文摘
氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是主要的脂质在动脉粥样硬化病变和升高血浆oxLDL被认为是动脉粥样硬化的危险因素。等离子体oxLDL是否可以穿越内皮细胞并启动动脉粥样硬化改变仍然未知。在一个既定的在体外细胞transcytosis模型,目前的研究发现,oxLDL可能进一步交通在血管内皮细胞和内源性神经酰胺的规定生产的神经酰胺代谢酶抑制剂显著改变的transcytosis oxLDL跨内皮细胞。发现酸性鞘磷脂酶抑制剂,去郁敏(DES),和新创神经酰胺合成抑制剂,myriocin(最高产量研究),减少内源性神经酰胺生产,显著抑制oxLDL transcytosis。Ceramidase抑制剂,N-oleoylethanolamine(一)和鞘磷脂合成酶抑制剂,O-Tricyclo [5.2.1.02 6] dec-9-yl dithiocarbonate盐钾(D609),增加内源性神经酰胺生产,显著调节oxLDL transcytosis。在活的有机体内、注射荧光标记oxLDL到老鼠的身体也倾向于皮下保留这些氧化脂质。目前的研究中提供的观测表明,内源性神经酰胺的transcytosis有助于oxLDL跨内皮细胞和促进atherosclerosis-the皮下的初始步骤保留脂质在血管壁。
1。介绍
动脉粥样硬化(AS)是表示“大脑”和心血管疾病的病理基础,而老年人死亡的主要原因是(1]。的发病机制远未完全理解。近年来,越来越多的证据表明,启动步骤的可能是内膜的皮下保留脂蛋白,所谓“应对保留”假说(2- - - - - -5],它强调积累apoB-containing脂蛋白的作用(主要是低密度脂蛋白、低密度脂蛋白)皮下空间,以及细胞外基质的粘附分子,等等的发病机理。
沉积在血管内膜,脂蛋白必须通过血管内皮细胞提供的屏障。血管内皮细胞之间的差距是直径约3 - 6海里,只允许水、无机盐,少数小蛋白质通过。低密度脂蛋白等高分子分子的直径约20 - 30海里通常不能够通过内皮屏障(6- - - - - -8]。
最近的研究发现低密度脂蛋白交通跨内皮屏障主要通过transcytosis [9],它指的是一个富含蛋白质的粒子的过程通过极性细胞(如内皮细胞、上皮细胞等)通过受体或nonreceptor介导机制。低密度脂蛋白可以被内源性血管内皮细胞腔面然后胞吐的基底外侧(9]。大量的研究已经证明,低密度脂蛋白主要积累在斑块是氧化修饰形式,即氧化低密度脂蛋白,oxLDL。目前,oxLDL是公认的主要诱发因素是(10,11]。等离子体oxLDL水平显著增加在病人和被认为是指标的早期筛查和诊断冠心病(12,13]。由transcytosis等离子oxLDL能否通过内皮细胞,进一步坚持内膜发起的发生率仍然未知。
近年来,脂筏的角色(LRs)的跨膜运输大分子吸引了更多的关注[14- - - - - -17]。脂筏是膜域富含胆固醇和鞘脂类(18,19]。内皮小窝用于低密度脂蛋白transcytosis是一家专业膜筏域(15]。膜融合泡膜和肌质膜之间由于大分子复合物的形成,如t-SNARE v-SNARE,也依赖于该平台的融合形成的膜筏(9]。神经酰胺,鞘脂类的支柱,被认为参与动脉粥样硬化的发展(20.,21]。神经酰胺可以通过激活从鞘磷脂生成鞘磷脂酶(sma)或新创途径。此外,神经酰胺可以通过激活鞘磷脂合成鞘磷脂合成酶(SMS)或退化成鞘氨醇ceramidase,分别。参与神经酰胺代谢抑制剂通常包括酸性鞘磷脂酶抑制剂(ASM),去郁敏[22- - - - - -24),新创神经酰胺合成抑制剂,myriocin [25(一)[],ceramidase抑制剂26,27(D609)[],鞘磷脂合成酶抑制剂28,29日]。
内生和外生因素的刺激后,鞘脂类(鞘磷脂)内皮细胞膜木筏受到酸性鞘磷脂酶的水解,释放出亲水胆碱磷酸组和生成疏水性产品,神经酰胺(15]。分子间氢键的存在为神经酰胺同时融合提供了强大动力。通过集成神经酰胺,许多小膜筏可以聚集在一起成大microdomains,提供信号跨膜信号转导的交互平台30.- - - - - -32]。最近的研究还发现,产生的神经酰胺膜筏在病原体入侵宿主细胞中扮演关键角色,如铜绿假单胞菌(33- - - - - -35]。此外,神经酰胺会引发和促进Weibel-Palade胞外分泌的尸体在内皮细胞(23]。
考虑到多个细胞神经酰胺的起源,目前的研究旨在确定神经酰胺的角色来自不同来源调停的transcytosis oxLDL在血管内皮细胞和如何将这些transcytosed oxLDL粒子进一步促进血管壁的变化。
2。方法
2.1。隔离和文化人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)
人类脐带的集合是同济医学院伦理委员会的批准,华中科技大学(武汉,中国),并进行了符合赫尔辛基宣言(2008年)。主要HUVECs隔绝0.01% edta - 0.25%胰蛋白酶消化新生儿脐带被培养在ECM (ScienCell)补充5%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,链霉素100 U /毫升、和30μg / mL内皮细胞生长补充(ecg) 37°C下5%的股份有限公司2在湿润的气氛中。亚文化,细胞收获时用0.25%胰蛋白酶没有EDTA汇合的80% ~ 90%。在实验之前,ECM是取代OPTI-MEM (Gibco)没有的边后卫。所有研究都使用HUVECs执行2 - 8通道(36- - - - - -38]。
2.2。免疫细胞化学
孵化后抑制剂(最高产量研究,DES、D609和诺伊),分别为12 h, HUVECs种植在gelatin-coated盖玻片固定在4%甲醛在PBS 10分钟,然后洗了三遍。细胞被染色的anti-ceramide IgM抗体(Alexis, 1: 100) 1 h在37°C和随后CY3-conjugated山羊anti-mouse二级抗体(bios, 1: 100)另一个2 h在室温下(39- - - - - -41]。图像获得的使用都是荧光显微镜(奥林巴斯FV500) [42]。集成的荧光强度测量使用Image-Pro +软件和归一化细胞的数量。
2.3。细胞内神经酰胺提取和定量
神经酰胺是由HPLC-MS提取并量化/女士(热,LCQ十根据前面描述的原则()43- - - - - -46]。细胞脂质提取,细胞细胞溶解在蒸馏水和均质声波降解法与抑制剂孵化后12 h。蛋白质浓度测定和等量的蛋白质(500μg)调整800年的体积μL在1 M氯化钠。C12神经酰胺(10 ng)加入溶菌产物作为内部标准和由此产生的样本中提取与氯仿/甲醇(1:2)3毫升3 h。样本然后离心机在3000克,5分钟。上层清液都被转移到其他CCL内管4分别和1 M氯化钠1毫升。离心后,获得了较低的有机相,蒸发干燥温和流干下N附近2。同时,样本在100年重组μL甲醇测量天然保湿因子C14C16C24:1C24HPLC-MS / MS。每个神经酰胺水平的物种是由它们的相对丰度归一化到C12神经酰胺和神经酰胺的总值是量化标准曲线的基础上,构建神经酰胺标准(两代情)。这些神经酰胺的生产总值(gdp)是用于统计。
2.4。细胞吸收oxLDL
oxLDL贴上异硫氰酸荧光素(FITC;Biosharp)一个小修改以前描述的方法(47,48]。总之,oxLDL和FITC涨跌互现,孵化37°C 2 h,然后释放FITC被透析对PBS 72 h在4°C。最后,FITC-oxLDL被储存在4°C在黑暗中进一步使用。所有程序都在黑暗中进行。细胞被播种在gelatin-coated玻璃盖玻片24-well文化菜肴和37°C和5%孵化有限公司2。与上面的抑制剂,接受治疗后分别为9 h,细胞然后用50孵化μg / mL FITC-oxLDL 3 h。图像得到40 x荧光显微镜使用的目标。集成的荧光强度测量使用Image-Pro +软件和归一化细胞的数量。
2.5。oxLDL保留在孤立的脐静脉壁
在氧的混合物(95%啊2和5%的公司2)条件下,人类脐静脉环与50孵化μg / mL FITC-oxLDL和各种抑制剂在37°C 3 h (47]。然后组织被冻结和切成薄片的8μm与冷冻切片机(徕卡CM1900)和进一步与DAPI染色。对于每一个光学部分,底膜上方的空间被定义为感兴趣的区域(ROI)。荧光强度量化使用Image-Pro +软件。加权分析,首先确定区域内的荧光ROI每个光学部分的三个荧光强度值范围如下:160年到190年,190年到210年,和210年到230年。这三个区域测量然后乘以1,3或5,分别给领域的最高强度(更大的权重49]。这些加权值被总结为每个光学部分和除以ROI的面积。
2.6。oxLDL Transcytosis
如前所述,oxLDL transcytosis是由一个非放射性测量方法在体外(47,48]。HUVECs被播种的聚酯膜合演transwell(6.5毫米直径,0.4μ孔隙大小),形成综合细胞单层。细胞单层的完整性测试通过前面描述的方法(50]。两个插入细胞层与相等的完整性被分为同一组:分别竞争的非竞争性的插入和插入。抑制剂被添加到每个小组9 h。然后,非竞争性插入与50孵化μg / mL FITC-oxLDL确定的总量transendothelial oxLDL;与50 paracellular运输是由孵化μg / mL FITC-oxLDL和无标号oxLDL(300倍超额μg / mL)在竞争激烈的插入。3 h后,样品被收集到的外室,并进一步对PBS透析去除自由FITC。通过荧光分光光度计的相对荧光测量(Tecan无限F200PRO)激发和发射波长490 nm和520 nm,分别。与此同时,背景荧光由血清Opti-MEM减去从每个样本的价值。的数量oxLDL transcytosis非竞争性的荧光强度的区别是插入和竞争插入。
2.7。皮下oxLDL保留在活的有机体内
动物治疗按照指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院和当地动物保护委员会的批准。健康C57BL / 6 j小鼠(18 - 20 g)购买实验动物中心(同济医科大学,华中科技大学,中国)和维护在一个受控环境的光/暗周期12 h, 20±2°C的温度和湿度50±2%。雄性C57BL / 6 j小鼠被随机分配到6组:治疗组1 - 2收到0.9%生理盐水,组3 - 6人腹腔内(i.p)注射三次myriocin 0.3毫克/公斤/ 5天(天1、3和5)(51),去郁敏20毫克/公斤/天5天,D609 10毫克/公斤12 h在牺牲之前,和一个10毫克/公斤/天5天,分别。C57小鼠组2 - 6是通过尾静脉注射FITC-oxLDL (50μg /鼠标)3 h在牺牲之前,虽然老鼠注射无标号oxLDL(50组1μg /鼠标)。小鼠安乐死,心,脾脏,肝脏迅速在液态氮冷冻。冰冻的心、脾脏和肝脏准备如前所述[49,52]。的部分与DAPI染色。由于主动脉的自发荧光的存在,我们使用不同的荧光强度之间的皮下层,整个船代表FITC-oxLDL荧光强度。每组20部分进行了分析,这代表每主动脉5间隔部分从4老鼠。
2.8。隔离Cavolin-1-Enriched膜筏分数
Caveolae-enriched膜分数是由不用洗涤剂的净化,如前所述[41,53]。隔离膜筏分数从细胞膜,HUVECs细胞溶解在500毫升更易与L Na2有限公司3含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒。细胞提取物均质通过25随后针头与15中风声波降解法15年代三次冰。检测蛋白的浓度在匀浆确保每个组都有等量的蛋白质。最后成交调整2毫升MBS包含25更易与L 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic酸和0.15 mol / L氯化钠,pH值6.5。匀浆调整2毫升90%蔗糖密度梯度介质在MBS与不连续4毫升30%和45%,覆盖4毫升5%蔗糖的MBS缓冲区包含250更易与L Na2有限公司3。样本然后离心机在39000 rpm 18小时在4°C SW 41转子(贝克曼仪器)。总共12分数每毫升仔细收集从上到下。膜raft-associated蛋白质免疫印迹分析,这些分数被寒冷10%三氯乙酸沉淀,用冷丙酮洗净,晾干。蛋白质颗粒被溶解在sds - page裂解缓冲进行免疫印迹分析。
2.9。西方墨点法
分别后细胞抑制剂孵育12 h, caveolin-1浓缩膜分数孤立如上所述,最终西方墨点法标本进行检测。样本的蛋白质sds - page凝胶,然后electrotransferred PVDF膜隔开。随后,墨迹与抗体进行免疫染色Caveolin-1(细胞信号技术,1:800),Cavin-1 (ANBO, 1: 500)和lectin-like oxLDL受体(Lox-1无锡AppTec 1: 1000)。孵化后1 h和peroxidase-conjugated二级抗体(Abbkine, 1: 10000),乐队是可视化的ECL免疫印迹检测系统(NDR,以色列)。乐队强度量化使用ImageJ软件。
2.10。统计分析
所有数据都表示为均值±SEM从至少三个独立的实验。多个组之间的显著差异进行使用方差分析和邓肯的多个测试。的值被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。内源性细胞神经酰胺生产是受神经酰胺代谢酶抑制剂
确定各种抑制剂对神经酰胺代谢的影响,发现神经酰胺浓度的两个方法。代表荧光显微图像和半定量的结果如图1(一)和1 (b)。为进一步确认效果,我们发现神经酰胺HPLC / MS(图1 (c))。结果表明,最高产量研究和DES神经酰胺浓度降低,而D609和一个神经酰胺浓度显著增加。
(一)
(b)
(c)
3.2。FITC-oxLDL Transcytosis跨内皮细胞单层膜
确定抑制剂改变跨HUVECs oxLDL运输的数量,我们的化验oxLDL transcytosis HUVECs。如图2预处理,最高产量研究或DES显著降低oxLDL transcytosis,虽然接触D609或一个显著增加oxLDL transcytosis。这些结果进一步证实了在培养HUVECs oxLDL吸收的观察。自从oxLDL HUVECs吸收的一个中间阶段oxLDL transcytosis HUVECs,它也可能代表的数量oxLDL transcytosis程度。如数据所示3(一个)和3 (b),每个细胞的荧光强度来反映oxLDL吸收的量来衡量。发现的水平oxLDL吸收被最高产量研究抑制或DES,同时升高D609或一个。
(一)
(b)
3.3。oxLDL的内皮下保留在体外
进行了一个实验来测试皮下保留oxLDL是否会改变各种抑制剂的存在。在总结数据4(一)和4 (b),更FITC-oxLDL积累在上述地区D609或一个刺激后的基膜。然而,积累FITC-oxLDL显著减少的最高产量研究或DES。
(一)
(b)
3.4。oxLDL的内皮下保留在活的有机体内
验证oxLDL transcytosis皮下保留,内皮细胞荧光强度从C57小鼠主动脉根部被检测到。小鼠注射无标号oxLDL相比,小鼠注射FITC-oxLDL主动脉显示更强的荧光强度在内皮(图5(一个))。类似于图所示4,空间下内皮与抑制剂治疗组小鼠的主动脉根部积累或多或少的荧光。指出,从最高产量研究主动脉- / DES-treated小鼠荧光在内皮积累很少,而D609 - / NOE-treated小鼠主动脉显示更强的荧光信号。补充图1(见补充材料在网上:http://dx.doi.org/10.1155/2014/823071)没有显示出不同的荧光小鼠的脾脏和肝脏积累在不同的组。
(一)
(b)
3.5。LRs组件相关的表达oxLDL Transcytosis
脂质筏分数像之前描述的那样孤立。Caveolin-1丰富分数(1毫升每个)检测,以确定LRs位置(分数6和7)如图6(一)。如数据所示6 (b)和6 (c),蛋白质的表达参与小窝(caveolin-1和cavin-1)以及形成oxLDL受体(Lox-1)可以由相关的神经酰胺酶的抑制剂。与控制相比,最高产量研究和DES显著降低所有参与oxLDL运输蛋白质的表达,而D609和NOE增加了表情。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
天然保湿因子越来越多地认识到发挥重要作用在动脉粥样硬化的发病机制21,54- - - - - -58]。在目前的研究中,第一次,我们证明了从内部产生神经酰胺在内皮细胞显著贡献的transcytosis oxLDL穿过内皮细胞屏障,促进皮下保留这些氧化脂质,进一步促进动脉粥样硬化的进展。
低密度脂蛋白本身是一个球形纳米颗粒组成的脂质分子apoB100包围,介导的分子识别的低密度脂蛋白受体。相比其他类型的脂蛋白,低密度脂蛋白包含更多的鞘脂类和胆固醇和抗洗涤剂在低温下的属性(7]。先前的报道表明等离子体鞘脂类水平升高在[59),指向神经酰胺的重要性。但天然保湿因子如何影响动脉粥样化形成还有待进一步阐明。
通过免疫染色和HPLC-MS分析,我们首先确认多个酶的抑制剂的抑制效应参与神经酰胺代谢。我们发现两个新创神经酰胺合成抑制剂、myriocin和酸性鞘磷脂酶抑制剂,去郁敏,可以降低神经酰胺的生产。然而,ceramidase抑制剂、耐温和鞘磷脂合成酶抑制剂,D609,显著调节神经酰胺的生产。
在一个既定的在体外模型oxLDL transcytosis跨内皮细胞单层,我们证明,myriocin和去郁敏减少了transcytosis oxLDL;然而,诺伊和D609显著加速了transcytosis oxLDL跨内皮细胞。在这个模型中,我们使用了不同的荧光之间的控制和竞争的插入,代表总oxLDL paracellular运输,分别反映的transcytosis oxLDL跨内皮细胞。该方法检测transcytosis已经被先前的研究验证(47,48]。transcytosis的改变引起的各种抑制剂在当下研究一致性的改变细胞内神经酰胺生产,强烈表明从内部产生神经酰胺促进transcytosis oxLDL跨内皮细胞。为oxLDL跨内皮细胞,transcytosed oxLDL粒子必须内源性的腔面内皮细胞,然后被转移到基底外侧和进一步被胞吐到皮下空间。在这个过程中,一个中间状态transcytosis是这些粒子已经内源性细胞溶质但还没有被释放。因此,细胞内的浓度oxLDL粒子也反映出transcytosis的活动。myriocin oxLDL粒子的减少和去郁敏细胞治疗,而oxLDL粒子的增加一个和D609内皮细胞治疗,进一步支持神经酰胺的促进作用在调节oxLDL transcytosis。在孤立的血管的准备,当脐动脉段孵化了fluorescence-labeled oxLDL粒子,这些粒子可以运送到了皮下血管壁的空间。Myriocin去郁敏,抑制细胞内神经酰胺的生产,也减少了oxLDL的皮下保留。亦然,耐温和D609调节神经酰胺水平,增加了皮下oxLDL滞留在血管壁。
进一步证实了这些影响在活的有机体内层面上,我们也进行了动物实验。类似的观察培养的内皮细胞和孤立的血管段,两个抑制剂,myriocin去郁敏,抑制神经酰胺的生产,减毒鼠主动脉壁oxLDL的积累。然而,耐温和D609刺激神经酰胺生产,增强血管壁的皮下保留oxLDL。
低密度脂蛋白的氧化修饰后,生成oxLDL,鞘磷脂的水解率是天真的低密度脂蛋白(5 - 6倍60];神经酰胺水平oxLDL粒子在等离子体损伤是神经酰胺水平的10 - 50倍自然低密度脂蛋白(61年]。我们的结果与几个观测一致性在以前的报告。Devlin厘米报道,ASM的发病机制中起着非常重要的作用。病变在双gene-deficient老鼠杂交的ASM淘汰赛Asm−−/老鼠和载脂蛋白E基因敲除Apoe−−/老鼠比在小得多的Apoe−−/老鼠(49]。Loidl等人报道,磷脂改性氧化低密度脂蛋白激活细胞内ASM [62年]。这些观察结果也强烈支持的重要作用神经酰胺在动脉粥样硬化的形成。然而,麦戈文等人报道,患者患有尼曼疾病类型A和B在ASM活动缺乏低高密度脂蛋白和低密度脂蛋白升高血浆和冠状动脉粥样硬化的发生率很高63年]。这场争论可能是由于不同的角色ASM的脂质在肝脏和脂蛋白代谢保留在血管壁。一方面,ASM似乎是至关重要的维持正常的低密度脂蛋白VLDL代谢通路。ASM缺乏尼曼氏疾病导致的血浆低密度脂蛋白和高密度脂蛋白减少,建立了动脉粥样硬化的危险因素。另一方面,ASM可以直接促进脂蛋白颗粒的保留到皮下血管壁的空间,促进动脉粥样硬化的进展。我们的研究着重于ASM在血管壁的第二个方面。这非常类似于角色的低密度脂蛋白受体(LDLR)在动脉粥样硬化。一方面,LDLR调节低密度脂蛋白在血管壁的保留和促进的发病率(64年,65年]。另一方面,Ldlr−−/老鼠表现出典型的hypercholesterol和更脆弱的动脉粥样硬化(66年,67年]。李等人最近的一篇论文表明,溶酶体的控制人口贩卖和融合ASM是至关重要的正常冠状动脉平滑肌细胞自噬流量(68年]。基本上,毫无疑问,ASM在生理条件下是有益的,但是,在慢性病理条件下如动脉粥样硬化、ASM活动持续调节,将反过来推动疾病的进展49,69年]。在这种情况下,抑制ASM活动治疗可能是正确的策略。
我们还初步研究了机制为什么神经酰胺oxLDL transcytosis做出了贡献。基本上,oxLDL transcytosis内皮细胞介导的受体,Lox-1 [70年,71年),以及其他许多重要蛋白质参与内吞作用或胞外分泌,包括小凹结构蛋白质,caveolin-1 [71年,72年],小窝蛋白有关,cavin-1 [72年,73年]。Lox-1和caveolin-1都居住在内皮细胞的膜筏域。Cavin-1还结合caveolin-1有助于维持小窝的完整性。自天然保湿因子比鞘磷脂极性更小,这些疏水脂质更准备同时保险丝和导致膜筏结构的完整性30.),这将促进脂质raft-dependent transcytosis。我们研究了神经酰胺能否改变这些的表情oxLDL transcytosis-related蛋白质膜筏。我们发现Lox-1的表情,caveolin-1, cavin-1膜筏域也明显受神经酰胺代谢酶抑制剂。DES和最高产量研究Lox-1的表达减少,caveolin-1, cavin-1膜筏。而诺和D609调节这些蛋白质的表达膜筏。我们的观察部分解释神经酰胺的关键作用的transcytosis oxLDL跨内皮细胞。一些以前的研究也表明,oxLDL诱导脂质筏集群在人类冠状动脉内皮细胞(74年)和Lox-1增加脂质筏oxLDL治疗后(53]。脂质筏(oxLDL也会影响神经酰胺生产74年,75年]。这些观察暗示oxLDL本身也可能引起信号来促进自己的transcytosis,这将形成一个反馈机制和放大transcytosis过程。
集体,在体外和在活的有机体内本研究提供的证据强烈指向一个结论:氧化低密度脂蛋白,oxLDL,能够交通跨内皮屏障通过transcytosis和这些过程是高度受细胞内神经酰胺。内源性神经酰胺明显促进transcytosis oxLDL跨内皮细胞。因此,新颖的化合物设计通过针对操纵神经酰胺生产的代谢相关的酶可能提供小说atherosclerosis-related障碍的预防或治疗的策略。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
文晶李和杨小燕了同样的工作。
确认
本研究支持由中国国家自然科学基金(81072634,81072634,81072634,30870997)和中国教育部的资助(2013 ygyl008 ncet - 10 - 0409,和2011 ts069)。
补充材料
2.7中描述的方法,冷冻的脾脏和肝脏从每组准备。没有显著差异群体之间的荧光。