引起的μM H₂O₂(图5 (c))。令我们吃惊的是,我们发现,暴露在H₂O₂(0.1μ米)30分钟可能导致短暂激活NF -κB,而H₂O₂在100年的浓度μM略微降低而不是增加了NF -κB的活动。萨尔预处理可以进一步减少NF -的活性κB(图5 (c))。为了解释这个结果,我们使用TNF -α,一个经典的NF -κB诱导物治疗HUVECs检测H的直接影响₂O₂在DNA结合活性。结果表明,H₂O₂抑制NF - DNA结合活性的激活κB在剂量依赖性的方式(图5 (d))。

3.6。萨尔诱导内皮细胞的线粒体生物起源

我们的研究结果表明,萨尔(10μ米)MitoTracker绿色的荧光强度增加,表明萨尔增加了线粒体质量在HUVECs(图6(一))。与此一致的是,PCG-1的表达αTFAM,线粒体生物起源的主要监管者与萨尔HUVECs孵化(数据显著增加6 (b)和6 (c))。

3.7。萨尔恢复H₂O₂全身的线粒体功能障碍

我们使用独立的参数来评估线粒体ATP生产和ΔΨm函数。如图7H₂O₂(100μ米)诱导ΔΨm崩溃(a)和ATP生产下降(b)在培养HUVECs 4 h(治疗后。预处理与萨尔(10μ米)24 h获救线粒体功能。

4所示。讨论

有越来越多的注意力集中在氧化应激和内皮细胞损伤之间的关系(44- - - - - -46]。本研究采用H₂O₂全身的氧化应激在HUVECs细胞模型来研究SAL的保护作用。在我们的实验中,萨尔预处理明显防止受损的可行性HUVECs造成H₂O₂曝光。这些结果符合先前的研究[47),进一步证实了萨尔对损伤的保护作用引起的H₂O₂。此外,萨尔的抗氧化机制不是由于萨尔和H之间的直接反应₂O₂(图2)。

过度繁殖ROS已知损害正常血管功能通过限制的有利影响内皮衍生没有(48]。增强生产和释放活性氧和/或血管壁内生物利用度的下降导致内皮功能障碍,被广泛认为是早期关键事件在不同血管并发症的发病机理4,49]。尽管H₂O₂抒发放松在老鼠,老鼠,兔子主动脉(50- - - - - -53)和刺激以挪士,导致没有水平较高(54),长期高度H的效果₂O₂是损害endothelium-dependent放松(55]。先前的研究表明,萨尔阻止homocysteine-induced内皮功能障碍通过减少氧化应激(31日]。在我们的研究中,预处理与H₂O₂诱导内皮依赖性松弛的重要障碍,而萨尔有能力拯救这个障碍。正如所料,孵化的HUVECs H₂O₂惊人地增加细胞内,这可以通过预处理抑制萨尔。这些结果表明,萨尔抑制H₂O₂全身的活性氧产量,导致恢复endothelium-dependent血管舒张。

不,来自以挪士在内皮细胞的作用,是一种最重要的介质调节内皮功能(56]。以挪士的磷酸化ser1177激活以挪士,而直接氧化通量增加食没有低生物利用度(57),随后会损害endothelium-dependent血管舒张(58]。有趣的是,在许多先前的研究显示,H₂O₂直接调节没有在内皮细胞的水平,这表明由内皮细胞,以应对生产过剩的H₂O₂刺激的目的是保护细胞,而不是破坏细胞(59,60]。本研究来自一个有趣的问题是,为什么萨尔往往抑制H₂O₂全身以挪士激活,没有生产,而它本身似乎移植以挪士表达式和激活(数字4和3 (c))。我们推测的upregulation以挪士活动和生产长期SAL治疗可能由瞬态温和线粒体去极化和降低氧需求,进而增加影响细胞后续氧化侮辱的宽容程度更大。但这需要进一步的证明。

有证据,没有可以抑制NF -的激活κ我通过降解κBα(61年]或抑制NF -κB DNA结合(62年]。我们也分析了萨尔对NF -的激活κB H引起的₂O₂。我们的日期显示,萨尔NF -的基底活动减少κ与此同时阻断激活NF - BκB H引起的₂O₂(图5)。H₂O₂在100年的浓度μM略微降低而不是增加了NF -κB活动;与此同时,预处理萨尔进一步减少了活动。可能的解释是,H₂O₂本身诱发积极调光器的形成P65 P50子单元和导致细胞核的易位。然而,细胞核内,半胱氨酸62残渣P50亚基氧化次磺酸和进一步S-glutathionylation紧随其后,抑制NF -的绑定κB DNA (63年- - - - - -65年]。加强这一假设,我们发现直接影响H₂O₂在DNA结合活性。我们使用TNF -α,一个经典的NF -κB治疗HUVECs诱导物。细胞溶菌作用和总蛋白提取后,我们孵化的蛋白质浓度增加与H₂O₂(0.1,1、10和100μ米)为30分钟,然后NF -的活动κ发现了B部分中描述2。结果表明,H₂O₂剂量依赖性抑制NF - DNA结合活性的激活κb .自NF -κB是一个氧化还原敏感的转录因子,它的激活参与炎症和线粒体生物起源障碍(66年]。我们推测在HUVECs SAL的保护作用可能与NF -干扰κB信号通路。

适度的增加没有刺激线粒体生物起源,主要通过cGMP-dependent监管因素,包括PGC-1的基因表达和激活α和TFAM67年,68年]。在心肌细胞中,coimmunoprecipitation实验表明p65 NF -亚基κB由绑定到PGC-1观察α共激活剂和基因转录的激活和NF -κB激活增加这个绑定(69年]。此外,PGC-1α超表达抑制NF -κB激活人类主动脉平滑肌肉和内皮细胞(70年]。所以它是合理的,代理刺激PGC-1α内皮细胞的表达和线粒体生物起源有利于预防心血管疾病的发展。我们首次报道,萨尔增加线粒体质量在HUVECs(图6(一))。诱导线粒体生物起源在血管健康是非常重要的27,71年]。此外,线粒体增生减少单位线粒体电子的流动;SAL-induced线粒体生物起源可能有助于减少在HUVECs线粒体活性氧的生产。

确定SAL在线粒体生物起源的作用是激活线粒体生物起源的监管的结果因素,我们检查了PGC-1的表达α和TFAM。我们发现萨尔PGC-1的表达增加α和TFAM(数据6 (b)和6 (c))。

除了刺激线粒体生物起源,PGC-1α也会导致活性氧解毒酶的诱导,包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、血红素加氧酶(72年- - - - - -75年]。这些发现暗示PGC-1α介导的线粒体氧化损伤细胞生物起源似乎提供了一个好来源的“健康线粒体”解毒mtROS由大量抗氧化防御系统包含大量的电子传递链的氧化还原酶,最终减少净ROS生产。这些萨尔对线粒体生物起源的影响可能部分解释其抗氧化性能。

许多证据表明,H₂O₂引起的内皮细胞损伤诱导的线粒体功能障碍(76年,77年]。由于定位线粒体膜内部,缺乏histone-like覆盖和低效率的DNA修复系统相比,核DNA, mtDNA容易氧化应激(78年]。此外,更有可能影响基因突变完整性因为缺乏线粒体基因组的基因内区(79年]。受损的线粒体ATP产生更少但更大的大量的活性氧,其余信号,进入一个恶性循环,加重心血管疾病(80年]。如图7,SAL预处理废除了H₂O₂全身崩溃ΔΨm和救了线粒体功能,证明了增加ATP生产。这些影响的萨尔减少潜在的mtDNA被H₂O₂;此外,萨尔增强线粒体生物起源,它提供了健康的线粒体来取代受损的线粒体组件ROS和维持正常的线粒体功能。萨尔对线粒体的保护作用是至关重要的维持内皮体内平衡。

总之,目前的研究表明萨尔的小说机制保护内皮细胞免受氧化损伤。通过刺激线粒体生物起源(图8)和抵消线粒体内活性氧破裂,萨尔政府阻止了overactivation几个信号通路引起的破坏性氧化刺激和保护内皮细胞的生存能力,以及内皮依赖的血管功能。新颖的化合物与线粒体生物起源刺激活动可能成为潜在的药物预防或治疗候选人等障碍与氧化应激相关的代谢综合征或癌症等等。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

沙沙村邢和杨小燕了同样的工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81373413,81373413,81000080),中国教育部(ncet - ygyl008 10 - 0409年和2013年),和国家科技重大专项(2013 zx09103 - 001 - 020和2011 zx09102 - 004 - 001)。

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