微血管心绞痛患者一氧化氮合成途径及其与氧化应激的关系

抽象的

降低的一氧化氮（NO）的生物利用度和增加的氧化应激的不同心血管疾病中发挥关键作用。如红血细胞（红细胞）在血流中参与NO生成，本研究的目的是概述L-精氨酸（Arg）的代谢分布图中的RBC和在患有微血管血浆/ NO途径的氧化应激状态和心绞痛（MVA），调查异同相对于冠状动脉疾病（CAD）患者或健康对照（CTRL）。参与精氨酸/ NO通路和谷胱甘肽的氧化和还原形式的比率的分析物通过LC-MS / MS测量。精氨酸酶和NO合成酶（NOS）的表达通过免疫荧光染色进行评价。从MVA患者红细胞表现出增加的NO合成抑制剂的水平，平行于在血浆中发现，和还原NO合酶表达的。当摘要分数被计算，两组患者用的正氧化得分和负NO得分相关联，与位于相对于Ctrl键更极端的位置上的CAD基。这一发现指出到RBC的能力的损害在病理状态产生NO，其特征在于主要是由改变在微血管床没有显著冠状动脉狭窄。

1.介绍

否是涉及维持血管功能的重要信号分子。它通过诱导血管交气，抑制白细胞 - 内皮粘附，平滑肌细胞迁移和增殖以及血小板聚集来促进血管系统中的几种有益效果，以及血小板聚集[1那2]．NO生物利用度降低在几种心血管疾病中都有很好的记录，包括高血压、动脉粥样硬化和缺血-再灌注损伤。内皮功能障碍患者体内循环NO种类(亚硝酸盐和亚硝基化化合物)的减少，有助于总NO可用性。这种减少与心血管危险因素的增加有关[3.-5.]．

NO是由NO合酶(NOSs)催化氨基酸l -精氨酸(Arg)氧化成等摩尔量的NO和l -瓜氨酸(Cit)在氧气和辅助因子存在下的酶作用合成的。虽然NO的合成和释放与底物的生物利用度有关[6.]，也提出了疾病环境中NO缺乏的其他潜在原因。其中，内源性甲基精氨酸的高循环水平，即对称、不对称二甲基精氨酸(SDMA, ADMA)和单甲基精氨酸(MMA)作为no合成抑制剂[7.那8.]．此外，氧化应激通过氧化参与NO代谢的辅助因子/酶或NO的直接失活，在决定NO的生物利用度方面发挥着关键作用。

内皮细胞被认为是血管系统中NO的主要来源；然而，研究表明，循环细胞也可能参与NO的合成，即血小板、单核细胞和红细胞（RBC）。RBC表达功能性NOS[9.那10，类似于内皮细胞的酶[11]，是一种腔内NO源，有助于调节全身血压[12]．此外，阳离子氨基酸的转运体[13]所有参与二甲基碱代谢的所有酶（合成和分解代谢）[14]已在RBCS中鉴定。人RBC也表达酶氨基酶，其与其共同底物arg的NoS竞争以形成L-鸟氨酸（ORN）[15]．精氨酸酶的两种不同亚型在人体内表达[16]最近，研究表明精氨酸酶I在控制RBC-NOS功能和释放生物活性NO中起着重要作用[17]．事实上，在动脉粥样硬化的实验模型中[18]心肌缺血[19]，高血压[20.]和老化[21[据报道，已讨论氨基酶活性在血管水平上上调。

微血管心绞痛（MVA）是一种病理状况，其特征在于典型的角度疼痛，心电图（ECG）异常在静止（ST段抑郁或T波反转），在非偏心外膜冠状动脉的存在下运动期间增加的所有特征[22-24]．即使MVA的病理生理学尚未被解开，胰岛素抵抗、异常自主控制、氢钠交换活性增强、心脏异常敏感和微血管痉挛已被提出为潜在原因[25]此外，循环C反应蛋白浓度的增加已被证明与MVA患者的血管异常相关，表明炎症在这种病理状态中的作用[26]．

氧化应激本质上，直接或通过NO的生物利用度的导致内皮依赖性血管舒张的损害的减少，已经参与了MVA [的病理生理学27那28]．特别是冠状动脉微血管内皮依赖性血管扩张受损[27]和相关功能受损，从而限制了冠状动脉血流储备[28-30.]已提出诱导MVA综合征。

血流介导的冠状动脉扩张改变是MVA患者的常见表现。在微循环中，血流在很大程度上取决于血液流变学特性，特别是红细胞的变形性，与较大的血管相比，红细胞的变形性在毛细血管中的重要性增加[31]．CAD和糖尿病患者已显示降低的RBC可变形性[32]并且已经涉及一种降低NO释放[33]．另外，由于微循环床中的结构性和血液流动，血细胞与内皮细胞密切接触。如图所示，eNOS表达在微血管结构中减少[34]，可以推测，在毛细血管中，RBC-NOS可能发挥更加决定性的作用[35]．

此外，最近的研究表明，在心脏综合征X患者中，红细胞分布宽度(RDW)和红细胞大小变异性的测量值增加[36]．即使据报道，硝酸盐和亚硝酸盐的还原，也偶联在ADMA和SDMA增加，也发生在MVA患者的血浆中[37那38]因此，在本研究中，我们将MVA患者的红细胞氧化应激和no生物合成途径与冠心病（CAD）患者或健康受试者（Ctrl）进行了比较。

2.方法

2．1.研究人群

MVA患者()以稳定的心绞痛或诱导性缺血和冠状动脉血流储备减少为特征，通过阳性应激试验记录（至少2.0 在没有冠状动脉造影记录的情况下，研究人员招募了mm水平或向下倾斜ST段压低）或SPECT阳性的患者。这些患者与冠状动脉造影记录的CAD患者进行比较(）and with subjects deemed as healthy on the bases of the absence of clinical symptoms, the instrumental and laboratory examination (Ctrl = 20), and the negative stress test from a previously described cohort  [10]排除标准如下：充血性心力衰竭史、严重瓣膜病、肥厚型心肌病、血管痉挛性心绞痛、近期（<6个月）急性冠脉综合征、手术或经皮血运重建、起搏器依赖性和心房颤动。肾功能不全患者（血清肌酐浓度>1.4 mg/dL），肝脏疾病，近期感染，近期主要手术干预，免疫紊乱和慢性炎症或肿瘤性疾病也被排除在外。这项观察性研究是根据赫尔辛基宣言进行的，并经Monzino中心当地伦理研究委员会批准（编号S1687/610）。从所有受试者处获得书面知情同意书。

2.2.血液采集

禁食时从受试者的输卵管前静脉抽取EDTA抗凝血液，以获得全血、血浆和红细胞样本 g代表10人 在4°C条件下，将血浆分离，并将等分样品储存在室温下−80°C，直至分析。用冷去离子水溶解小份包装红细胞，以获得溶解红细胞，并储存于−80°C，直到分析结束。

２.３.参数/不代谢途径

我们通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时测定了精氨酸、ADMA、SDMA、MMA、Cit和Orn[39]．Arg/(Orn + Cit)的比值，作为全球Arg可用性的指标[40那41]，并且比率ORN /相关链接，如精氨酸和NOS [的相对活性的指示剂19]，被计算。所有测定均在血浆和裂解的RBC中进行。

2.4.氧化应激

通过二硫化物和还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)的比例来评价。三氯乙酸沉淀蛋白后，采用LC-MS/MS法测定全血GSH和GSSG [42]．GSH和GSSG表达为μ摩尔/ g Hb。

2.5。RBC-NOS和Aginase表达

RBC-NOS表达通过受试者亚组中的免疫荧光分析进行（每组与年龄和性别相匹配）。如前所述制备RBCS载玻片[10]．简单地说，在阻断非特异性反应位点后，将红细胞与单克隆抗enos (2.5μg/mL) (BD Biosciences，米兰，意大利)或多克隆抗精氨酸酶I或单克隆抗精氨酸酶II (4μg/mL，两者均适用）（圣克鲁斯生物技术公司，意大利DBA s.r.l.，意大利米兰）抗体。三次洗涤后，加入抗小鼠或抗兔AlexaFluor488共轭二级抗体（意大利蒙扎意大利生命技术公司Invitrogen），并使用63x/1.3油浸物镜通过激光扫描共焦显微镜（意大利米兰卡尔蔡司LSM710）观察免疫复合物。采集图像并量化荧光强度（灰度密度和）。数据表示为荧光强度的平均水平，减去在没有初级抗体的情况下在同一玻片上获得的阴性对照值。每张幻灯片拍摄多个视野（至少三个随机选择的区域）。

2.6.统计和分数开发

除非另有说明，否则数值变量总结为平均值和标准偏差（SD），并且将分类变量概括为频率和百分比。每组20个受试者的样品大小允许统计功率为90％，以显着的任何分析物在大约等于一个标准偏差的分析物之间的显着差异，α误差为0.05。在MVA和CAD或CTRL之间比较变量-检验或协方差分析，调整年龄和性别。偏态分布的变量在分析前进行对数变换。考虑到每个受试者的重复测量，采用重复测量协方差分析比较组间免疫荧光强度。所有分析均采用SAS v. 9.2 (SAS Institute Inc.， Cary, NC, USA)进行。

为了提供与无途径相关的所有变量的全局指标，并且由于多次测试而包含alpha误差的血液误差，我们开发了与我们的集团几年前设计的氧气分数相似的分数[43].首先，考虑到不同的测量范围和单位，所有变量都被标准化；也就是说，从单个值中减去平均值，然后将结果除以标准偏差。其次，增加与内皮功能（Arg和Cit）正相关的变量标准值，而减去与内皮功能（ADMA、SDMA、MMA和Orn）负相关的变量标准值。值得注意的是，这些关联是“先验的”，不是从本研究中推断出来的。我们使用血浆中测量的变量（无血浆分数）创建了第一个分数，使用红细胞中测量的变量创建了另一个分数（无红细胞分数）。类似地，我们创建了氧化应激评分，这是氧评分的简化版本，包括GSSG（带加号）和GSH（带减号）。

3.结果

３．１．人口

本研究分析的两组患者和健康受试者的主要人口学和临床特征如表所示1。无显著差异，组间发现，除了年龄（MVA与CAD）被认为是群体比较的混淆。

3.2。Arg / No途径中参与代谢产物的生化测定和氧化应激状态

为了评估MVA患者Arg/NO通路的潜在损害，我们同时测量了血浆和红细胞室中参与该通路的主要代谢物，并将其与CAD和Ctrl中测量的水平进行比较（表1）2)在血浆中，MVA患者的Arg、Cit和Orn水平与CAD患者和Ctrl患者相似。相反，MVA和CAD患者的ADMA水平均高于对照组。三组研究中SDMA和MMA水平没有差异。根据这些发现，精氨酸的生物利用度（Arg/Orn + 与对照组相比，MVA组的Cit比率较低，与CAD组相似。此外，MVA Orn/Cit比率（精氨酸代谢酶精氨酸酶和NOS的活性指数）显示的水平介于CAD和Ctrl之间（表1）2)．

在RBC隔室中，MVA和CAD患者中无抑制剂ADMA和SDMA的水平高于CTRL（表2)．有趣的是，MMA水平在MVA中最高。在三组受试者中，Arg生物利用度类似，而MVA的ORN / CIT比率显着低于CAD组，但类似于CTRL（表2)．

MVA患者的氧化应激水平高于对照组，但低于CAD患者的氧化应激水平，这可以通过全血GSSG/GSH比值来证明(图)1（a）)．具体地，两组患者对于CTRL，两组患者均显示出较低的GSH和更高水平的GSSG（图1（b）)．

数字2MVA和CAD患者血浆或红细胞中检测到的分析物的分布以折线变化表示。总的来说，NO途径的分析物在MVA和CAD中表现类似，与Ctrl相比，它们在血浆和红细胞中均中度升高。一个特殊的例子是红细胞中的MMA, MVA中的MMA水平高于Ctrl和CAD患者。正如预期的那样，MVA和CAD患者的氧化应激，特别是氧化形式的谷胱甘肽，都高于对照组。

３．３．精氨酸代谢酶:红细胞nos和精氨酸酶

通过免疫荧光染色可视化RBC-NO的表达，揭示了患者组和CTRL之间的强定量差异。MVA和CAD患者的RBCS显着降低RBC-NOS荧光，膜中的局部局部，并相对于CTRL（图）3(一个))．

还评价了两种氨基酶的表达。MVA患者和CTRL的RBC表达了比CAD患者的较低水平（)（图3 (b))相反，在Ctrl和MVA或CAD患者的红细胞中未检测到精氨酸酶II的表达（数据未显示）。

3.4.NO途径和氧化应激总分

分析物，即NO合成所涉及的底物、抑制剂和酶产品，被合并成适当的分数（见第节）2）为了在检查的临床环境中总结ARG / NO途径。在图中4.，笛卡尔平面由NO血浆评分(-轴)和NO RBC评分(设在);坐标轴的交点表示整个样本的中点，单位用标准差表示。Ctrl组位于第一象限(两个得分均为正值)，而两个患者组位于第三象限(两个得分均为负值)。值得注意的是，与CAD组相比，MVA组在NO RBC评分轴上处于更负的位置;但差异未达到统计学意义。

数字5.显示由氧化应激评分定义的笛卡尔平面(-轴)和NO血浆评分(-轴）。在该图中，对照组置于象限中，其特征在于负氧化分数，并不分数。相比之下，将两组患者相对于阳性氧化得分和负不数的次数置于象限中，CAD组位于MVA的更极端位置（尽管这种差异没有达到统计学意义，但是多元方差分析)。

4.讨论

上述研究首次表明，MVA患者的红细胞含有比Ctrl更高水平的NO合成抑制剂，并且这些水平与CAD患者的水平并没有显著差异。正如其他人之前所述，血浆中也发现了类似的情况[37那38]．最后，在红细胞NOS表达被发现显着两个MVA和CAD患者降低。此外，氧化应激被发现在两组患者增多，主要集中在CAD。

MVA的病理生理学尚未被完全理解，即使一些代谢、血流动力学和血管痉挛的改变与该综合征有关。最近有报道称MVA和CAD患者的RDW值均明显高于健康受试者[36]．然而，如在我们的研究中没有在RDW值（未显示数据）中没有修改的情况下，MVA患者RBC中NO途径的损伤与循环RBC的大小的变化无关。然而，MVA患者的RBC患者显示出较高水平的没有合成抑制剂，并且该发现是等离子体中发现的数据。因此，在由没有得分的笛卡尔平面中，MVA组在沿着NO RBC得分轴的负位置相对于CTRL位于负位置，因此表明在没有产生的可能改变，在MVA中更加明显CAD。

本研究的局限性可能是在没有测量NO本身的情况下计算NO得分。这种高度活性的分子及其活性代谢物受到多种因素的影响，包括膳食硝酸盐摄入量和肾功能，特别是在血浆室。因此，我们不能排除其他NOS独立因素可能会为MVA中这一代谢途径的总体情况提供额外的信息。

感兴趣的是观察，类似于先前对CAD患者所述的描述[10[我们发现MVA患者RBC中的NOS表达明显还原。这一发现特别相关，因为RBCS在没有生产方面具有全身影响，并且可能代表一个重要的隔间，其变更参与整体生产的减少。

arg是用于NOS酶，包括RBC-NOS的底物，并且已经表明，在冠状动脉段的狭窄病变引起的扩张增加了底物可用性[44]．Arg还是氨基酶的底物，其活性在与否减少相关的不同病理条件下增加[17那45]．

在人体内鉴定出精氨酸酶的两种不同亚型，精氨酸酶I是迄今为止在红细胞中唯一描述的精氨酸酶，约占血液精氨酸酶总活性的98% [46]在我们的情况下，在CAD患者中发现了大量精氨酸酶I，但在MVA患者中没有发现。因为有报道称红系祖细胞同时表达精氨酸酶I和精氨酸酶II[15]中，我们还测定了在红细胞这种酶。根据文献[17，我们未能在Ctrl或患者中检测到可测量的精氨酸酶II。

具有降低的NO血浆水平，并与在红细胞缺损相关的增加的红细胞精氨酸酶的活性已经报道在镰状细胞病的患者[40]．有趣的是，可可黄烷醇的消耗降低了红细胞精氨酸酶的活性，表明可能通过调节精氨酸和NO的生物利用度进行治疗干预[47]．

氧化应激是影响一氧化氮生物利用度的一个重要条件。与此相关的是，MVA患者全血中氧化谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的比值几乎翻倍，这表明在这种情况下氧化应激增加。氧化应激在降低NO生物利用度方面的作用已被强调，但在MVA中的信息仍然不足[27那48那49]．基于氧化谷胱甘肽的增加，我们发现了GSSG / GSH的显着增加，CAD患者甚至更明显，并且在MVA患者中的GSH减少。该观察符合Dhawan等人报告的数据。[50.[综述GSH水平与冠状动脉速率储备之间的正相关，从而预测微血管功能受损。

最后，氧化应激和患者NO途径的伴随评估表明，既MVA和CAD患者被放置直角相对的平面象限到正氧化得分和负NO得分，与位于一个更极端的位置与CAD组尊重MVA。

因此，如先前由Rassaf和合作者[建议51.]，通过评估血管系统的生化、结构和功能变化的多层次方法对于心血管疾病的早期诊断和更好地描述这种多因素疾病可能很重要。

5.结论

我们的研究表明，在MVA中，Arg/NO代谢谱的变化，加上氧化应激的增加，具有类似于CAD患者的损伤趋势。特别是，我们首次描述了红细胞产生NO能力的改变，这种病理状态主要以微血管床的改变为特征，没有明显的冠状动脉狭窄。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

作者的贡献

Benedetta Porro和Sonia Eligini作为第一作者对本文做出了同样的贡献。

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