文摘

尽管胰岛素调节葡萄糖代谢和与肝癌密切关联,分子机制还有待阐明。在这项研究中,我们试图理解的胰岛素促进肝癌代谢机制。我们发现,胰岛素增加丙酮酸激酶M2 (PKM2)表达式通过活性氧(ROS)调节葡萄糖消耗和乳酸生产、关键过程的糖酵解肝癌Bel7402细胞HepG2。发现有趣的是,insulin-induced ROS负责抑制mir - 145和mir - 128,并迫使表达mir - 145或mir - 128足以废除insulin-induced PKM2表达式。此外,击倒PKM2的表达式也抑制癌细胞的生长和insulin-induced葡萄糖消耗和乳酸生产,表明PKM2是胰岛素的功能的下游区。综上所述,本研究将提供一个新的见解insulin-induced糖酵解的机制。

1。介绍

胰岛素是已知在人类的葡萄糖代谢中发挥重要作用[1]。许多人类疾病引起葡萄糖代谢疾病如糖尿病和癌症(2,3]。然而,癌症的胰岛素调节葡萄糖代谢的分子机制还有待阐明。期间观察到变化的病原糖酵解酶癌症新陈代谢。在这些酶、丙酮酸激酶(PK)在催化丙酮酸的形成中扮演着关键角色从磷酸烯醇丙酮酸和ATP和ADP (4,5]。有四个亚型PK的哺乳动物,PKL PKR、PKM1, PKM2。PKL、PKR和PKM1组织同功酶,而PKM2被认为是胚胎和癌症特异性同种型(6]。证据支持,组织同功酶的损失和随后表达PKM2参与肿瘤发生的恶性发展。击倒PKM2表达或更换PKM2 PKM1已被证实能抑制癌症的代谢和肿瘤的生长5,7]。HIF-1等转录因子α和其他基因与肿瘤发生有关的PKM2活化剂,而许多与细胞增殖相关的基因,代谢,肿瘤生长是下游PKM2的目标(8- - - - - -10]。

近年来证据表明活性氧簇(ROS)的至关重要的作用在癌症细胞功能(11]。高水平的内源活性氧产量与癌症发展(12,13]。ROS,特别是过氧化氢(H2O2),也由各种外部刺激器包括胰岛素等生长因子(14]。然而,ROS的角色在癌细胞,以应对生产insulin-induced葡萄糖代谢仍有待阐明。

最近,microrna已知参与许多人类疾病,如糖尿病和癌症15,16]。microrna很小,非编码rna已经证实是一种新的基因表达监管机构通过负调控蛋白编码基因。microrna的因果作用在癌症文献记载和miRNA-based抗癌疗法正在开发(17,18]。据报道,几个microrna与明显的角色在癌症参与胰岛素和ROS信号通路。例如,Let-7家族在多个器官(葡萄糖代谢调节多个方面19];mir - 143调节葡萄糖代谢的癌细胞靶向己糖激酶(HK2)[2对碘氧基苯甲醚20.];miR-21是ROS的一个重要目标21]。尽管这些研究,microrna是否参加insulin-induced PKM2表达和PKM2的潜在机制产生的影响在这个病理仍不明朗。

在目前的研究中,我们计划研究(1)ROS是否会参与调节胰岛素在肝癌细胞糖酵解;(2)胰岛素调节PKM2表达式通过ROS生产;(3)胰岛素上调PKM2在ROS依赖通过microrna的表达方式表达;和(4)需要PKM2 insulin-induced有氧糖酵解。这些研究将决定ROS的角色/ microrna PKM2在调节胰岛素的影响,有助于了解胰岛素调节的机制肝癌细胞糖酵解。

2。材料和方法

2.1。试剂和细胞培养

人类HepG2肝癌细胞获得美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。人类肝癌细胞系BeL7402细胞库的获得中国科学院(中国上海)。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)补充5%的边后卫,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μ在37°C g / mL) 5%的股份有限公司2孵化器。胰蛋白酶(0.25%)/ EDTA溶液用于分离细胞接种的细胞。胰岛素是购自σ(圣路易斯,密苏里州)。

2.2。ROS测量

HepG2细胞被播种在8×10 12-well板4在37°C细胞/好,培养24小时。细胞在无血清培养基培养24 h,其次是与过氧化氢酶预处理(1500 U /毫升)1 h。CM-H2DCFDA (5μ米)(美国表达载体)添加和细胞孵育10分钟。细胞被刺激胰岛素(200海里)10分钟。这些细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和缓冲福尔马林固定为10%。用荧光显微镜捕获的图像。

2.3。丙二醛(MDA)的分析

细胞MDA含量测定的硫代巴比土酸(稍后通知)方法使用一种分析工具根据工厂指导(Beyotime生物科技、上海、中国)。短暂、蛋白质样本孵化与稍后通知在100°C 15分钟,随后在1000×g离心10分钟。上层清液转移到96孔板,在532 nm和吸光度测定。MDA水平进行了分析和归一化样品蛋白质浓度。

2.4。测量葡萄糖消耗和乳酸生产

总共5×104细胞每被播种在24-well盘子和作为。细胞使胰蛋白酶化和统计,同时收集细胞培养基的上层清液。媒体立即化验了葡萄糖和乳酸乳酸水平利用葡萄糖试验设备和试验设备(Biovision山景,CA)根据制造商的指示。葡萄糖消耗和乳酸生产标准化的手机号。实验进行了三个复制和重复了三遍。

2.5。实时rt - pcr

从细胞总rna孤立使用试剂盒(美国英杰公司)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成了1μg总rna使用PrimeScriptTM RT试剂盒(豆类,中国)。整除的互补dna被用于定量实时PCR使用SYBR预混料DimerEraser(豆类,中国)。mir - 145的表达水平和mir - 128规范化U6水平,表达水平PKM2的规范化为每个样本,GAPDH水平和褶皱的变化被相对量化计算 。引物用于补充表1中列出的在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/504953。

2.6。西方墨点法和抗体

细胞收获和细胞溶解radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲补充蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。蛋白质提取被SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)分离,转移到硝化纤维膜,和孵化抗体PKM2(邮递到梨城Signalway生物技术、TX) HIF-1α(BD生物科学、火花、MD), p70S6K1(细胞信号技术,丹弗斯,MA)和GAPDH(σ,圣路易斯,密苏里州)。蛋白质乐队与辣根过氧化物酶被孵化,(合)共轭抗体和可视化使用超级信号西方Pico化学发光底物包(热科学,罗克福德,IL)。

2.7。瞬时转染

双链mir - 145和mir - 128和紧急控制前体合成了Gene-pharma(上海,中国)。HepG2 Bel7402细胞转染和mir - 145, mir - 128,或争夺控制前体Lipofectamine 2000(美国英杰公司)根据制造商的指示。microrna的前体的序列补充表2中列出。

小核RNA)双寡核苷酸针对人类PKM2 (siPKM2)或炒控制(siSCR)从GenePharma购买(上海,中国)。HepG2 Bel7402细胞转染和siPKM2或siSCR使用Lipofectamine RNAiMax(表达载体)血清Opti-MEM根据制造商的指示。的小干扰RNA序列PKM2补充表3中列出。

2.8。细胞增殖实验

HepG2 Bel7402细胞转染和siPKM2或紧急控制和培养24小时的37°C。然后细胞使胰蛋白酶化、resuspended和播种在3000细胞/ 96孔板。在细胞增殖测定12 h, 24 h, 48 h, 72 h和96 h使用细胞计数Kit-8 (CCK-8) (Dojindo实验室、熊本、日本)根据制造商的指示。所有实验进行了一式三份,并重复了三遍。

2.9。统计分析

数值结果给出了平均数±标准差。基于学生的统计分析 以及显著性水平的 使用GraphPad棱镜软件。

3所示。结果

3.1。证据的参与活性氧在调节胰岛素在肝癌细胞糖酵解

尽管胰岛素与多种癌症有关,肝细胞功能(22,23],ROS作为二级信使调节癌症信号,它仍然是未知是否ROS参与胰岛素信号传输。为此,ROS水平在HepG2细胞对胰岛素治疗的反应进行了分析。采用无血清细胞培养技术,其次是胰岛素的治疗。如数据所示1(一)和1 (b)、治疗与胰岛素的细胞ROS水平较高。增加活性氧清除剂过氧化氢酶阻止胰岛素治疗的效果。HepG2的进一步实验研究并使用MDA Bel7402细胞分析,一个稳定的氧化应激指标。结果表明,MDA水平的胰岛素治疗时增加约2倍的价格相比细胞没有胰岛素治疗。过氧化氢酶政府明显降低(图insulin-induced MDA水平1 (c))。这些数据表明,胰岛素能诱导活性氧的生产。

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图1
胰岛素促进MDA生产葡萄糖消耗和通过在肝癌细胞ROS生产乳酸的生产。(一)HepG2细胞被播种在8×10 12-well板4在37°C细胞/好,培养24小时。细胞在无血清培养基培养24 h,其次是与过氧化氢酶预处理(1500 U /毫升)1 h。CM-H2DCFDA (5μ米)添加和细胞孵育10分钟。细胞被刺激胰岛素(200海里)10分钟。1 x PBS的细胞被洗了三次。代表与荧光显微镜图像被抓获。酒吧,50μm。(b)的ROS水平荧光信号被ImageJ量化;* * 与相同的细胞系没有胰岛素治疗和过氧化氢酶;# # 相比单独细胞胰岛素治疗。(c) HepG2 Bel7402细胞无血清培养系统在一夜之间。然后,细胞治疗与过氧化氢酶(1500 U /毫升)1 h,紧随其后的是胰岛素治疗(200海里)12 h。收集的蛋白质和MDA进行分析。提出的数据意味着±SD ( )。* *相同的价格相比显著差异细胞系或没有胰岛素治疗和过氧化氢酶( );#和# #单独细胞胰岛素治疗相比差异显著( 和 、职责)。(d)和(e)和Bel7402细胞HepG2细胞被播种在24-well盘子和无血清培养系统在24 h,紧随其后的是过氧化氢酶治疗(1500 U /毫升)1 h。细胞被刺激胰岛素(200海里)12 h。中收集和葡萄糖消耗和乳酸生产水平进行了分析。数据均值±SD从三个独立的实验。* * 和* 与相同的细胞系没有胰岛素治疗和过氧化氢酶;# 和# # 相比单独细胞胰岛素治疗。

接下来,我们检查了ROS对insulin-regulating葡萄糖能量代谢的影响。胰岛素显著增加葡萄糖消耗和乳酸生产HepG2和Bel7402细胞。政府的过氧化氢酶减毒引起的葡萄糖代谢的增加胰岛素(数字1 (d)和1 (e))。因此,看来ROS参与调节胰岛素糖酵解。

3.2。胰岛素诱导PKM2表达式通过活性氧产量

丙酮酸激酶M2 (PKM2),糖酵解的关键激酶,催化反应,将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)丙酮酸生产ATP。PKM2的表达水平作为一个重要的肿瘤细胞的代谢特征。测试是否通过调节胰岛素促进糖酵解PKM2表达式,HepG2细胞和Bel7402细胞无血清培养系统在24 h和暴露为0 h 200海里的胰岛素,3 h, 6 h, 12 h。免疫印迹结果表明胰岛素显著诱导PKM2表达时间的方式(数字2(一个)和2 (b))。

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图2
Insulin-induced PKM2表达式被过氧化氢酶抑制。(一)HepG2细胞和Bel7402细胞无血清培养系统70%汇合,然后饿死在24 h。胰岛素的细胞暴露在200 nM 0 h、3 h, 6 h, 12 h。PKM2水平取决于免疫印迹。(b)的相对密度PKM2 / GAPDH三个独立实验规范化的控制和平均数±标准差。*控制没有胰岛素治疗相比差异显著( )。(c)挨饿HepG2细胞和Bel7402细胞是用过氧化氢酶预处理(1500 U /毫升)1 h,紧随其后的是刺激与胰岛素(200海里)6 h。蛋白表达是由免疫印迹。(d)结果表示为一个百分比的控制文化和均值±SD从三个复制。(e)和Bel7402细胞HepG2细胞治疗(c)。总rna提取,用于实时rt - pcr检测PKM2和GAPDH mRNA水平。* *相比显著差异控制没有胰岛素和过氧化氢酶治疗治疗没有胰岛素和过氧化氢酶( );# #单独细胞胰岛素治疗相比差异显著( )。

因为我们表明,活性氧引起的胰岛素,我们测试是否胰岛素诱导PKM2表达式通过活性氧产量。HepG2的预处理与过氧化氢酶大大抑制Bel7402细胞PKM2胰岛素引起的蛋白质含量(数字2 (c)和2 (d))。进行了进一步的实验通过使用实时PCR分析PKM2 mRNA表达水平。同样,PKM2 mRNA水平增强胰岛素治疗和减少了过氧化氢酶治疗(图2 (e))。这个结果表明insulin-induced PKM2表达式需要ROS生产。

3.3。胰岛素上调PKM2表达ROS依赖的方式通过mir - 145和mir - 128的表达

有越来越多的证据的microrna的表达可能改变外生的代理,至少在某种程度上,诱导细胞内胰岛素和氧化应激(21,24]。过氧化氢处理抑制mir - 145和mir - 128表达(图S1),这表明ROS抑制mir - 145和mir - 128表达。测试是否胰岛素影响mir - 145通过ROS和mir - 128表达,我们表明,预处理HepG2 Bel7402细胞过氧化氢酶大大诱发mir - 145的表达水平和mir - 128抑制胰岛素(图3(一个))。这一结果表明,调节胰岛素的表达mir - 145以及mir - 128需要ROS生产。

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图3
mir - 145和mir - 128抑制胰岛素和参与insulin-induced PKM2表达式。(一)HepG2细胞和Bel7402细胞无血清培养系统隔夜和转向20 h。饥饿的细胞用过氧化氢酶预处理(1500 U /毫升)1 h。增加了胰岛素(200海里)的细胞被孵化6 h。总rna提取,用于实时rt - pcr检测mir - 145的表达水平,mir - 128, U6。*和* *的显著差异与控制( 和 );# #显著性差异,而单独胰岛素治疗( )。(b) HepG2细胞和Bel7402细胞转染和mir - 145, mir - 128,或microrna的紧急控制前体。转染24小时后,细胞无血清培养系统在20 h和没有或胰岛素治疗(200海里)6 h。蛋白表达水平的p70S6K1 HIF-1α、PKM2 GAPDH是由免疫印迹。(c)、(d)和蛋白质(e)相对密度量化使用ImageJ软件。结果提出了均值±SD从三个独立的实验。*和* *的显著差异而争夺的价值控制( 和 );#和# #单独接受胰岛素相比显著差异( 和 )。

我们以前的研究表明,p70S6K1 mir - 145的直接目标和mir - 128在卵巢癌细胞和神经胶质瘤细胞25,26]。我们发现p70S6 K1和HIF-1α为了应对胰岛素治疗水平。如数据所示3 (b),3 (c),3 (d),p70S6K1 HIF-1α蛋白质含量增加胰岛素治疗后,除了mir - 128或mir - 145的前兆抑制insulin-induced p70S6K1 HIF-1α表达式。这一结果表明,mir - 128或mir - 145需要insulin-induced p70S6K1和HIF-1的表情α。因为我们表明,mir - 128和mir - 145所需insulin-induced p70S6K1 HIF-1α表达式,我们测试了insulin-suppressing mir - 128和mir - 145是否可以扮演一个角色在PKM2在HepG2和Bel7402细胞表达。为了验证这一点,mir - 128的细胞进行预处理和mir - 145然后刺激胰岛素。mir - 128和mir - 145治疗抑制insulin-induced PKM2(人物的表情3 (b)和3 (e)),表明mir - 128和mir - 145所需insulin-induced PKM2表达式。

3.4。PKM2 Insulin-Induced有氧糖酵解和细胞生长至关重要

测试是否PKM2表达式的抑制减弱insulin-induced糖酵解,HepG2和Bel7402细胞转染核PKM2或炒控制核。与siPKM2转染后,PKM2的表达水平显著抑制70 - 80%相比,炒控制数据4(一)和4 (b))。胰岛素的葡萄糖消耗和乳酸生产增加了2倍与对照组相比没有胰岛素治疗,而PKM2击倒抑制insulin-induced葡萄糖消耗和乳酸生产到50%和60%,分别为(数字4 (c)和4 (d))。这些结果证实PKM2在insulin-regulating糖酵解是一个重要的监管机构。

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图4
击倒的PKM2足以抑制insulin-induced葡萄糖消耗,乳酸生产和细胞增殖。(一个)小干扰rna对HepG2和Bel7402细胞转染PKM2 (siPKM2)或争夺控制(siSCR) 48 h。免疫印迹PKM2的蛋白质含量进行了分析。(b)的相对密度PKM2 / GAPDH三个独立实验规范化的控制和平均数±标准差。* * *显示显著差异相比,争夺控制 。(c)和(d) HepG2 Bel7402细胞转染核反对PKM2 (siPKM2)或争夺控制(siSCR) 24 h,紧随其后的是饥饿24小时的无血清培养基。然后,细胞被刺激胰岛素(200海里)12 h。细胞使胰蛋白酶化和计算,而媒介收集。葡萄糖消耗和乳酸生产水平进行了分析。数据均值±SD从三个独立的实验。* * 与siSCR细胞治疗相比差异显著;# 和# # 显著差异相比,细胞接受siSCR和胰岛素。(e)小干扰rna对HepG2和Bel7402细胞转染PKM2 (siPKM2)或争夺控制(siSCR) 24 h。这些细胞被然后使胰蛋白酶化resuspended。细胞每在96 - 3000细胞板。在细胞增殖测定12 h, 24 h, 48 h, 72 h和96 h。价值观代表±SD方法。*和* *而争夺控制( 和 )。

考虑到能量代谢至关重要的生存和增殖的癌细胞,我们检查了PKM2在细胞增殖的影响。siSCR治疗相比,PKM2在HepG2和抑制Bel7402细胞抑制细胞增殖后3 - 4天的文化,这表明PKM2影响细胞生长在体外(图4 (e))。综上所述,这些数据表明PKM2对细胞生长至关重要。

4所示。讨论

胰岛素可以诱导葡萄糖代谢和相关的各种实体肿瘤癌症发展(1,27]。然而,在肿瘤细胞中胰岛素的葡萄糖代谢的机制尚未直接检查。PKM2是最后病原糖酵解代谢的糖酵解酶,这是在胚胎组织和肿瘤细胞中表达的优先4,5]。研究表明,在启动以及恶性肿瘤进展PKM1消失,PKM2又导致从正常细胞代谢转换到有氧糖酵解(28,29日]。以前的研究已经表明PKM2可能诱导转录因子,如HIF-1α,而与细胞增殖相关的基因,代谢,肿瘤生长是下游PKM2的目标。

最近的证据表明的重要性ROS作为第二信使在各种细胞功能(11- - - - - -13]。这里,我们目前的证据表明,ROS晋升的影响insulin-induced培养的肝癌细胞的糖酵解和PKM2表达。一般来说,胰岛素导致活性氧水平的增加,过氧化氢酶阻断胰岛素治疗的效果。这个结果与我们之前一致insulin-induced代研究H2O2曲泽细胞(14]。更重要的是,与insulin-induced糖酵解ROS水平呈正相关。PKM2报道必不可少的糖酵解代谢和胰岛素刺激PKM2的表达式(5,28]。我们进一步探讨活性氧的作用在insulin-induced PKM2表达式。结果表明,胰岛素显著诱导PKM2蛋白质和信使rna表达水平和胰岛素引起的过氧化氢酶大大抑制效应。PKM2蛋白质的表达水平与信使核糖核酸的影响,表明可能的其他因素参与insulin-induced PKM2表达式。

据报道,几个microrna被改变以应对外生代理如胰岛素和ROS (19- - - - - -21]。在这项研究中,我们表明,胰岛素抑制mir - 145的表达水平和mir - 128通过活性氧产量。我们以前的研究表明,mir - 145和mir - 128抑制HIF-1α表达式通过直接针对p70S6K1 [25,26]。人类PKM2基因序列显示候选人在第一一定是包含HIF-1结合位点的基因内区5′-ACGTG-3′5′紧随其后-CACA-3′序列,这是发现在许多人力资源(9,30.]。mir - 145之间的相关性和mir - 128表达和调节胰岛素PKM2表达进一步支持我们的结论胰岛素上调PKM2表达式通过mir - 145和mir - 128的表达。然而,胰岛素和ROS的机制抑制mir - 145和mir - 128目前未知。一种可能性是,胰岛素和ROS可能影响mir - 145和mir - 128表达通过DNA甲基化。DNA甲基化已被证明是相关的异常的microrna的表达谱在癌症31日- - - - - -33]。还需要进一步的研究来解决如何胰岛素和活性氧激活mir - 145和mir - 128 HepG2和Bel7402细胞。

此外,我们表明,击倒PKM2表达减少insulin-induced有氧糖酵解和癌症细胞增殖。这可能解释了高胰岛素水平和提升癌症风险之间的联系。此外,本研究可以提供一些有用的信息,PKM2可以作为一个潜在的战略在未来治疗肝癌治疗的目的。

总之,从目前的研究结果表明,ROS提升insulin-induced糖酵解和PKM2表达的影响在人类肝癌细胞胰岛素上调PKM2表达ROS依赖的方式通过mir - 145和mir - 128抑制,这对insulin-induced PKM2是重要的有氧糖酵解和细胞增殖。我们的研究结果有助于理解癌症代谢和胰岛素的作用也提供新的见解PKM2在肝癌的发病机制中的作用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

气李、刘雪和玉尹同样这项工作。

确认

本研究支持部分由中国国家重点基础研究计划(2011 cb504003),中国国家自然科学基金(81071642和81071642),NIEHS,国家卫生研究院授予R01ES020868。

补充材料

mir - 128和mir - 145抑制ROS。有越来越多的证据的microrna的表达可能改变外生的代理,至少在某种程度上,诱导细胞内胰岛素和氧化应激(21日24)。使用过氧化氢我们治疗肝癌细胞,发现mir - 128和mir - 145表达水平被过氧化氢HepG2和抑制Bel7402细胞(图S1)。这一结果表明,ROS抑制mir - 128和mir - 145表达。

补充图传奇:FIGURE.S1。HepG2细胞和Bel7402细胞无血清培养系统在一夜之间。细胞治疗50µM过氧化氢6 h。总rna提取,用于实时rt - pcr分析检测mir - 145的表达水平,mir - 128和U6。* *表示控制相比差异显著(p < 0.01)。

  1. 补充材料