BMP-2过度增加血管平滑肌细胞运动性弗吉尼亚州移植肌凝蛋白通过Erk信号

文摘

背景。生理的影响血管平滑肌细胞(VSMC)迁移启动动脉粥样硬化的发展。生化机制导致失调VSMC运动性仍然未知。最近,细胞因子BMP-2涉及多种血管生理和病理过程。然而,BMP-2是否影响VSMC能动性,或者通过什么方式,从来没有被调查。方法。VSMCs是adenovirally BMP-2过表达基因转染。VSMC能动性被修改Boyden室试验检测,共焦延时视频分析和殖民地化验受伤。基因芯片阵列和rt - pcr是用来识别基因可能由BMP-2监管。免疫印迹和实时PCR检测到弗吉尼亚州肌凝蛋白的表达和细胞外的磷酸化signal-regulated激酶1/2 (Erk1/2)。免疫荧光分析显示肌凝蛋白Va表达式语言环境。细胞内钙^{2 +}振荡被记录下来。结果。VSMC迁移增强在VSMCs overexpressing BMP-2剂量依赖性的方式。弗吉尼亚州siRNA-mediated击倒的肌凝蛋白抑制VSMC的能动性。肌凝蛋白Va mRNA和蛋白表达显著增加后BMP-2政府和被Erk1/2抑制剂U0126抑制。BMP-2诱导Ca^{2 +}振荡,产生很大程度上由“胞质振荡器”。结论。弗吉尼亚州BMP-2显著增加VSMCs迁移和肌凝蛋白表达,通过Erk信号通路和细胞内Ca^{2 +}振荡。我们提供额外的洞察力动脉粥样硬化的病理生理学和弗吉尼亚州BMP-2-induced抑制肌凝蛋白表达可能代表一个潜在的治疗策略。

1。介绍

最近的研究表明,BMP-2,转化生长因子,细胞因子总科,扮演着一个重要的角色在生理和病理生理血管发展(1,2]。转基因BMP-2不足7和10天的生活之间老鼠死于心脏缺陷骨形成之前,表明重大心血管BMP-2[的重要性3]。血管平滑肌细胞(VSMCs)的一个重要来源BMP-2 [4]。VSMC的迁移在动脉粥样硬化,血管内膜媒体是关键发挥核心作用在动脉粥样硬化斑块的成因和restenotic病变(5,6]。

VSMC迁移取决于细胞活性,由肌动蛋白聚合周期,细胞粘附,actin-myosin收缩。肌凝蛋白的大家庭结构多样化actin-dependent分子马达。肌凝蛋白利用能量从ATP水解生成力量单向运动肌动蛋白丝和被视为最重要的蛋白质驾驶细胞迁移(7- - - - - -9]。肌凝蛋白总科包括传统的和非传统的肌凝蛋白(10,11]。中发现的各种细胞器,非常规肌凝蛋白参与RNA和蛋白质运输、细胞运动、信号转导、细胞形态学维护和膜贩运[12]。

非常规肌凝蛋白Va是actin-based马达蛋白运输细胞内的货物,可以束肌动蛋白在体外。肌凝蛋白Va与细胞骨架的关系和功能方面,细胞形态、丝状伪足的能动性,和神经突扩展已报告13- - - - - -15]。最近,弗吉尼亚州肌凝蛋白与人类癌症传播(16,17]。然而,弗吉尼亚州肌凝蛋白在心血管疾病的作用仍不清楚。通过肌凝蛋白Va BMP-2是否会影响VSMCs迁移,如果是这样,机制,仍未决定。我们调查的角色BMP-2作为一个潜在的肌球蛋白虚荣VSMCs调节器和解剖相关的潜在机制。

2。材料和方法

依法进行了研究机构审查委员会(IRB)批准。研究机构伦理委员会批准的协议和IRB的北京安贞医院,首都医科大学的附属。

2.1。细胞培养

大鼠血管平滑肌细胞通过外植体法和生长在primary-cultured rpmi - 1640补充10%的边后卫,100μ100年青霉素g / mLμg / mL链霉素,2毫米谷酰胺37°C的5%股份₂的气氛。rVSMCs在通道4 - 8(用于实验18]。

2.2。重组广告

ViralpAV。EX1d-CMV构造包含老鼠BMP-2 / myc / IRES / EGFP表达来自Cyagen生物科学公司(广州)。通过lipofectamine HEK293细胞被病毒转染。培养基上清液是由双氯化铯梯度超速离心法收集和纯化(19]。病毒在HEK293细胞被空斑实验滴定。身体的病毒粒子浓度(vp /毫升)是由波长决定spectrophotometrically(260海里)的吸光度(20.]。病毒是储存在−80°C到使用。

2.3。细胞活性

细胞被镀在60毫米玻璃microwell菜肴和培养过夜rpmi - 1640含10%的边后卫。细胞运动被徕卡SP5倒置显微镜监控。由CCD摄像机采集到的视频图像(模型3000;徕卡)在15分钟的时间间隔6小时,数字化和存储图像通过图像1.41 J软件栈(国家卫生研究院http://rsb.info.nih.gov/ij/)。图像栈被转换为QuickTime电影。核位置跟踪量化细胞运动性,和速度计算μ垫15分钟间隔相同的软件(21]。

2.4。Boyden室试验

一个整除的每个细胞都镀上24-well BioCoat入侵室(美国BD生物科学)和培养24小时。细胞是由甲醇和固定由结晶紫染色。五个单元格字段数约40倍放大(22]。

2.5。伤分析

细胞被播种在35毫米文化菜(密度细胞每)。24小时后了一个口子的中部地区融合在培养皿中。额外的48小时后,盘子被小心翼翼地清洗去除分离细胞。新鲜的培养基是补充道。文化观察切口的时候,48小时后。相差显微镜检查照片拍摄6切割区域的单独的字段。两个广泛的细胞边缘之间的距离被LAF徕卡测量和分析软件。

2.6。RNA提取,cRNA准备和基因芯片阵列

高质量的RNA从BMP-2感染鼠VMSCs和控制细胞通过凝胶电泳(18岁和28 s波段)和吸光度光谱(240 - 320海里)。简单地说,8μg reverse-transcribed总RNA的低聚糖(dT)底漆耦合T7 RNA聚合酶结合位点。生物素化的互补的RNA (cRNA)然后从产生的互补DNA合成(互补)通过T7聚合酶。25μ克生物素化的cRNA随机剪切和16小时Affymetrix基因芯片杂交。

Affymetrix微阵列(拟南芥基因组ATH1数组)包含22810个探针集,代表大约80%的基因序列在一个数组中。标签和杂交ATH1微阵列(每个芯片一个样本)进行根据制造商的指示http://www.affymetrix.com/estore/)。探测器阵列进行扫描,并进一步分析了Genespring软件(版本5.0;硅遗传学)。正常化每基因和芯片log2值允许执行比较每个实验的三个独立执行复制集。基因被认为是——或者下调BMP-2和控制细胞之间的比例,分别大于2或小于0.5。

2.7。rt - pcr

基因表达是衡量逆转录工具包(美国WI Promega)。简单地说,RT后3μ克总RNA,互补脱氧核糖核酸的合成。RT产品受到PCR与2720年热循环(abi)并通过实时PCR系统中存在快7500 (abi)底漆集表中列出1(a), cDNA glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)担任内部控制。半定量rt - pcr由30个周期94°C, 57.5°C, 72°C(每30秒)。

2.8。免疫印迹分析

细胞颗粒被里帕缓冲细胞溶解。30μ克总蛋白质样品分离10% sds - page和electrophoretically转移到PVDF膜。膜被5%脱脂牛奶图则和室温1小时孵化主要抗体(见表1(b))。二次抗体HRP-IgG申请1小时。三个额外的“洗后,信号被检测到增强化学发光(Amersham生物科学)。

2.9。肌凝蛋白Va的击倒,由核表达

三个特定序列的小核RNA)针对不同地区的鼠MYO5a信使RNA序列设计(RiboBio有限公司,中国。124171130126):siRNA-1: 5′-GGAGAAAGACCACAGATTA-3′;siRNA-2: 5′-GAACCTGATTCTAGAACTA-3′;siRNA-3: 5′-GAAGCAATATAGTGGAGAA-3′。VSMCs与BMP-2转染48小时后的文化因素(250μg / mL)。Lipofectamine转染试剂(8μL)被添加到100μ包含2 nmol / L L OptiMEM无血清培养基的小干扰rna益生元每个,孵化10分钟,并添加到6厘米板包含2毫升的媒介。72小时后,肌凝蛋白的功效Va沉默(即。,reduction of gene and protein expression) was determined.

2.10。免疫荧光分析

细胞被播种到盖滑文化盘子的底部,直到subconfluence,然后被固定为5%乙醇乙酸/ 95% (v / v)为20分钟。阻止非特异性反应,5%的脱脂牛奶增加了30分钟,然后anti-MYO5a多克隆抗体(1:250稀释在PBS)是在室温下进行了1小时。洗后,抗体免疫球蛋白,FITC荧光素(1:800年,杰克逊)添加在室温1小时。在PBS DAPI (1: 2000;DABCOσ)总核染色。成像是由徕卡SP5激光扫描共焦显微镜。

2.11。测定分析

细胞治疗BMP-2 48小时dye-free媒体补充10%的边后卫,离心机之前再悬浮在calcium-free修改Tyrode缓冲区(5.6毫米145毫米氯化钠,氯化钾,100年μM EGTA, 1.0毫米MgCl₂、葡萄糖10毫米和5.0毫米玫瑰,pH值7.2),孵化一个额外的15分钟。荧光测量在室温下通过莱卡SP5共焦成像系统。二维共焦图像在1.5秒的时间间隔。Fluo-4 (Dojindo、日本)我很兴奋在波长488纳米,并在515海里排放检测。的变化被表示为,在那里荧光(休息归一化荧光)除以)。

2.12。统计分析

所有数据提出了平均数±标准差。学生的正反以及比较两组之间的差异。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。由Adenoviral转染成功BMP-2过度增加VSMC的能动性

adenoviral向量奶油水果蛋白饼。与克隆构建EX1d-CMV myc / IRES / EGFP在VSMCs用来BMP-2过表达。净化后,adenoviral效价被放大的重组adenoviral pAV-EX1d系统,达到10⁸电转换单位/毫升(物理病毒粒子浓度vp /毫升)。AGFP蛋白检测在coprimary文化受感染的老鼠VSMCs表达式比率超过90%(图确认1(a))。单个大鼠VSMC迁移追踪通过延时视频显微镜显示BMP-2 overexpressing VSMCs速度比那些感染了向量。更快VSMC迁移导致更大的跨越星状“明星”的形成(图1(b))。平均行驶距离移动单个细胞在六小时观察期间确认每15分钟(BMP-2旅行μm和控制:μ米,图1(c))。移行细胞支架的老鼠VSMCs overexpressing BMP-2 Boyden比较来控制细胞室试验(图1(d))。BMP-2超表达细胞强度增加130%,而独自向量(,图1(e))。试验证明BMP-2受伤影响了细胞的人口流动在48小时内(BMP-2:μm和控制:μ米,,图1(f))。

3.2。BMP-2增加运动性单细胞和多细胞VSMC剂量依赖性的方式

VSMCs治疗不同BMP-2浓度(从50到500 ng / mL)通过Boyden室48小时。图2演示了VSMCs展览迁移效应存在剂量依赖的相关性来响应BMP-2浓度超过100 ng / mL。延时视频显微镜和伤害分析,分别展示了单细胞和多细胞VSMC人口以剂量依赖性的方式回应BMP-2(表2)。

3.3。识别的基因受BMP-2超表达

获得机械的见解关于BMP-2-mediated VSMC迁移便利化,微阵列分析以确定全球基因表达变化BMP-2 overexpressing VSMCs。在VSMCs overexpressing BMP-2, 554个基因表达下调,437个基因在调节。毫不奇怪,BMP信号通路中的基因(如Fstl1 Fstl3 Smad1, Msx1)中那些调节BMP-2超表达。虽然我们的基因芯片阵列确定肌凝蛋白Va BMP-2期间一直调节过度,肌凝蛋白Vb和Vc没有检测到。此外,平滑肌alpha-actin表达式,描述标记的收缩表型,保持不变。信使rna和蛋白质水平的OPN和MGP舒张表型特征标记,明显改变(数字3(一个)和3 (b))。

3.4。弗吉尼亚州BMP-2过度增加肌凝蛋白表达

通过rt - pcr,我们确定adenoviral-mediated BMP-2超表达显著增加肌凝蛋白Va mRNA比控制(图7倍4(一)剂量依赖性的方式(图)4 (b))。然后我们确认BMP-2刺激肌凝蛋白Va蛋白表达增加了描述肌动蛋白和肌凝蛋白表达VSMCs Va免疫荧光分析。代表照片在图4 (c)显示大量分布式肌凝蛋白Va的细胞质蛋白结合肌动蛋白VSMCs overexpressing BMP-2,相比弱阳性信号控制细胞中检测到。在一起,这些结果强烈支持增强弗吉尼亚州肌凝蛋白表达在BMP-2超表达。

3.5。弗吉尼亚州siRNA-Mediated击倒的VSMC肌凝蛋白抑制迁移

我们生成三个肌凝蛋白Va-specific核结构。相对于控制或其他小干扰rna结构生成,siRNA-construct-3(此后称为siRNA-3)显著降低肌凝蛋白Va mRNA的表达(图5(一))和蛋白质(图5(b))。弗吉尼亚州siRNA-mediated击倒的肌球蛋白降低其表达位置已知检测通过免疫荧光试验在VSMCs模拟BMP-2(图5(c))。我们下一个决心肌凝蛋白的功能结果Va击倒BMP-2设置的刺激。VSMCs受到siRNA-3migrate肌凝蛋白Va-knockdown相比明显慢控制或VSMCs受到核结构1或2(数字5(d)和5(e))。这些结果表明肌凝蛋白Va可能在BMP-2-mediated加速度VSMC迁移有显著的作用。

3.6。BMP-2弗吉尼亚州Erk1/2调节肌凝蛋白表达

信号机制负责对VSMC BMP-2超迁移的影响尚不清楚。软件(IPA、独创性Sys)分析显示BMP-2之间的关系和互动,Erk1/2,弗吉尼亚州肌球蛋白和肌动蛋白(图6(a))。我们调查的程度Erk1/2刺激响应BMP-2剂量中引用先前的研究[23]。VSMCs要么是治疗外源性250 ng / mL BMP-2 48小时或adenovirally转染BMP-2过表达。VSMCs Erk1/2抑制剂U0126因此暴露。Erk1/2激活是由蛋白质印迹。Erk1/2抑制剂显著增加坏蛋白的生产(通常由BMP-2下调),显著降低Bcl-xl和肌凝蛋白Va表达式(通常由BMP-2)调节(图6(b))。存在证明upregulation弗吉尼亚州肌凝蛋白基因的mRNA在老鼠VSMCs细胞治疗250 ng / mL BMP-2 48小时,被5产生影响μM U0126(图6(c))。U0126减毒BMP-2增强VSMC能动性(图6(d))。这些结果表明Erk1/2活动是至关重要的调制BMP-2弗吉尼亚州肌凝蛋白的表达。

3.7。BMP-2增加细胞内振荡

钙(Ca^{2 +})在生理生化中起着举足轻重的作用,作为第二信使在信号转导途径,参与神经递质释放,所有的肌肉细胞收缩,受精(24,25]。我们调查的潜在参与Ca^{2 +}BMP-2之间的信号机制和Erk1/2记录细胞内在VSMCs振荡。加载Ca后⁺敏感染料Fluo-4点,我们监测的时间变化在一个殖民地的单个细胞。图6(e)演示了一个代表VSMC的殖民地,在单个细胞表现出自发的Ca^{2 +}振荡。没有外部Ca^{2 +}补充,长期BMP-2政府激活一个大型临时增加Ca^{2 +},其次是一阵Ca^{2 +}峰值。细胞内钙平均自发振荡振幅增加^{2 +}浓度()(图6(f))。单个细胞荧光()策划作为时间的函数展示了振荡的变化。这样的振动显著增加细胞内受到250 ng / mL BMP-2(图6(g))。这些数据表明BMP-2-induced Ca^{2 +}振荡生成主要由VSMCs“胞质振荡器”。弗吉尼亚州BMP-2-mediated调节肌凝蛋白可以通过Erk信号调制与Ca^{2 +}参与。

4所示。讨论

我们取得了一些重要的观察在当前的研究中。首先,我们展示了BMP-2超表达在VSMCs人口增加单细胞和多细胞的能动性。其次,我们演示了BMP-2弗吉尼亚州过度增加肌凝蛋白的表达而不是肌凝蛋白Vb和Vc。最后,我们提供机械的证据ERK1/2参与BMP-2弗吉尼亚州肌凝蛋白表达的调制,Ca^{2 +}参与。

肌凝蛋白Va直接组装肌动蛋白成反平行的包(26,27]前缘的局部膜褶边28]。名副其实的actin-based马达蛋白、肌凝蛋白Va、函数作为细胞内囊泡和细胞器运输和交付货物维护的关键细胞运动,从而支持细胞迁移。迄今为止,无论是弗吉尼亚州肌凝蛋白调节VSMC迁移是未知的。在这项研究中,我们展示了丰富的肌凝蛋白分布Va绑定的肌动蛋白在细胞质中BMP-2 overexpressing VSMCs,而控制细胞。我们也证明击倒的弗吉尼亚州肌凝蛋白抑制VSMC能动性,表明肌凝蛋白Va对VSMC的迁移。需要更详细的分析阐明肌凝蛋白Va具体如何影响细胞活性,但它是似是而非的弗吉尼亚州肌凝蛋白参与细胞细胞骨架重组,一个重要的事件驱动细胞运动(13,29日]。

我们清楚地演示BMP-2过度刺激细胞迁移。我们使用音标软件分析BMP-2之间的关系和相互作用,Erk1/2,肌凝蛋白Va和Ca^{2 +},但是先前的报道没有透露任何直接弗吉尼亚州BMP-2和肌凝蛋白之间的关系(30.- - - - - -32]。Erk1/2抑制不仅阻塞Bcl-xl蛋白质的生产,但也显著差别BMP-2-mediated对这些肌凝蛋白表达减少Va和糟糕。肌凝蛋白Va可能调解的功能Bcl-xl通过促进胰岛细胞迁移和入侵15]。我们演示了BMP-2弗吉尼亚州调节肌凝蛋白表达VSMCs通过Erk1/2但不能排除其他分摊因素的参与调节肌凝蛋白的表达Va,推动者和microrna基因调控等元素。进一步的工作需要充分描述肌凝蛋白Va启动子。

自发钙振荡发生在肌肉细胞来自兴奋性组织,神经,和胚胎干细胞的起源33- - - - - -35]。钙是一种重要的第二信使调节细胞内和细胞外的通信。钙瞬变的幅度和持续时间可以促进特定基因的表达。肌凝蛋白Va IP3受体的定位是必要的,这可能与细胞内Ca^{2 +}(24,25]。在目前的研究中,我们观察自然的存在振荡培养VSMCs,进一步激活BMP-2的存在。Erk信号通路可以被增加刺激振荡,增加Erk1/2磷酸化(36,37(图),支持我们的结果6)。额外的研究特别定义的确切角色Ca^{2 +}作为第二信使在这个系统正在进行。

VSMCs可以改变表型在活的有机体内根据功能要求,可以收缩,增殖、迁移和/或合成(38,39]。我们证明BMP-2过度增加合成表型标记OPN的表达和MGP和减少收缩表型SM22标志α。本研究提出了概念BMP-2可能调节SMC表型对合成状态。进一步的研究是必要的,以确定Ca^{2 +}振荡可能有表型的影响。

总之,我们的研究表明BMP-2增强VSMC迁移通过Erk1/2信号激活,弗吉尼亚州调节肌凝蛋白表达。抑制BMP-2-induced弗吉尼亚州肌凝蛋白表达可能代表未来衰减动脉粥样硬化的治疗策略。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

张明和最小杨了同样的研究。

承认

这项工作得到了北京中国小说星科技项目(没有。2009年b38张明)。

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