熏蒸消毒剂的活动Psidium guajavaVar。Pomifera(桃金娘科)植物精油黑腹果蝇通过氧化应激

文摘

番石榴果实,Psidium guajavavar. pomifera(桃金娘科的家庭),是一种原产于南美植物。它的树叶和水果被广泛使用在热带和亚热带国家流行的医学。黑腹果蝇已经作为一个主要的模式生物基因研究自1900年代以来。广博的知识关于这个物种使它的一个最合适的生物研究有毒化合物的许多方面的影响。由于缺少研究中的生物活性化合物的影响p . guajavavar. pomifera精油,我们进行了植物化学的特性通过CG-MS和评估毒性诱导的精油d .腹昆虫模型。为了了解毒性的生化机制,改变Nrf2信号以及特征的氧化应激反应在暴露之后苍蝇。我们的研究结果表明,接触的昆虫p . guajava石油增加死亡率和运动赤字与氧化应激反应信号。因此,它提出了一个bioinsecticidal活动p . guajava挥发性化合物的氧化应激。正在进行进一步的研究来确定哪些石油化合物负责这样的效果。

1。介绍

随着全球人口的不断增加,最具挑战性的情形之一是人类人口提供足够的食物。有两种可能达到这样的努力:(1)增加农业面积或(2)优化的生产已经被开垦的土地。害虫是其中一个最重要的栽培作物造成严重威胁减少全球产量(1]。

合成杀虫剂被广泛用于控制害虫。然而,这些产品的化学性质使他们危险的人类和环境(2]。此外,害虫的可塑性使得他们容易产生耐药性,其中许多化合物(3]。搜索新杀虫剂提供没有或低风险和对安全的化合物分解后的行动是必要的,以克服这些问题。植物中杀虫剂可以是一个合适的选择,因为蔬菜物种进化的分子机制,抵御食草昆虫和其他动物物种(4]。精油是从植物物种被报道为作用于消化系统和神经系统酶以及昆虫皮(5,6]。一些作者认为,这种杀虫剂的影响可能是由于次生代谢物萜类化合物、糖类(7]。一些单萜的杀虫活性α蒎烯,β蒎烯、3-carene、柠檬烯、月桂烯α萜品烯、莰烯被证明文献[8]。

Psidium guajava布什(桃金娘科家族)是一个本地物种从南美称为“goiaba。“有两个常见的栽培品种p . guajava:p . guajavavar. pomifera和p . guajavavar. pyrifera。的p . guajavavar. pomifera产生在热带和亚热带水果高度赞赏烹饪,也用于流行医学(9]。摘录树叶和水果的种类提出了几个止痉挛的药理性质,抗菌和抗炎10]。此外,这些提取物也被用作低血糖(11]。尽管可用的报告番石榴对人类健康的好处,对其潜在的生物技术的应用程序(例如,熏蒸消毒剂活动)番石榴提取物,油,和衍生的化合物。

在过去的十年中,黑腹果蝇成为一个模型测试毒性体内。这是由于物种与人类有许多同源基因,可以很容易地保存在实验室允许执行许多化验(12- - - - - -15]。因此,d .腹模型可以广泛用于评估熏蒸消毒剂放映活动。

总之,考虑到不受欢迎的副作用(i)的合成害虫防治的手段对人类和环境,(2)植物代谢产物诱导毒性的昆虫,和(3)缺乏研究的生物技术潜力番石榴果实衍生化合物,本工作的主要目的是评估生物活性的精油Psidium guajavavar. pomifera和调查这种油的机制促进使用模式生物毒性d .腹。毒性是评估死亡率和运动赤字。同时,氧化应激信号标记测定为了寻找潜在的毒性机制诱导的精油果蝇。

2。材料和方法

2.1。植物材料

的植物材料Psidium guajavavar. pomifera,收集Horto Botanico de足底Medicinais做Laboratorio德尽管de Produtos Naturais (LPPN)大学区域做Cariri(乌卡),西阿拉,巴西。植物材料被确认,凭证标本是存入标本Dardano安德拉德利马乌卡,3930号。

2.2。精油的集合

的叶子Psidium guajavavar. pomifera l .收集碎成碎片的约1厘米²,并放置在一个5升状玻璃烧瓶。树叶提取clevenger装置,根据•马托斯(描述的方法16),收益率为0.05%。

2.3。gc - ms分析

石油分析使用日本岛津公司执行GC MS-QP2010系列(GC / MS系统):Rtx-5MS毛细管柱(30 m×0.25毫米,0.25μ膜厚度);氦载气为1.5毫升/分钟;喷油器温度250°C;检测器温度290°C;列温度60 - 180°C在5°C / min,然后180 - 280°C 10°C /分钟(10分钟)。扫描速度是0.5扫描/ sm / z40到350;分流比(1:200);注入量:1μL 25μL CHCl精油/ 5毫升₃(1:200);溶剂减少时间= 2.5分钟。质谱仪的操作使用70 eV电离能。识别单个组件是基于它们的质量谱碎片基于NIST质谱库08年,保留指数与发表的数据和比较。

2.4。果蝇股票和文化

d .腹(Harwich应变)从国家获得物种证券中心、保龄球绿色哦。苍蝇被饲养在2.5×6.5厘米²包含10毫升玻璃瓶标准介质(1% w / v啤酒酵母;w / v蔗糖2%;1% w / v奶粉;w / v琼脂1%;0.08% v / w nepagin)在恒定的温度和湿度(°C;相对湿度60%,职责)。所有实验都执行同样的压力。

2.5。精油曝光和果蝇生存试验

苍蝇的接触精油是由一个熏蒸协议所述:成年苍蝇(男性和女性)被放置在330厘米³玻璃小瓶,包含一个滤纸与1%蔗糖在蒸馏水浸泡在底部。counter-lid聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)介绍了螺旋盖子的瓶子,一个滤纸是固定在内部端帽的应用不同剂量的精油。通过这样做,苍蝇饲料和水合物在蔗糖溶液瓶的底部和允许精油挥发从顶部以达到苍蝇的呼吸系统。瓶收到以下治疗:1%蔗糖(控制)和3,7.5,23.5,30μ克/毫升的精油。的最终浓度精油被近似估计,考虑到体积(每毫升)的石油应用于玻璃小瓶,最终体积相当于330毫升。读数的果蝇生存被在6、12、24、48 h。结果给出了活苍蝇的百分比(%)(平均数±标准差)从三个独立的实验。

2.6。运动分析

运动能力是评估通过后反趋地性行为所描述的库仑和伯曼猫17)做了一些调整。二十个成年苍蝇(1-4-day老;两性)受到上面详细的精油接触。治疗完成后,苍蝇被固定化的冰面上1 - 2分钟,分别放置在垂直玻璃列(长度,25厘米;直径1.5厘米)。30分钟后恢复,苍蝇轻轻了底部的列和苍蝇的数量达到6厘米的列(上)和苍蝇仍低于这个马克(底部)注册。为每个飞化验是重复三次。结果给出了上的苍蝇数量最高(平均±SD)从三个独立的实验。

2.7。氧化应激的标记

氧化应激是由测量脂质过氧化,活性氧(ROS)形成,非蛋白硫醇(汽蚀余量)和蛋白质硫醇(PSH)。脂质过氧化是量化的副产品硫代巴比土酸活性物质方法(TBARS) Ohkawa et al。18与一些修改)。短暂,20苍蝇从每个治疗均质1毫升的磷酸缓冲pH值7.0和0.1米在1000 g离心5分钟在4°C。离心后,上清液在醋酸孵化0.45 /盐酸缓冲pH值3.4,含硫代巴比土酸0.28%,SDS 1.2%,在95°C颜色发展60分钟,然后吸光度测量在532海里。丙二醛(0 - 3 nmol)作为标准。2,7-dichlorofluorescein二乙酸(DCFDA)氧化被用作通用ROS指数形成后Perez-Severiano et al。19]。DCF DCFDA氧化导致的荧光发射监控的激发波长485 nm和发射波长530 nm)在多模板读者(EnsPire PerkinElmer,美国)。蛋白质和非蛋白硫醇是根据描述的方法取决于Ellman et al。20.)和适应我们的实验室条件。总之,治疗完成后,苍蝇在0.5米高氯酸和均质在5000 g离心5分钟在4°C。汽蚀余量内容在上层的决心,颗粒被用于PSH测量。据布拉德福德(总蛋白量化21]。

2.8。酶化验

抗氧化酶的活动,组织20个苍蝇在1毫升0.1米均质磷酸盐缓冲剂,pH值7.0,离心机在20.000 g 30分钟。导致上层清液是用于测定谷胱甘肽S-transferase(销售税)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)根据前面描述的方法(22]。谷胱甘肽S-transferase(销售税;EC 2.5.1.18)活动过程后的化验Habig和Jakoby23)使用1-chloro-2 4-dinitrobenzene (CDNB)作为底物。分析基于共轭的形成复杂的CDNB与谷胱甘肽340海里。反应是在混合组成的100毫米进行磷酸盐缓冲剂pH值7.0,1毫米EDTA,谷胱甘肽1毫米和2.5毫米CDNB。过氧化氢酶(CAT);EC 1.11.1.6)活动是化验后的间隙H₂O₂在240 nm反应媒体包含50 mM磷酸盐缓冲剂pH值7.0,0.5毫米EDTA, 10毫米H₂O₂,0.012%的TRITON X100的过程Aebi [24]。EC 1.15.1.1超氧化物歧化酶(SOD)活性Kostyuk过程后的化验和Potapovich25]。分析由superoxide-driven氧化的抑制SOD在406 nm的槲皮素。25毫米的完整反应系统是由磷酸缓冲,pH值10,0.25毫米EDTA, tem 0.8毫米和0.05毫米槲皮素。所有的酶活性在室温下进行(°C)使用一个热科学进化60年代紫外可见分光光度计。据布拉德福德(总蛋白量化21]。

2.9。免疫印迹分析Nrf2 / NQO-1 / HSP70信号通路

蛋白表达是由西方墨点法根据pos (26与一些细微的修改。三十苍蝇是均质300年在4°CμL的缓冲区(pH值7.0)包含50 mM三、EDTA 1毫米,0.1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,20毫米Na₃签证官₄100毫米的氟化钠和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(σ,密苏里州)。10分钟的匀浆离心机在1000 g在4°C和上层清液(S1)收集。后蛋白质测定(布拉德福德(21)使用牛血清白蛋白作为标准,β巯基乙醇和甘油被添加到样本的最终浓度8 - 25%,分别和样本冷冻直到进一步分析。蛋白质分离用sds - page凝胶10%然后electrotransferred硝化纤维膜由pos(如前所述26]。与渐变膜在Tris-buffered盐水洗(TBST;100毫米Tris-HCl、0.9%氯化钠和0.1% Tween-20, pH值7.5)和孵化一夜之间(4°C)与不同主要抗体(圣克鲁斯生物技术、TX),所有生产的兔子(anti-Nrf2、anti-NQO-1 anti-HSP70反β肌动蛋白;1:1000稀释TBST)。孵化后,膜在TBST洗和孵化1 h在25°C HRP-linked anti-rabbit-IgG二级特定抗体(σ,密苏里州)。免疫印迹的可视化图像中站4000毫米PRO使用ECL试剂(圣克鲁斯生物技术、TX)。免疫反应性的乐队使用接穗图像量化软件和表达的褶皱变化意味着相对于对照组(蔗糖)治疗。

2.10。统计分析

执行统计分析使用单向方差分析Dunnett的紧随其后事后必要时进行测试。时被认为是具有统计学意义的差异。削减Spearman-KArber LC50值测定方法(1.5 v)。

3所示。结果

3.1。化学成分

五个最丰富的化合物p . guajava精油是epiglobulol(19.20%), 1.8桉树脑(13.31%)、氧化isoaromadendrene(11.13%)、石竹烯醇(10.21%)、和(E)石竹烯(9.51%)、证明的gc - ms分析(表1)。

3.2。中毒性d .腹

果蝇的接触p . guajava精油熏蒸导致死亡率显著增加。这样的效果是依赖于时间和石油浓度。计算出信用证₅₀在48小时是13.8μ克/毫升(图1)。的浓度23.5和30μg / mL杀虫剂效果最为明显,因此可以与食品剥夺治疗(水;数据未显示)。最高浓度测试杀苍蝇的几乎全部48 h,显示有效的杀虫剂行动的精油。在图2运动行为测试的结果进行描述。在协议与死亡结果,显著降低运动活动d .腹在治疗的前6 h 15日23.5,30岁μ可以观察到g / mL。此外,在48小时的接触,最高浓度测试导致几乎完全丧失运动能力飞(图2)。

3.3。氧化应激标记和抗氧化反应

为了阐明潜在的机制d .腹受到影响的p . guajava精油,苍蝇被暴露于15μg / mL的石油在3、6和12 h。然后,氧化应激标记和抗氧化酶活性的测定(表2)。这个浓度低于信用证₅₀48 hd .腹。可以观察到显著增加活性氧形成3 h接触精油,结果这是保持在6 - 12 h。我们的研究结果显示,增加水平TBARS 12 h(暴露后表明发生脂质过氧化反应。蛋白质的水平硫醇(PSH)并没有改变,但非蛋白硫醇(汽蚀余量)显著增加3 h的暴露后,回到基础水平6 - 12 h。我们也评估活动的三种酶参与了抗氧化代谢途径:销售税,SOD,和猫,以及蛋白质的表达目标参与应激反应和抗氧化信号(Nrf2, NQO-1和HSP70)。显著增加销售税和观察猫的活动相比,控制在6 - 12 h(表2)。然而,SOD的活性没有明显不同于时间的控制分析。作为显示在图3,苍蝇暴露在精油在NQO-1的表达显著增加3 h的曝光,表明早期Nrf2-ARE信号通路的激活。Nrf2和HSP70的蛋白质含量没有改变的时间点进行了分析。

4所示。讨论

化学杀虫剂用于昆虫控制可能对人类和野生动物是危险的。此外,这些化合物可能诱导抗虫性等负面影响,积极的寻找替代形式的控制(3]。在目前的研究中我们证明毒性引起的Psidium guajavavar. pomifera精油黑腹果蝇。苍蝇的曝光熏蒸方法诱导大幅降低生存以及运动活动。观察到毒性机制,结果表明苍蝇后建立prooxidant条件接触石油派生的挥发性化合物。这种效应证实了增加产量的活性物种和脂质过氧化产物的积累。此外,一个明确的适应性反应,氧化应激是明显的在石油暴露苍蝇,因为它是可能的观察活动增加,抗氧化信号通路的激活的关键细胞抗氧化酶。

据报道,植物衍生化合物诱导毒性广泛的昆虫和可能与果蝇的所有发展阶段,直接影响果蝇,和蟑螂27,28]。化合物如萜烯、类黄酮、生物碱、类固醇、皂甙是重要的植物化学物质在考虑杀虫剂活性的植物提取物(29日]。除了急性毒性和死亡率、萜类和黄酮类化合物还研究了杀虫剂的活动(29日,30.]。有各种各样的化合物中p . guajava精油,α松油醇,α蛇麻烯,β石竹烯和β-guaiene 1 8-cineole、石竹烯氧化物、β-bisabolene、aromadendrene p-selinene,α蒎烯等(31日- - - - - -34]。Leal et al。35显示1的杀虫活性,8-cineole复合得到的植物的,h . martiusii和Lippia sidoides精油。一些作者认为,大多数的单萜对哺乳动物和可以被认为是一种无毒的合成杀虫剂(36,37]。在这项研究中,我们观察到p . guajava石油提出了mono和sesquiterpenoid化合物,1,8-cineole被第二个最丰富(表1)。虽然我们没有执行论文评估每个化合物的杀虫剂活动,的存在和丰富,8-cineole表明,它可能是一个化合物负责这样的效果。研究正在进行,以澄清不同化合物的作用的精油测试。

根据Ennan et al。7一些来自精油为萜类化合物和糖类可以改变昆虫神经递质系统,包括多巴胺能和胆碱能装置(38,39]。我们观察到显著改变果蝇的负趋地性行为治疗p . guajava油,这反映了在一个运动赤字。虽然我们无法直接评价多巴胺能和胆碱能系统的变化在我们的实验设计中,一些观察到的影响可能与潜在的石油组件之间的交互和果蝇神经递质通路。在这种情况下,它已被证明,许多萜烯被称为乙酰胆碱酯酶的抑制剂(疼痛)39]。据相同的作者α萜品烯中发现鼠尾草leriifolia显示一个疼痛抑制剂的效果。一般来说,这表明,萜类化合物中发现p . guajava可能参与熏蒸消毒剂的效果和运动损伤设备。

与诱导死亡率和并行运动赤字,苍蝇暴露p . guajava也有氧化压力的迹象,包括活性氧和TBARS形成以及重要的抗氧化反应系统的变化。细胞氧化应激反应主要是由Nrf2核转录因子(40]。ROS /外源性物质诱导细胞氧化还原状态变化构成了一个重要信号促进适应性反应由Nrf2 [41,42]。upregulation解毒酶的天然化合物似乎与激活Nrf2-ARE通路(41,42]。Nrf2核易位和随后的绑定到DNA序列被称为“抗氧化响应元素,”可能是触发的离解Keap1以及抑制蛋白质磷酸化的丝氨酸残基Nrf2等上游激酶蛋白的PKC和MAPK42]。在蛋白质通常参与氧化反应stress-driven Nrf2激活,NAD (P) H脱氢酶,醌氧化还原酶1 (NQO-1),谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL),销售税,猫扮演中心角色43]。我们的结果显示一个与时间有关的激活的关键因素规定的一种抗氧化剂的反应。因为高死亡率几乎所有剂量的精油是明显的在第一个24小时的接触,我们测量氧化应激标记12 h,为了有一个动物的抗氧化反应p . guajava油治疗。显然,为了应对石油引起的毒性化合物,苍蝇了ROS水平增加,峰谷胱甘肽和NQO-1(表2)在第一个3 h的治疗,这一现象符合早期Nrf2-ARE通路的激活(44]。而ROS继续增加从3 h 12 h,脂质过氧化反应只发生在12 h(表时间点2)。抗氧化酶的销售税和猫期间增加后6 h 12 h精油治疗。尽管增加抗氧化酶的活动从6到12 h后管理p . guajava油,这样的效果没有防止苍蝇出现脂质氧化损伤。这些结果清楚地表明一个两阶段的氧化应激诱导适应性反应p . guajava石油衍生的化合物。早期阶段由活性氧诱导,导致主调节器的激活细胞抗氧化反应,Nrf2转录因子,和后期阶段,特点是氧化损伤和ROS增加/异型生物质解毒酶(CAT和销售税)。后来,死亡率和运动赤字完成了精油引发的毒性。

谷胱甘肽S-transferase是一个重要的抗氧化酶参与第二阶段解毒系统(45]。消费税属于一个家庭的多功能酶催化谷胱甘肽的结合其他分子和在细胞内的解毒机制中发挥作用endo -和异型生物质化合物(46,47]。观察到的增加销售税的活动黑腹果蝇暴露于p . guajava石油可以与相关的适应性反应增强消除有毒植物衍生品(48,49]。辛格et al。50]表明,天然化合物能够增加销售税,连同内源性谷胱甘肽的表达倾向于消除植物代谢物生物。催化过氧化氢的间隙中扮演着关键角色从细胞以及氧化应激防御24]。我们的结果显示出显著增加猫活动苍蝇番石榴精油(表处理2)。这种效果是在与ROS增加生产。本研究中使用的方法来检测活性氧是基于荧光染料的氧化DCFDA,这被认为是一个一般的活性物种指标;然而,过氧化氢是一个主要的物种被这个探针(51]。观察到的销售税和猫活动p . guajava在果蝇可能解释为一个潜在的Nrf2信号通路的激活。事实上,早期的激活信号通路在果蝇接触精油,通过增加NQO-1表达式以及谷胱甘肽的上升(图3和表2)。

5。结论

根据我们的结果,精油p . guajavavar. pomifera显示熏蒸消毒剂行动危及生存和运动的活动d .腹。作为一个潜在的毒性分子机制,氧化应激是中央,因为标记生物分子的氧化损伤和一个明确的自适应抗氧化反应观察暴露苍蝇。因此,我们的研究结果指出的潜在应用p . guajava精油和/或其化合物替代合成杀虫剂在农业和害虫防治实践。额外的实验是必要的澄清的确切机制引起的毒性p . guajava石油在昆虫和识别候选化合物来自石油。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认CNPq(482313/2013-7和311512/2011-9),FAPERGS(1954 - 2551/13 - 7),和PROPESQ-Unipampa财政支持。

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