文摘
氧化应激的作用在不同的评估主动脉病。32组织样本从18岁男性和14个女性被分为:4控制(C)科目,11系统性动脉高血压患者(SAH), 4变种的马方氏综合征(MV), 9与马方氏综合征(M), 2与特纳氏综合征,2人巨细胞病毒感染与(TA)。主动脉片段均质。Lipoperoxidation(法律流程外包),铜-锌和锰超氧化物歧化酶(Mn和Cu-Zn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S-transferase(销售税),内皮一氧化氮合酶(以挪士)、硝酸盐和亚硝酸盐(/)、和IV型胶原蛋白和层粘连蛋白进行了评估。有增加Mn在SAH Cu-Zn-SOD活动,MV, M,特纳氏综合征。还有猫活动增加M和特纳综合症。GPx和GST活性下降和提供法律服务外包的增加在所有组。以挪士在SAH下降,MV, M和/增加在SAH和助教。IV型胶原蛋白是减少特纳综合症和助教。层粘连蛋白1 MV和增加m .总之,减少氧化应激的相同点和不同点在不同的主动脉病研究发现包括与动脉瘤的病理改变SOD, CAT, GPx,销售税,以挪士活动修改皮下基底膜蛋白质。
1。介绍
氧化应激是由一个失衡的生产活性氧(ROS)和生物系统的抗氧化能力。它需要快速解毒的中级反应物或修复的损害,它改变了基本流程可能成为生物起源的组织损伤(1- - - - - -3]。
主动脉疾病,具有收缩功能的丧失和endothelium-mediated放松,与氧化应激有关,血管功能障碍(4- - - - - -6]。此外,船变换的机械性能7),导致假动脉瘤或动脉瘤形成,阻碍或破坏的船8,9]。尽管主动脉损伤的起源可能是多因素疾病,分子氧可能在血管紧张性扮演关键角色,心脏收缩性,和其他参数。分子氧参与活性氧创世纪和/或可引起不可逆的损害,甚至死亡。然而,它也可以产生有益的作用,参与细胞信号过程(10]。氧化应激参与了心血管疾病(2,11,12),如心律失常、冠状动脉疾病、左心室肥大、主动脉扩张、主动脉夹层、充血性心力衰竭。活性氧和活性氮物种(RNS)生产的这些疾病通过不同的途径,如线粒体黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶(Nox)。内皮一氧化氮合酶(以挪士)也在其中扮演相关角色(13- - - - - -24]。
结构和功能损害存在于主动脉壁在不同的人类疾病如高血压(SAH)、动脉粥样硬化、(TA),人巨细胞病毒特纳氏综合征,马方氏综合征(M)和它的变体(MV) [25- - - - - -28]。,主动脉损伤、狭窄、闭塞、动脉瘤或假性动脉瘤(29日- - - - - -31日),而内皮功能障碍(32- - - - - -34)已被描述。这些发现已经独立地描述每个疾病都有一个特定的遗传背景,出现在不同年龄和不同性别的主题和暴露于不同的环境,如感染或创伤。然而,他们都需要类似的手术治疗(35]。
氧化应激的作用在主动脉损伤进展在某些病态已经描述(7,36];然而,在其他人体组织稀缺(37,38]。因此,研究氧化应激和抗氧化剂在主动脉主动脉损伤患者是有道理的。
本文的目的是评估氧化应激的作用在人类主动脉从不同疾病患者主动脉损伤。组织通过选择性外科手术或紧急情况。我们也评估皮下基底膜蛋白质。
2。材料和方法
2.1。病人
18岁男性和14个女性在我们的机构和人遇到了一个外科手术的标准选择性或紧急手术,本陶和波诺的方法39)包含在连续的方式尽快主动脉根部扩张(> 50毫米)被计算机断层扫描血管造影证实。
收集的样本来自患者M,根特的分类标准(1996年40),助教诊断标准的美国风湿病学院(ACR) (41)和高血压(SAH)和特纳综合征患者(42]。一旦病人满足入选标准他们经历了全面的临床检查来确定自己的心脏病理。结果进行了分析,提出在临床和病理会议,心血管专家评估手术治疗的风险和益处。受试者术前协议,提交包括凝血试验、x射线、心电图、麻醉评估和个性化的医疗干预。例谨慎处理,避免与抗氧化剂包括病人进行治疗,别嘌呤醇,或可能的抑制剂通路参与活性氧的生产。阿司匹林、华法林、氯吡格雷和其他抗血小板或抗凝药物被停职。控制组织从主动脉瓣狭窄患者接受了手术,没有综合征的病理诊断,在没有谁怀疑炎性疾病如助教或动脉粥样硬化和退化性疾病,如糖尿病,高血压,甲状腺,或自身免疫性疾病。手术进行隐含替换主动脉瓣和有必要执行成形术或切除的主动脉瓣膜区周围的组织。对照组被心脏病专家评估手术之前,风湿病学家来验证上述疾病没有现在和常规实验室检测是确定急性期反应物,甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇。另外通过超声心动图形象研究,电脑断层摄影术或磁共振研究抛弃主动脉损伤其他瓣膜损害。 None of the control subjects was taking anti-inflammatory drugs or statins. The research protocol was approved by the Research and Ethics Committee of our institution (Institutional protocol number: 09654). Informed consent of patients and controls was obtained for the anesthetic procedure and surgery and to obtain a tissue sample, according to the Declaration of Helsinki [43]。一旦手术,组织置于液氮,保持在−70°C到使用。
2.2。胸主动脉均化
样本从胸主动脉被均质化在液态氮,这是与蔗糖溶液混合的蛋白酶抑制剂(1毫米PMSF, 2μM抑肽素A, 2μ米亮抑酶肽,0.1%抑肽酶),准备一直在冰上。胸主动脉匀浆是离心机10分钟在4°C。上层清液分离,保持在−直到需要70°C。蛋白质浓度在胸主动脉匀浆是由洛瑞的方法等。44]。
2.3。免疫荧光
3毫米的主动脉部分很快就被冻结在Tissue-Tek(樱花Finetek美国公司,托兰斯,CA)。部分与丙酮固定叠氮化和阻塞了PBS / 0.02% / 1% BSA持续30分钟。
随后,在室温下2小时后留下了这些部分的兔多克隆抗体对IV型胶原蛋白(1:20),纤连蛋白、层粘连蛋白-γ1,进气阀打开,以挪士(1:50;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA)。主要抗体检测与山羊、anti-rabbit FITC(杰克逊ImmunoResearch实验室Inc .)、西树林,PA),在室温下60分钟。消极的控制由替换主抗体抗体无关。免疫荧光检查使用荧光显微镜(Eclipse TE2000-U尼康,尼康数码视觉室D5-U3)。图像处理SigmaScan职业计划,图像分析5.0.0版本,1987 - 1999 SPSS . n:行情)。
2.4。Lipoperoxidation(法律流程外包)
法律流程外包,自由基损伤的标志,是衡量一个标准方法(45]。一毫克的蛋白质从胸主动脉匀浆使用。
2.5。超氧化物歧化酶(SOD)的活性
SOD酶活性测定的胸主动脉匀浆nondenaturing凝胶电泳和氮蓝四唑染色法描述Flohe和不46]。60μ使用g的胸主动脉匀浆。SOD活性5600单位/毫克,计算以下描述的技术,佩雷斯et al。45]。核黄素和tem的紫外线和氧气产生活性氧;氮蓝四唑和SOD与他们竞争。SOD存在,这种凝胶是透明的,而减少氮蓝四唑把它变成紫蓝色。
2.6。过氧化氢酶(CAT)活性
60μ分析了g的胸主动脉匀浆native-gel电泳有8%聚丙烯酰胺(47]。蛋白质猫活动25000单位/毫克,计算描述的技术由佩雷斯et al。45]。分析了猫和SOD的凝胶微通过图像分析仪SigmaScan职业计划,图像分析5.0.0版本,1987 - 1999年SPSS。
2.7。测定谷胱甘肽S-Transferase (GST)
胞质销售税的具体活动决心spectrophotometrically布特勒在340 nm的方法(48]。100年μ使用g从主动脉匀浆/样品。销售税的具体活动表达在微摩尔CDNB-GSH共轭形成/分钟/毫克的蛋白质。
2.8。测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)
酶GPx活性测定在340 nm spectrophotometrically Flohe和Gunzler[的方法49]。100年μ使用g从主动脉匀浆/样品。
2.9。硝酸盐和亚硝酸盐
硝酸盐和亚硝酸盐测定spectrophotometrically在540 nm佩雷斯等描述的方法。45]。100毫克的蛋白质从主动脉匀浆用/样品。
2.10。免疫印迹
100年μ使用g从主动脉匀浆/样品。根据描述的方法进行了免疫印迹佩雷斯et al。45]。稀释的1/500的兔子主要免疫球蛋白g多克隆抗体以挪士,进气阀打开,层粘连蛋白-γ1,COL4A2 (NOS3兔抗体免疫球蛋白[C-20]: sc - 654, NOS2兔抗体免疫球蛋白[C-19]: sc - 649,层粘连蛋白-γ1抗体兔免疫球蛋白(h - 190): sc - 5584和COL4A2兔免疫球蛋白抗体[N-14]: sc - 70244;圣克鲁斯生物技术有限公司)是使用。
2.11。统计分析
一个描述性的分析。单变量测试包括年龄、性别、病理类型和变量,并分成两个的名义变量被描述为相对频率(百分比)和卡方分布或确切概率法相比,方便。双变量分析,连续定量变量的正态分布进行了比较t学生,由Mann-Whitney和非参数的U测试。
3所示。结果
3.1。一般特征
的32名患者中,14是女性,18人。病人的人口特征如表所示1和临床数据如表所示2。
测量是由个人和他们分组后进行分析。
3.2。Lipoperoxidation
从SAH患者主动脉组织,MV, M,特纳氏综合征,TA显示显著增加法律流程外包(相比),C(图1)。
3.3。抗氧化酶的活性
在SAH, MV, M,特纳氏综合征,主动脉显示Mn-SOD活动的增加和Cu-Zn-SOD ()相比,C对象(数据2(一个)和2 (b))。猫活动增加M和特纳综合征患者((图)相比,C课程3)。图4(一)显示了在SAH GPx活动,MV, M,特纳氏综合征,TA患者显著增加()相比,C。图4 (b)显示在SAH消费税活动,MV, M,特纳氏综合征,助教。它是在这些组显著增加()相比,C。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.4。内皮一氧化氮合酶和没有3−/不2−
SAH患者、MV和M,以挪士表达升高((图)相比,C课程5(a))。/显著增加在SAH和助教((图)相比,C课程5(b))。
3.5。蛋白质结构和功能的变化
图6(一)显示了IV型胶原蛋白的定位患者的主动脉。减少IV型胶原在特纳氏综合征和助教()相比,C。纤连蛋白并没有显示任何团体(结果未显示)的变化。图6 (b)结果表明,层粘连蛋白-γ1 M患者主动脉MV的减少而增加()相比,C。
(一)
(b)
3.6。诱导一氧化氮合酶
在SAH患者,MV, M,特纳综合症和TA伊诺表达升高((图)相比,C课程7)。
3.7。免疫印迹
图8显示以挪士,进气阀打开,IV型胶原蛋白和层粘连蛋白-γ1的表达在均质主动脉病的患者的主动脉。以挪士,进气阀打开,IV型胶原蛋白和层粘连蛋白-γ1的表达显示相同的趋势免疫荧光的一个发现。
4所示。讨论
氧化应激和炎症过程的机制可能产生血管畸形是未知的。在本文中,我们研究了不同抗氧化酶的活性和蛋白质结构和功能在一些疾病的血管功能障碍和力学性能改变,导致假性动脉瘤/动脉瘤或阻塞。患者的疾病使得有必要接受手术。ROS的确切来源和RNS这些疾病的病理生理途径还没有清楚地描述。
ROS和法律事务外包导致DNA氧化损伤和高水平的8-iso -前列腺素(8 - iso-PGF2α)在原发性高血压患者50]。血清的TA患者显示了一个类似的趋势(51]。ROS在主动脉损伤的发病和进展被描述在不同疾病的动物模型52)和ROS是重要的炎症介质的信号通路和动脉粥样硬化形成中的作用[53,54]。prooxidative剂和抗氧化剂之间的失衡会导致氧化还原状态的变化。小鼠模型M在胸主动脉血管舒缩功能障碍与氧化应激有关,与以挪士的增加和减少生产锰,Cu-Zn-SOD [4,55]。我们的结果显示增加Mn-SOD和Cu-Zn-SOD活动在SAH, MV, M,特纳氏综合征。表达和活动增加发现表明,由于氧化应激增加,病人的抗氧化系统中也是为了抵消不平衡。血管保护的亚型的表达和活动SOD在血管壁评估在小鼠模型,发现SOD不足或过剩[56]。血管通透性增加或缺血后再灌注损伤与SOD不足有关,和超表达的Cu-Zn-SOD预防再灌注损伤(57]。还有,胞质和胞外SOD表达改变可能影响血管和其他组织结构,因为他们抑制血管和心肌肥厚58]。
SOD作为抗氧化剂在不同疾病的有益功能(59)在动物模型和患者有或没有一个活跃的炎性疾病被描述(60]。诱导炎症的机制可能通过不同的刺激和受体其中1型血管紧张素受体似乎发挥重要作用[61年]。我们的结果显示增加Mn - Cu-Zn-SOD酶活性在SAH, MV, M,特纳氏综合征在TA与C相比没有显著变化。这些结果表明,SOD亚型来防止氧化应激增加他们的活动。
血管壁内SOD亚型是重要的在正常情况下和人类患病的状态。Cu-Zn-SOD表达式是相对较高的细胞类型,包括血液细胞,它占到总成本的50%到80%的活动,因此,主要的同种型。Mn-SOD负责活动的2%,其余12%的活动可能是由于细胞外SOD (SOD-EC)。功能的重要性Cu-Zn-SOD进一步证明SOD-EC[不足时62年]。在Cu-Zn-SOD缺陷的小鼠中有血管通透性的增加和缺血脑小动脉(肥大63年]。在我们的研究中,高血压患者中的缺Cu-Zn-SOD主动脉扩张,特纳氏综合征,TA可能与血管改变,这些患者的临床状况。在转基因小鼠Cu-Zn-SOD超表达有保护作用与血管功能障碍(64年]。
在正常情况下,Mn-SOD对氧化应激的第一道防线。其定位、诱导机制、血管表达,和活动是已知的(65年),可能会改变在生理和病理生理条件下,特别是在过度氧化应激(66年]。Mn-SOD表达式在某些阶段改变的疾病与血管氧化应激有关。
促炎细胞因子和LPS-mediated维管组织的炎症引起的增加超氧化物()生产和Mn-SOD表达式(67年]。在动脉粥样硬化,血管Cu-Zn-SOD和增加Mn-SOD mRNA的表达在疾病的发病和随着时间减少了68年]。在慢性高血压模型中,血管的表达Mn-SOD也增加(69年]。有很多条件,提升过氧硝酸盐浓度,反过来,Mn-SOD停止活动。这些包括炎症、糖尿病、高血压动脉粥样硬化,蛛网膜下腔出血,和年龄。然而,在最近的研究中,发现Mn-SOD从线粒体保护血管损伤和动脉粥样硬化的发展70年]。
在这项研究中,所有的主动脉病组增加Mn Cu-Zn-SOD,这与增加相关法律流程外包除了助教。Mn-SOD过度降低过氧化物水平(71年),改善内皮功能在一些模型,从而防止内皮损伤(72年]。此外,我们认为,在这些患者中,补偿机制是减少和氧化应激增加。在其他血管疾病,这些补偿响应机制不同,可能与其他因素,如病理的进化,etiopathogenic机制和宿主反应能力(73年]。助教与肺结核感染只有被证明在孤立的情况下(74年- - - - - -77年]。患者确诊肺结核、Mn-SOD被发现的一个重要减少,提高了治疗(78年]。最近的研究提出Mn-SOD作为一种重要的抗氧化剂调制器后血管损伤。这些结果表明,它可能是一个有前途的血管增生性疾病伤害预防与治疗策略有狭窄(79年]。
猫是另一个重要的抗氧化酶,这是发现在肝脏,肾脏和主动脉。猫使用两个打破成分子;一个作为还原剂,另一个作为氧化剂。过度的猫阻止ROS的刺激80年]。我们的研究结果表明,猫增加M和特纳综合征患者。这些结果表明,过度的猫可能是由于生产过剩在这些患者的主动脉。猫的增加活动在我们的研究可能会认为,在某种程度上,连续接触氢过氧化物。尽管不同的研究表明,高血压猫活动很低(81年猫),在我们的研究活动显示在SAH没有显著变化,MV, TA相比,C科目。
酶销售税使谷胱甘肽与亲电外源性物质,化学物质,和有毒化合物如丙二醛是磷脂的法律流程外包过程的最终产品,导致细胞膜的刚度的增加,形成一个硫醚键(82年]。高血压患者通常表现出减少销售税活动(83年]。我们的结果显示在SAH销售税减少活动,MV, M,特纳氏综合征,TA相比,C。一个类似的趋势在GPx活性被发现。GPx解毒作用低水平的过氧化氢与谷胱甘肽的帮助下,导致其氧化(84年]。高血压与许多抗氧化酶包括销售税和GPx活性下降。
GPx也可以灭活在氧化应激的条件;可以抑制这种酶的作用[83年]。这些结果表明,减少销售税和GPx活性可以在这些病人是由于氧化应激。在这项研究中我们没有分析谷胱甘肽浓度,但GPx和销售税活动的减少可能是由于在一定程度上减少谷胱甘肽和活性氧的积累。当高血压进展到第二和第三阶段,甚至国防GPx可能恶化因为ROS增加产量的85年]。
法律流程外包增加动物模型,从动脉粥样硬化患者血清86年),助教。我们的结果表明,提供法律服务外包的增加在SAH, MV, M,特纳氏综合征,和助教,这与先前的报道是一致的在文献[87年]。在原发性高血压和M增加法律外包水平相比,健康受试者被描述(88年,89年]。8-iso-PGF2α氧化压力的一个标志,也会增加在助教37]。我们的结果对MDA水平表明,病理研究显示不同级别的氧化应激对C主题,修改抗氧化剂酶系统的活性。
内皮持续释放大量的血管活性的介质包括没有调节平滑肌收缩,因此血管平滑肌张力和机械性能。内皮功能障碍和表达下调没有会导致刚度,减少扩张性,MV中描述和主动脉并发症和M小鼠模型。变更fibrillin-1损害弹性纤维的完整性的内皮细胞层和内皮渗透性受损在M [90年]。没有生产的减少也减少cGMP水平作为下游第二信使信号。此外,MV和M与血浆同型半胱氨酸水平升高有关,内皮功能变弱,限制了生物利用度,减少生产,。没有改变增加易感性主动脉并发症(91年]。我们的研究结果表明,长官,MV,和M显示下降以挪士表达式。这些结果表明,以挪士新陈代谢降低,其降低参与这些疾病。以挪士下降的一个解释是,高度氧化环境减少其活动。然而,我们的研究结果显示增加的和比,代谢物的NOS的增加和率可能是由于诱导一氧化氮合酶(间接宾语);这种酶可以是一个中介在某些阶段的疾病(92年]。免疫荧光显示增加了伊诺表达所有的病理研究与对照组相比。这些结果表明,伊诺生产没有主要在炎症过程和伊诺大大有助于组织/比率。它可能参与蛋白质基质降解和动脉瘤形成中起到关键作用的93年]。伊诺广泛表达于多种细胞类型的转录调控下炎症介质,参与许多疾病包括动脉粥样硬化的发病机理,中风,关节炎,和动脉瘤94年]。
在病理研究,动脉瘤的存在导致内皮功能障碍和增加和比率可以支持过氧硝酸盐的增加。此外,改变没有生物利用度有助于修改vasomotion高血压(95年),增加活性氧的生产与过氧亚硝基的高架生产相关冠状血管。内皮功能障碍也促进增加一代导致一个增强没有针对过氧亚硝基的失活(93年]。此外,过氧硝酸盐通过BH氧化损害没有生产4,号代数余子式96年]。此外高过氧亚硝基肌原性的语气与海拔高度有关,血管收缩,恶化的endothelium-mediated放松(64年]。
我们的结果显示显著变化在某些蛋白等细胞外基质层粘连蛋白-γ1和IV型胶原蛋白。减少这些蛋白质可以解释,至少在某种程度上,这些患者的血管机械功能的恶化。氧化应激可能恶化内皮和皮下蛋白质的合成。在动物模型中,信号通路的变化促进改变如增殖、迁移,细胞外基质的重塑血管平滑肌细胞在血管壁厚因此增加,炎症,对动脉粥样硬化的发展。一些动物模型提出了解释结构变化在血管病理52]。然而,目前还不清楚这些机制运作以类似的方式在人体组织97年]。
最后,本研究作为一个重要的限制,使用从患者主动脉罕见的条件。这使得不切实际的每个病人的监测前瞻性了很长一段时间。回顾性研究只允许某些方面的评价,但不给机会纠正一些偏见。未来的研究应该以系统的方式进行评估几个方面如氧化应激的作用,抗氧化治疗,和参与的因素在减少主动脉扩张。
本研究的相关性在于动脉瘤和心血管损害的存在作为一个结果在所有的条件进行了研究。它刺激干预策略和预防方面的研究兴趣。研究从基因生成假设,环境,和治疗的观点。本研究的主要限制是主动脉的小尺寸样品在MV等疾病,M,特纳氏综合征,和TA的发病率出现2 - 3每10000个人,是常染色体显性遗传疾病的结缔组织由突变引起的。此外,细胞之间的因果关联在动脉瘤的形成和机械过程尚未完全定义,这样一个特定的治疗还没有提出。然而,一些研究表明,辛伐他汀能减少自由基,NF -B,提高了抗氧化条件(98年]。在这项研究中,患者米有一个猫,可以增加与层粘连蛋白有关,但这可能是由于这样的事实,他们服用辛伐他汀。与助教在某些情况下,高血压,心肌缺血性损伤,提供法律服务外包的增加和抗氧化剂酶减少,建议增加活性氧的生产。在这一组的患者服用辛伐他汀,这个观察建立了未来可能的治疗假设在这些人群。
5。结论
这些初步的研究结果显示异同在病态的氧化应激的作用进行了研究。有必要实施适当的研究和方法论的战略评估氧化应激在每一个条件,因为每个发病机理可以影响细胞氧化还原状态。Prooxidant损伤机制似乎是具体和共同途径损伤和主动脉恶化。主动脉损伤的代偿机制,在慢性阶段,是逆相关,因为在法律流程外包的存在有一个较低的抗氧化活性。然而,在早期阶段,prooxidant似乎和抗氧化剂代理并行发展,应对不平衡。在这些病态,最终损害的是主动脉的治疗手段作用于抗氧化剂应该开始自诊断、独立于主动脉损伤的原因。组设计、回顾性和前瞻性,应适合每组。
缩写
| 猫: | 过氧化氢酶 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| GPx: | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| 销售税: | 谷胱甘肽S-transferase |
| ROS: | 活性氧 |
| 以挪士: | 内皮一氧化氮合成 |
| 伊诺: | 诱导一氧化氮合成 |
| 法律流程外包: | Lipoperoxidation。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
作者要感谢罗德里戈委拉斯开兹Espejel和安娜Beatriz马丁内斯塞万提斯在免疫印迹和免疫荧光技术支持。