文摘
肉瘤血管平滑肌细胞的表型(VSMCs)调制的收缩状态到活动合成血管壁。在这项研究中,我们调查了白藜芦醇对表型调制的影响去分化和细胞内信号转导途径的血小板衍生生长factor-bb (PDGF-bb)在大鼠主动脉血管平滑肌细胞(RAOSMCs)。与白藜芦醇治疗RAOSMCs显示剂量依赖性抑制PDGF-bb-stimulated增殖。白藜芦醇治疗抑制这种表型改变和肌动蛋白丝拆卸和维护收缩phenotype-related蛋白质的表达,如calponin和平滑肌actin-alpha相比只有PDGF-bb RAOSMC刺激。尽管PDGF刺激引起强大的和可检测Akt mTOR磷酸化持续几个小时,Akt激活PDGF在使用中的弱白藜芦醇。相比之下,白藜芦醇稍微抑制磷酸化MAPK和p38 MAPK的42/44。总之,RAOSMC去分化、表型和增殖率被白藜芦醇抑制通过中断Akt的平衡,42/44MAPK, p38MAPK途径激活PDGF-bb刺激。
1。介绍
血管平滑肌细胞(VSMC)展览分化,生物合成,收缩的角色在媒体层成熟的血管。然而,VSMC去分化诱导针对损伤在一个容器,其次是表型调制增殖,迁移,合成表型和细胞外基质蛋白沉积,导致内膜的增生(1- - - - - -3]。分化VSMCs在正常血管收缩表型,spindle-like细长的形态和更小的单元尺寸。相反,肉瘤VSMCs在受伤的船只有一个合成表型,肥厚性外观,山坡和山谷增长,相对更大的规模。除了这些形态和功能改变,从收缩VSMCs合成表型的改变是由SMC-specific分子标记,如caldesmon calponin, alpha-tropomysin,平滑肌肌球蛋白重链,SM22和平滑肌α肌动蛋白(SMA) [4- - - - - -6]。
血小板衍生生长factor-bb (PDGF-bb)是一种最有效的有丝分裂原,VSMCs化学引诱物。PDGF-bb PDGF受体结合(PDGFR)以及利用酪氨酸激酶受体信号导致生成活性氧(ROS),随后激活细胞内的信号级联,包括细胞外signal-regulated激酶(ERK)和p38增殖蛋白激酶(MAPK)途径和磷脂酰肌醇3-kinase-Akt (PI3K-Akt)通路。它也已被证明能够促进VSMC去分化(7- - - - - -9]。Akt是增长的主要信号传感器factor-mediated转录和促进细胞生存通过抑制细胞凋亡。此外,Akt通路mTOR的主要触发信号,和Akt-mediated磷酸化mTOR激活直接相关。mTOR蛋白已经涉及到心血管疾病,尤其是心肌肥大(10,11]。
白藜芦醇(3、4′,5-trihydroxystilbene),一种天然的分子称为植物抗毒素,复调化合物存在于葡萄和红酒。白藜芦醇也具有抗氧化,抗炎,抗血栓,抗增殖效果。此外,不同的研究表明,白藜芦醇抑制低密度脂蛋白的氧化(oxLDL)和动脉粥样硬化病变的早期发展和保护心肌细胞对缺血再灌注损伤(12- - - - - -14]。尽管大量研究解决红酒对心脏保护消费的影响,酒精中含有红酒与白藜芦醇引起预期的效果。出于这个原因,一些研究已经表明,白藜芦醇补充剂和dealcoholized红酒都有生理活动(心血管保护15,16]。
在这项研究中,我们调查了白藜芦醇对扩散的影响,表型调制和细胞内信号转导途径PDGF-bb-induced大鼠主动脉血管平滑肌细胞(RAOSMCs)。我们的结果证明白藜芦醇的抑制机制的表型调制PDGF-bb-stimulated RAOSMCs。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
主要培养大鼠主动脉平滑肌细胞(RAOSMCs Biobud,首尔,韩国)例行维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和1% antibiotic-antimycotic解决方案包含10000台青霉素、链霉素10毫克,25岁μg / mL两性霉素B(σ)37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。对于实验,细胞使用段落之间的5和10。
2.2。细胞刺激白藜芦醇的PDGF-bb和治疗
RAOSMCs增长到80 - 90%的融合和同步在实验前血清DMEM培养基的48 h。Trans-resveratrol(σ)溶解在50%二甲亚砜(DMSO)(σ)的股票解100毫米,然后稀释至所需浓度与媒体前细胞治疗。细胞与不同浓度的白藜芦醇治疗:10 ~ 200μ在细胞增殖测定M, 20μM细胞形态学分析,100年μ米在西方墨点法静止细胞有或没有10 ng / mL PDGF-bb指定次。
2.3。细胞增殖、DNA合成
MTT比色细胞生存能力分析(减少3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium紫色甲瓒产品,σ)。MTT测定,细胞与肝癌和0.5毫克/毫升孵化文化时期的最后4 h和测试在37°C在黑暗中。媒体被套利交易,产生甲瓒盐溶解在DMSO溶液,和570海里的吸光度测定的自动标(光谱Max 340分子设备有限公司,桑尼维尔,美国)。DNA合成是由一个5-bromo-2′脱氧尿苷(BrdU)结合试验(罗氏应用科学,首尔,韩国)。简而言之,BrdU-labeling的解决方案是添加到细胞,细胞培养2 h在37°C。标签中被移除,并与固定细胞被孵化的解决方案在室温下30分钟。固定后的细胞,anti-BrdU-POD工作解决方案添加和细胞培养在室温下90分钟。然后,衬底的解决方案是添加,吸光度测量在370 nm波长492 nm参考自动标(光谱Max 340,分子设备有限公司)。
2.4。免疫荧光分析
融合细胞种植在盖玻片至50%,serum-starved 48 h,然后刺激有或没有10 ng / mL PDGF-bb和10或20μ白藜芦醇。刺激细胞被固定在10%福尔马林溶液和permeabilized Triton x - 100 0.5%磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.6)。然后,细胞被封锁5%牛血清白蛋白(BSA,σ)和孵化anti-smooth肌肉肌动蛋白-(SMA, Dako北美Inc .)、美国CA)和anti-calponin(圣克鲁斯生物技术公司,Sana克鲁斯,CA,美国)。细胞被二次抗体孵育,goat-anti-mouse IgG-conjugated德克萨斯红(Santa Cruz)。Alexa 488 -共轭罗丹明phalloidin (5 U /毫升,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)被用来可视化压力f -肌动蛋白纤维,和核沾染了赫斯特33528年。盖玻片与水安装安装介质(Dako Faramount, Dako北美Inc .),并使用荧光显微镜图像进行评估(奥林巴斯、东京、日本)配备了dp - 71数码相机(奥林巴斯)。
2.5。形态学分析
细胞形态学分析,质膜被染色和德克萨斯红C2-maleimide可视化(5 U / mL,英杰公司)和赫斯特33258 (1μ在PBS g / mL,σ)。荧光显微镜图像捕获(奥林巴斯)配备了dp - 71数码相机(奥林巴斯)。细胞循环和一个区域的100个细胞每组进行了分析使用ImageJ软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。循环测量来确定收缩表型之间的形态分布和RAOSMCs合成表型。循环提出了从0到1,值接近0表明纺锤体形态和那些接近1表示一个圆形表型[17,18]。
2.6。西方墨点法
与PDGF-bb时间进程的刺激后,这些细胞被洗两次冷PBS(10毫米,pH值7.4)。冰冷的里帕裂解缓冲(圣克鲁斯生物技术)添加到细胞5分钟。细胞刮,溶解产物是通过在14000×g离心20分钟在4°C。最后得到的上层清液(总细胞溶解产物)收集。蛋白质浓度测定用直流Bio-Rad分析工具包(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)。免疫印迹分析,蛋白质被10 - 15% sds - page分离然后electrotransferred到PVDF膜。膜被阻断缓冲区(5%牛血清白蛋白和1% Tween-20 20 mM TBS, pH值7.6)在室温下1 h,然后一夜之间探索与抗体phospho-PDGFR -(p-PDGFR -Tyr751)总PDGFR -phospho-MEK1/2 (p-MEK1/2 Ser217/221),总MEK1/2 phospho-p42/44MAPK (p-p42/44MAPK Thr202 / Tyr204),总p42/44MAPK phospho-Akt (p-Akt Ser473),总Akt, phospho-mTOR (p-mTOR Ser2448),总mTOR phospho-p38 MAPK (p-p38MAPK Thr180 / Tyr182)和总p38MAPK。抗体是购自细胞信号技术(美国马丹弗斯)和用于1:1000稀释。检测辣根peroxidase-conjugated二级抗体(即。,anti-rabbit IgG (1 : 2,000) and antimouse IgG (1 : 2,000) from Santa Cruz Biotechnology Inc.) was accomplished using enhanced chemiluminescence of the ECL Plus detection kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England). The band intensity was quantified using ImageJ software (NIH) and relative fold exchanges averaged across the three experiments (normalized to phosphorylated forms and total forms) are shown below each band.
2.7。统计分析
所有变量在三个独立的文化对于每个测试实验。结果报告的意思SD而参与。使用单向方差分析进行统计分析,其次是图基的HSD为多个比较使用SPSS软件进行测试。一个价值0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。白藜芦醇在RAOSMCs PDGF-bb-Induced增殖的抑制作用
评估是否白藜芦醇抑制PDGF-bb-stimulated RAOSMC增殖,serum-starved RAOSMCs孵化了10 ng / mL PDGF-bb和增加浓度的白藜芦醇48 h。治疗10 ng / mL PDGF-bb诱导扩散RAOSMCs相比,nonstimulated细胞。然而,白藜芦醇的存在导致显著(在细胞生长(图)存在剂量依赖的相关性降低1(一))。细胞治疗时增加浓度的白藜芦醇,显著()减少存在剂量依赖的相关性观察细胞生长在50岁开始μm . DNA合成的水平也是衡量细胞增殖试验。刺激RAOSMCs 10 ng / mL PDGF-bb引起DNA量显著增加,和白藜芦醇显著抑制浓度的方式增加(图1 (b))。此外,增加细胞活力和DNA合成PDGF-bb刺激引起的完全抑制细胞内浓度的白藜芦醇处理大于100μm .这些结果表明,白藜芦醇产生一种强有力的抗增殖作用PDGF-bb-stimulated RAOSMC增殖。
(一)
(b)
3.2。抑制作用的白藜芦醇PDGF-bb-Stimulated RAOSMC形态和表型
定义表型交易所PDGF刺激,我们评估RAOSMC表型和形态使用免疫荧光和抗体采用免疫染色SMA和calponin。RAOSMCs被种植在玻璃罩,缺乏血清48 h,刺激存在和缺乏PDGF-bb白藜芦醇24 h。
RAOSMCs展出伸长和纺锤体的形态在长期血清剥夺。如图2,RAOSMCs serum-starved 48小时显示对齐排列的肌动蛋白丝组织细胞骨架网络。相比之下,PDGF-bb-stimulated RAOSMCs显示拆卸分布和聚集在细胞核周围的区域没有明显的丝状肌动蛋白丝组织。然而,RAOSMCs白藜芦醇处理维护spindle-like形状和组织的肌动蛋白丝通过抑制PDGF-bb-stimulation的影响。
因此,细胞检查contractile-related蛋白质的积累,SMA(图3(一个))和calponin(图3 (d)组织),在明确的肌动蛋白丝。与PDGF-bb RAOSMCs刺激时,细胞进行形态学观察变化从纺锤状多边形,和相对较低的水平SMA(图3 (b))和calponin指出(图3 (e)),拆卸分布细胞溶质的肌动蛋白丝。然而,治疗20μM白藜芦醇抑制形态学变化。此外,细胞白藜芦醇处理时,肌动蛋白细胞骨架保持平行的肌动蛋白丝与收缩phenotype-related形成一个复杂的蛋白质,包括SMA(图3 (c))和calponin(图3 (f))。决定细胞的形态分布,循环被ImageJ测量分析。serum-starved细胞相比,PDGF-bb-stimulated细胞表现出更大的环状分布,而细胞白藜芦醇处理表现出较低的循环(图4(一))。的平均循环PDGF-bb-stimulated细胞明显高于参与细胞。然而,resveratrol-treated细胞刺激PDGF-bb没有显著不同于参与细胞(图4 (b))。因此,PDGF-bb-stimulated RAOSMCs面积更大而serum-starved RAOSMCs。白藜芦醇抑制刺激的变化区域PDGF-bb(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
3.3。去分化的抑制机制在PDGF-bb-Stimulated RAOSMCs白藜芦醇
与白藜芦醇治疗RAOSMCs显著抑制PDGF-bb-stimulated核扩散剂量依赖性的方式。此外,与100年治疗的细胞μM白藜芦醇ROASMCs几乎完全抑制了增长,通过DNA合成试验和MTT试验所示。
定义参与PDGF-bb-stimulated白藜芦醇对信号通路的影响去分化,serum-starved细胞被刺激10 ng / mL PDGF-bb白藜芦醇的缺失或存在的指定时间。然后,我们分析了p42/44MAPK的激活,p38MAPK, Akt,下游效应器PDGF-bb-induced信号,通过免疫印迹。
添加10 ng / mL PDGF-bb serum-starved细胞导致PDGFR -磷酸化,在10分钟的刺激达到顶峰,returnedto基线水平后2 ~ 4 h,得到了类似的结果在至少三个独立实验(图5(一个))。然而,白藜芦醇治疗抑制PDGFR -磷酸化诱导byPDGF-bb仅10分钟,虽然没有抑制PDGFR -观察磷酸化在孵化项目超过30分钟。
(一)
(b)
(c)
(d)
以类似方式,PDGF-bb刺激MEK1/2等下游效应器的磷酸化,p42/44MAPK(图5 (b))和p38(图5 (c)),白藜芦醇稍微抑制PDGF-bb-induced MEK1/2磷酸化,p42/44MAPK, p38MAPK时间的方式。然而,如图5 (d),PDGF刺激引起强大的和可检测信号和Akt mTOR磷酸化几个小时,白藜芦醇治疗明显抑制PDGF-mediated磷酸化Akt和mTOR的下游效应依赖于一种蛋白激酶。
4所示。讨论
改变分化的VSMC发挥重要作用在心血管疾病,如动脉粥样硬化、高血压、哮喘、和血管动脉瘤。识别肉瘤VSMCs是基于形态学标准符合条款“表型调制”或“表型转换”功能和结构属性。从收缩表型转换合成表型伴随着细胞的增殖和迁移19,20.]。
PDGF, VSMCs扩散的关键中介,扮演着一个重要的角色在各种血管疾病的发病机理。已经报道,PDGF-bb涉及细胞内ROS生成和VSMC生长(7,21]。此外,信号通路影响PDGF非常相似,由氧化应激激活(22,23]。PDGF-bb压制VSMC基因表达特点通过激活细胞外signal-regulated激酶1/2-mitogen激活蛋白激酶(ERK1/2-MAPK), p38 MAPK和Akt通路培养VSMCs [24,25]。
本研究报告,PDGF-bb治疗引起典型的去分化表型变化RAOSMCs通过激活p42/44 MAPK, p38 MAPK和Akt通路。在我们的实验系统中,白藜芦醇抑制扩散PDGF-bb-stimulated RAOSMCs。细胞的收缩形态和主轴表型也保存了白藜芦醇治疗。因此,VSMC分化的标志,如SMA和calponin,没有被白藜芦醇治疗。换句话说,白藜芦醇可能阻止形态学变化收缩合成表型。VSMCs在成熟动物血管展览收缩表型(分化状态)和表达多个收缩蛋白,包括SMA, SM22,SM-MHC [26,27]。Calponin和SMA详细特征作为平滑肌薄丝的f -肌动蛋白绑定组件,和他们控制actin-based细胞过程通过调节肌动蛋白细胞骨架的稳定性(6,28]。
PDGF-bb引起的信号转导途径的调查显示,白藜芦醇可以抑制磷酸化的PDGFR -,42/44 MAPK, Akt, p38MAPK。特别是,Akt / mTOR磷酸化在PDGF-bb-induced优先抑制细胞治疗白藜芦醇。众所周知,VSMC表型是由变化的平衡之间的激活Akt通路,ERK和p38MAPK通路。因此,Akt通路起着至关重要的作用在维持分化表型(29日]。
phosphoinositol-Akt-mammalian rapamycin-p70S6激酶的目标(PIK / Akt / mTOR / p70S6K)通路调节细胞生长和细胞分化,以应对营养,生长因子,细胞因子(30.,31日]。药理与雷帕霉素抑制引起收缩形态,SM2-MHC, calponin、蛋白质减少,胶原蛋白合成的合成表型VSMCs文化监管mTOR / p70 S6 K1通路(30.]。以前的研究已经表明mTOR激活诱导SMC增殖并要求激活的信号级联PI3K /基因/ Akt, PI3K抑制剂的效果评估的渥曼青霉素和Ly294002,此后该块(10,11,32]。因此,白藜芦醇抑制SMC表型调制通过改变之间的平衡的一种蛋白激酶和MAPK通路通过阻碍PDGF-bb-induced Akt通路,但不是ERK和p38MAPK通路。此外,抑制mTOR / Akt通路在SMC白藜芦醇不仅DNA合成的影响,而且phenotype-related蛋白质的表达。植物多酚的急性或慢性管理病人被发现导致vasoprotective,反血管增生,antiatherogenic vasorelaxant,降压效果33]。一些报告表明白藜芦醇抑制VSMC增殖的效果(34,35]。此外,它已经表明,白藜芦醇特别块PI3K /基因/ Akt通路,从而抑制oxLDL-induced SMC增殖(14]。
在这项研究中,我们专注于白藜芦醇的影响与PDGF-bb表型调制后RAOSMCs刺激。从一般的角度来看,白藜芦醇展览各种潜在的抑制去分化上的属性,包括一个抗增殖作用和调节的能力重要的增长信号通路。
5。结论
在这项研究中,我们调查了白藜芦醇的影响由PDGF-bb RAOSMCs叶片外植体诱导。白藜芦醇抑制去分化、表型改变和增殖率,刺激PDGF-bb RAOSMC。总之,我们的结果表明,这种效应可能是通过微分调节介导之间平衡的一种蛋白激酶,42/44MAPK, p38MAPK通路激活PDGF-bb至少部分刺激的白藜芦醇的影响。这个结果表明,白藜芦醇可能是一种抑制剂的表型调制发生在动脉狭窄和postangioplasty血管损伤后再狭窄。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突与任何金融组织中提到的关于商业的身份。
承认
本研究支持韩国医疗技术研发项目的资助,健康和福利,大韩民国(A120878)。