文摘

骨折近端股骨骨折,一个典型的老人,常与发病率,降低生活质量,身体功能受损和增加死亡率。存在的证据表明,反应骨折造血微环境的改变与年龄。因此,我们研究了氧化应激标记和氧化应激相关MAPK在粒细胞激活年轻人和老年人有或没有长骨头骨折。脂质过氧化水平增加老年人控制和病人。粒细胞岁对氧化应激诱导损伤更敏感比年轻的粒细胞。这可能是由于基底SOD-1在老年人中表达增加,并没有进一步引起骨折,年轻患者中观察到。这可能是由于一个改变MAPK激活。在年龄粒细胞基底p38和物活动增加,基底ERK1/2活动减少。骨折后,物活动减少,而ERK1/2和p38活动增加了在两个年龄组。控制与HL60细胞实验显示观察p38激活强烈依赖于年龄。 Summarizing, we observed age-dependent changes in the oxidative stress response system of granulocytes after fractures, for example, altered MAPK activation and SOD-1 expression. This makes aged granulocytes vulnerable to the stress stimuli of the fracture and following surgery.

1。介绍

骨折近端股骨骨折是一种典型的老年人经常表现出较低的骨密度,喜欢,例如,骨量减少及骨质疏松症,肌肉萎缩(1]。世界各地,每年大约有260万患者患髋部骨折。由于预期的人口变化,这个数字预计将在40年里翻了一番(2,3]。尽管关于手术的主要进展,髋部骨折仍然是一个主要公共卫生问题。高术后并发症率影响的一般结果以及生活质量并导致高成本的医疗保健系统(2,4]。然而,人们很少知道影响病人的恢复机制。

骨物质的微体系结构的变化和损失可能呈现更加复杂和外科治疗骨折延迟愈合由于不平衡的成骨细胞和破骨细胞的功能。然而,这些负面影响骨重塑不提供足够的解释的术后并发症在老年患者髋部骨折尤其是后(5]。发病率和死亡率的增加,例如,由于感染,在这个小组的患者更有可能由于系统性变化的负面影响在复苏6]。循环细胞免疫系统的直接接触造成的压力刺激骨折,手术后。因此,一般情况下他们应该能够应对外部压力直接信号。在老年患者,这些反应可能受损的免疫系统的变化。

粒细胞和单核细胞巨噬细胞构成的第一线防御细菌感染。创伤后,几分钟内中性粒细胞迁移到损伤的部位,在增殖蛋白激酶(MAPK)信号发生在粒细胞作为细胞外刺激伴随的环境影响细胞的功能,像,例如,增殖,分化或凋亡[7,8]。

MAPKs被报道参与这些过程是物,ERK1/2, p38 [9- - - - - -16]。这些MAPKs都直接受到氧化应激刺激(7,9]。他们的激活可能诱发细胞防御机制,例如,抗氧化的表达酶超氧化物歧化酶(SOD-1),直接消除活性氧(ROS)催化超氧化物歧化作用的过氧化氢和氧气分子(17]。

因此,本研究的目的在于调查氧化应激水平,氧化应激诱导毒性,及相关MAPK在粒细胞激活年轻(< 50岁)和老年(> 65岁)长骨头骨折患者和健康对照组。这个比较应该使我们得出结论粒细胞的压力变化的反应刺激骨折,手术后的年轻和年老的病人。

2。材料和方法

磷酸缓冲盐、胎牛血清和RPMI1640买来PAA实验室GmbH(派斯克、奥地利)。完整的蛋白酶抑制剂是来自罗氏(德国曼海姆)。所有其他化学物质都是购自σ(德国慕尼黑)。

2.1。道德声明

取血样进行符合赫尔辛基宣言(1964)及其修正案。研究协议是经医院伦理委员会批准和知情同意是获得所有科目。慢性疾病患者并不包括在这项研究。

2.2。样本人口

45毫升静脉血(36毫升EDTA(乙二胺四乙酸)和9毫升血血清血)收集从每个病人。两个不同的年龄组进行了研究:年轻患者年龄小于50岁和超过65岁的老年病人。在这两个年龄段,我们区分健康控制和长骨头骨折患者。研究人群包括22个年轻健康对照组(YH), 23日老健康对照组(哦),12个年轻患者(YF)和19个老病人(的)。在两组患者中,进行血液取样后6 h内骨折的手术复位的长骨头的下肢。人口统计数据总结表1。

2.3。粒细胞隔离

粒细胞被孤立的mac(磁性细胞分离)使用CD15磁性微根据制造商的指示(Miltenyi研究,科隆,德国)或通过密度梯度离心法如[18]。后立即隔离,粒细胞细胞溶解了免疫印迹分析。细胞纯度超过95%是通过流式细胞术进行评估。

2.4。HL60细胞培养

1640年RMPI HL60粒细胞细胞扩大中含10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C和5%的公司₂。对成熟培养基补充1%二甲亚砜。在实验之前,这些细胞被serum-starved过夜。1 h与培养基含有10%血清刺激后从年轻和年老的病人和控制,细胞免疫印迹分析细胞溶解。

2.5。脂质过氧化作用的量化评估氧化应激水平

为了测量氧化应激,脂质过氧化决心通过丙二醛测定。简单地说,15μL血清与45孵化μL硫代巴比土酸溶液(0.33%硫代巴比土酸在11.1%乙酸)1 h在100°C。样本用蒸馏水稀释和荧光测量立即激发/发射波长的544/590 nm。已知浓度的1,1,3,3-tetraethoxypropane被用作一个标准的控制。

2.6。生存能力测量

细胞的生存能力是由刃天青转换。简单地说,细胞(~ 7 * 10⁵细胞/ H)与不同浓度的刺激₂O₂(0,0.002,0.004,0.008,0.016,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1%)。1/10体积的0.025% (w / v)刃天青解决方案(在磷酸缓冲盐)添加到细胞中。在37°C 1 h孵化后荧光测量(前/ em = 544/590 nm)和纠正背景控制(无电池)。给出了可行性的%未经处理的控制。

2.7。免疫印迹分析

刚做好的冰冷的里帕缓冲细胞细胞溶解(50毫米三(羟甲基)-aminomethan, 250毫米氯化钠,Nonidet-P40 2%, 2.5毫米EDTA, 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸0.5%,蛋白酶和磷酸酶抑制剂,pH = 7.2)。蛋白质含量是由micro-Lowry [19]。30到50μg总蛋白质是由sds - page分离和转移到硝化纤维素膜(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)。未指明的结合位点被封锁在TBST 5%牛血清白蛋白溶液(25毫米三(羟甲基)-aminomethan, 137毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,0.05% Tween-20, pH = 7.4)的1 h rt,隔夜孵化后主要抗体(美国贝弗利细胞信号)稀释1:1000年TBST在4°C,膜被孵化与相应的辣根peroxidase-labeled二级抗体(TBST 1: 10000)为2 h rt,化学发光信号检测与x射线电影或电荷耦合器件相机(CCD相机)。为了比较具体的信号在不同的屁股,一个统一的积极控制(HEK293T细胞)包括对于每个膜。信号强度测定微使用ImageJ软件(美国贝塞斯达国立卫生研究院)和归一化到相应GAPDH信号。

2.8。统计数据

在实验装置流程图如图1。结果表示为±SEM。捐赠者的数量()和复制(每个实验)分别给出。数据集比较单向方差分析或学生的以及(GraphPad棱镜软件,LaJolla、钙、美国)。是作为最低水平的意义。

3所示。结果

3.1。老年人表现出增加脂质过氧化水平代表氧化应激水平升高

为了确定在捐助者的氧化应激水平,血清中的脂质过氧化(/组,)测量。年长的基底脂质过氧化水平控制大约两倍的年轻的控件()。有趣的是,骨折发生后显著增加约25%的脂质过氧化作用是只发现在老年患者。年轻的长骨骨折患者脂质过氧化(图没有显示出统计增加2(一个))。

3.2。生存能力的测量表明,在粒细胞对H更敏感₂O₂诱导毒性比年轻的粒细胞

为了调查是否增加氧化应激影响粒细胞的可行性,我们从年轻的和年长的控制各种刺激粒细胞浓度的H₂O₂(0,0.002,0.004,0.008,0.016,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1%)。1 h可行性评估后刃天青转换。从老年人控制粒细胞(,对H)更为敏感₂O₂诱导毒性比从年轻的控件(粒细胞,),由一个电子商务₅₀分别为0.09%和0.18%,()(图2 (b))。

3.3。改变SOD-1表达年龄粒细胞是检测到免疫印迹分析

为了研究为什么强烈氧化应激影响粒细胞岁我们调查SOD-1表达水平的免疫印迹(图3)。光密度分析表明SOD-1的基础表达水平明显升高(2.2倍)以上控制相比,年轻的控制。创伤和手术后后,SOD-1水平显著增加的年轻患者(2.7倍)。有趣的是,在老年患者中,基底的表达水平升高SOD-1创伤和手术后后没有进一步增加。

3.4。改变MAPKs粒细胞激活的老年人被免疫印迹分析

为了调查是否增加氧化应激可能影响粒细胞的应激反应,我们研究了活化(磷酸化)MAPKs p38, ERK1/2,通过免疫印迹(图物4(一))。基底激活p38增加4.5倍老年控制比年轻的控制。骨折的发生后,显著增加(2.5倍)p38激活只在老年病人被观察到。然而在年轻患者,人们活动的增加不显著,没有达到基础水平的控制(图4 (b))。相反,基底激活ERK1/2信号明显减少(大约40%)老年控制。骨折后,ERK1/2激活只在年轻患者进一步下降约30%(图4 (c))。类似于p38激活,基底物激活显著增加(1.9倍)老年控制相比,年轻的控制。长骨头的断裂后,phospho-JNK水平在两组降低更明显下降的老年人(图4 (d))。

3.5。免疫印迹分析显示血清刺激的逆p38激活HL60细胞粒细胞相比

为了分析是否激活MAPKs粒细胞所观察到的是年龄相关性或观察到的变化引起的细胞微环境(血清),三个MAPKs成熟HL60细胞的激活(被认为具有相同的年龄)培养病人的血清的存在是调查(图5(一个))。与粒细胞相反,基底激活p38 HL60细胞减少(大约30%)的刺激与老年人血清控制相比,HL60细胞和血清刺激年轻的控制。HL60细胞刺激病人的血清明显下降(2.5倍)p38激活只在年轻组(图5 (b))。类似于粒细胞,基底激活ERK1/2信号明显减少,约60%,在HL60细胞刺激老年人血清的控制。在两个年龄组激活ERK1/2 HL60细胞减少刺激患者的血清和刺激控制血清(图5 (c))。相反粒细胞,基底物激活明显减少,50%,在HL60细胞刺激血清的老年人相比控制与控制血清刺激。phospho-JNK水平进一步降低HL60细胞刺激病人的血清,年轻组下降更明显(图5 (d))。

4所示。讨论

髋部骨折是一个典型的老年人骨折及其风险直接与骨密度和骨强度20.,21]。因此,面对当前人口变化与越来越多的老年人髋部骨折的治疗是一个重要的公共卫生系统问题(3,4]。尽管外科手术的进步在过去的几年中,髋部骨折仍然伴随着高并发症发生率,因此通过增加残疾,发病率和死亡率。而三分之一的病人需要更高层次的长期护理,住院死亡率占近10%,一年期死亡率占27%22]。这高并发症率可能是由于改变老年人的免疫系统,使这些患者容易感染。粒细胞的一线抗细菌感染。循环免疫细胞,因此它们是直接暴露在压力产生的刺激骨折和骨折手术固定。因此,这个项目的目的在于调查粒细胞的应激反应获得年轻(< 50岁)和老年(> 65岁)骨折的患者的一个长骨头。两年龄组健康人群作为对照组。

年长的血清控制氧化应激增加,由增加脂质过氧化水平,观察。ROS,尤其是超氧化物及其衍生物诱导氧化损伤的积累在细胞内大分子,包括蛋白质、脂类、和DNA,从而最终导致衰老和细胞死亡(23,24]。发生后的骨折和骨的手术复位后,脂质过氧化水平增加老年人群体。有趣的是,在年轻患者中,氧化应激的水平并没有显著增加后骨折的发生。这个观察表明,年轻患者能够积极减少过量的活性氧,活性氧和氮(ROI和RNI)作为中介,例如,通过表达抗氧化酵素。这是由我们的发现对H粒细胞岁更敏感₂O₂从年轻的控制比粒细胞诱导细胞损伤。SOD-1是一种自由基清除剂,被认为作为第一道防线对氧化损伤的催化转化超氧化物自由基过氧化氢,然后可以减少水(25,26]。粒细胞的老年人控制,我们观察到基底SOD-1水平增加。增加基底SOD-1水平可能是骨折后最多,不能进一步升高。骨折的发生后,SOD-1水平显著增加只在年轻病人。这些发现证实了氧化应激理论由哈曼衰老,他预测之间的不平衡形成的氧化应激和抗氧化防御机制导致氧化损伤不断累积的各种大分子的(27]。

氧化应激的增加反过来会影响循环免疫细胞直接暴露在刺激。几分钟内粒细胞迁移到受伤的网站。特别是MAPKs物、p38和ERK1/2直接受到氧化应激刺激这些细胞(7,9]。

基底p38信号增加粒细胞的年长的控制。骨折的发生后,观察p38的相当大的感应信号只在老年患者。激活后,p38发起一个信号级联调节的合成多种促炎介质,如肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)[28),提高老年患者的血清和控制。基底物信号是提高老年人控制以类似的方式的信号。然而,骨折发生后,激活物下降的年轻人和老年人。据报道,急性和瞬时激活物诱导细胞增殖和生存,而长期和持续的激活物可以促进细胞凋亡(29日)这是由TNF -α和活性氧30.)在老年患者和控制都是高架。p38和物信号相反,基底ERK1/2信号显著低于老年人比年轻的控制。骨折的发生后,ERK1/2信号在年轻患者明显低于年轻的控制。然而,在老年人中,这种差异之间的病人和ERK1/2的控制信号要小得多。这些发现支持Schieven的工作,它表明,活跃p38信号可能抑制ERK1/2信号(28]。这尤其重要,因为拉和同事能够证明功能ERK1/2信号能够抑制粒细胞凋亡诱导的集落刺激因子(gm - csf) (31日]。因此,老年人有更高的粒细胞对细胞凋亡的gm - csf水平升高由于ERK1/2信号受损。由于他们在粒细胞凋亡率增加,老年患者更敏感比年轻患者创伤后感染。

为了研究MAPK信号传导中的观察到的改变是否年龄相关性或由于观察到微环境的变化(细胞因子、趋化因子和氧化应激刺激),我们刺激HL60粒细胞(被认为具有相同的年龄)患者的血清和调查MAPKs的激活。ERK1/2和物信号减少老年患者骨折后,进一步控制和降低类似地的数量控制。然而,与粒细胞的数量,基底p38信号降低老年人骨折后进一步控制和降低。这个观察表明,p38信号是特别容易与年龄相关的变化。的发现p38信号的粒细胞升高老年病人尤其有趣的最近的研究已经证明,它起着关键作用的持续疼痛敏感通过神经元和神经胶质机制(32- - - - - -34]。缓解疼痛、手术前后的首要任务之一是髋部骨折的患者,适当的疼痛控制可以减少并发症,像,例如,心血管疾病和恢复移动(6]。

5。总结

总之,我们的数据显示,老年患者的氧化应激水平增加和控制。强大的upregulation SOD-1在骨折后粒细胞表明年轻患者能够积极减少ROS, ROI, RNI,而在老年病人,SOD-1表达似乎已经达到限制在一个正常的状态。这可能说明年龄粒细胞反应更敏感比年轻的粒细胞对氧化应激引起的损害。激活的MAPKs粒细胞表明,年轻和年老粒细胞对氧化应激刺激的反应也不同。p38尤其年龄相关的。ERK1/2以及物信号的转变可能使粒细胞的老年人对氧化应激刺激造成的损害。

6。结论

我们的数据表明,平衡抗氧化反应粒细胞老年病人可能保护他们免受额外压力的刺激,例如,骨折和后操作。据报道,饮食中富含类黄酮诱导抗氧化的酶的表达在不同的细胞类型(35- - - - - -38]。然而,这种诱导抗氧化的酶的表达只能达到,类黄酮被高剂量时在很长一段时间。这甚至可能提高骨质量,从而降低骨折风险,与老鼠研究视黄段骨质流失从Orsolic和同事建议38]。然而,在从第一压力刺激骨折病人已经发生。因此,诊所治疗只能预防第二压力刺激从以下操作,例如,通过使用药物具有较强的抗氧化性能,可以应用于定义剂量(35]。有第一次正面报道应用这一策略防止器官损伤腹部手术后(39,40]。然而,如果这种治疗也可以保护免疫细胞必须控制临床试验进一步评估。

缩写

ERK1/2:	细胞外signal-regulated激酶1和2
gm - csf:	集落刺激因子
物:	c-Jun n端激酶
mac:	磁性细胞分离
MAPK:	增殖蛋白激酶
RNI:	活性氮中间体
投资回报:	活性氧中间体
ROS:	活性氧
SOD-1:	超氧化物歧化酶1
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子α。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

庸,塞布丽娜Ehnert Florian吉哈德,海伦背心,安德里亚斯·k尼塞尔同样对本文亦有贡献

确认

我们要感谢安吉拉Wottge Patrysya Lacorte优秀的技术援助。目前的工作是费森尤斯公司基金会支持的项目没有。A116)。庸王得到了中国学术委员会和b·布劳恩的基础。