文摘

我们检查是否增强细胞抗氧化保护通过调节舒张功能不全的舒张期细胞内自由锌^{2 +}和Ca^{2 +}水平(和)水平N乙酰半胱氨酸(NAC)保存的糖尿病大鼠的治疗(4周)细胞氧化还原状态的改变也使diabetes-induced组织损伤和舒张功能不全与标志的标准化休息和。锌动力学参数的瞬态变化^{2 +}和Ca^{2 +}在电刺激和锌的时空特性^{2 +}和Ca^{2 +}火花在静息细胞发现正常的糖尿病治疗组。生化分析表明,NAC治疗与hyperphosphorylation心脏阿诺定受体(RyR2)和显著的恢复枯竭RyR2和calstabin2蛋白质水平。培养的心肌细胞10µM ZnCl₂施加hyperphosphorylation RyR2以及高phosphorphorylations PKA和CaMKII浓度的方式,类似于高血糖。我们目前的数据还显示,亚细胞氧化应激标记,NF -κB,可以激活细胞直接接触锌^{2 +}。我们因此首次报告,增强抗氧化防御的糖尿病患者通过直接瞄准心脏似乎防止舒张功能不全导致调制RyR2 macromolecular-complex从而导致规范化和在心肌细胞。

1。介绍

糖尿病心肌病是第一个被卢布et al。1)在人类糖尿病与冠状动脉粥样硬化的充血性心力衰竭,没有任何证据。广泛接受,慢性高血糖是心肌梗死的重要危险因素,重要的是,这两个急性和慢性高血糖引发一些生化和电生理变化导致心脏收缩功能受损(2]。低血糖首先启动重复急性细胞代谢的变化,然后随后累积大分子的长期变化。长期变化主要包括一个大数量的增加生产活性氧,活性氧,从而诱发糖尿病组织/细胞损伤在几个靶器官包括心脏(3- - - - - -5]。虽然氧化剂产生健康组织,增加氧化应激中发挥着重要作用的发展许多疾病,如心血管系统疾病(6]。

积累的证据表明,氧化应激密切一直与糖尿病及其并发症,包括糖尿病心肌病。增加氧化应激的结果也从减少抗氧化剂/抗氧化防御系统,从而导致的心脏功能障碍的发生和发展7]。高血糖诱导氧化应激也会导致蛋白质错误折叠或损坏的形成以及细胞氧化还原状态的变化,由还原剂或氧化剂分子紧密调制以及酶(8,9]。因此,细胞防御系统的缺陷导致的发展随着时间的推移,氧化受损细胞大分子,因此,在某种程度上,dyshomeostasis在细胞内自由钙^{2 +}(10]。此外,它也表明,细胞内自由锌^{2 +}水平可以迅速增加心肌细胞由于锌的动员^{2 +}主要由活性氧(从细胞内的商店11,12]。

锌是必不可少的微量元素,是至关重要的维持正常生理和细胞功能在许多细胞类型。金属蛋白和金属酶细胞,它是一定会扮演一个关键的角色作为一个激活许多酶的辅助因子。在细胞水平上,它已经证明了细胞内锌^{2 +}体内平衡参与信号转导,锌^{2 +}作为细胞内的中介,类似于Ca^{2 +}(13,14]。总锌^{2 +}在真核细胞(200μ米)不太不同的Ca^{2 +}有30%的本地化的细胞核,细胞质和细胞器的50%,其余相关蛋白(15]。在心肌细胞中,细胞内自由锌^{2 +}浓度()测量不到一摩尔在生理条件下(11,16),类似于一个报道HT-29细胞(17),也就是说,一些100倍低于细胞内自由钙^{2 +}。此外,氧化剂造成大约30倍增加细胞内自由锌^{2 +}但只在细胞内自由钙2倍^{2 +}在新鲜分离心肌细胞(11]。

redox-inactive金属锌,一直被认为是抗氧化剂的一个组成部分,网络,以及越来越多的证据表明其参与redox-regulated信号通过直接或间接规定(18,19]。尽管有许多发现在细胞/组织功能障碍及其与细胞氧化应激水平,氧化还原信号,细胞内自由锌^{2 +}层面,很少有人了解的贡献以及细胞内控制自由锌^{2 +}在心肌细胞在生理和病理生理条件下。Ca^{2 +}从细胞内释放存储主要从肌浆网(SR)通过阿诺定受体(RyR2)中扮演一个重要的角色在心脏功能的调节。演示了航道治理的变化导致舒张Ca^{2 +}从老泄漏,这是许多心脏障碍包括糖尿病心肌病(20.]。自氧化还原RyR2的修改直接和/或间接作用氧化剂有助于SR Ca^{2 +}在心肌细胞泄漏许多病变心脏模型(21- - - - - -24),RyR2s调制与含巯基的氧化在心肌细胞biphasically [25)、高葡萄糖变弱蛋白S-nitrosylation通过过氧化物生产(26),一氧化氮(NO)介导胞浆内和在细胞核内的锌^{2 +}释放(27),我们旨在测试假设细胞内自由锌^{2 +}变化,通过增加氧化应激和/或有缺陷的抗氧化防御系统,发挥重要作用的发展糖尿病引起的RyR2功能的改变。公布的数据下,我们假设RyR2的磷酸化状态变化并不是唯一的生化改造型糖尿病心脏(20.]。不久,糖尿病是伴随着增加氧化应激和抗氧化防御系统缺陷(28,29日)通过增加活性氧/ RNS的生产,这可能会改变RyR2函数以及释放锌^{2 +}从细胞内的商店11,12]。因此,本研究的目的是为了测试是否细胞内锌^{2 +}释放除了Ca^{2 +}发布由于氧化应激增加/缺陷在心肌细胞抗氧化防御系统高血糖介导部分RyR2泄漏,因此在心脏舒张功能不全链脲霉素(STZ)糖尿病老鼠通过使用N乙酰半胱氨酸(NAC)在活的有机体内和在体外方法。

2。材料和方法

2.1。实验大鼠和糖尿病模型

用雄性Wistar鼠(200 - 250克)。糖尿病是导致糖尿病组(如前所述20.]。一周注射STZ后,血糖水平测量和老鼠至少三倍的血糖水平高于注射前水平被用于实验动物糖尿病(DM组)。糖尿病糖尿病动物,4周后确认,收到N乙酰半胱氨酸(NAC);150毫克/公斤,每天和intragastrically DM +南汽集团)或车辆(生理盐水)4周以相同的方式,而非糖尿病的老鼠(CON组)仅接受生理盐水。所有的老鼠可以免费获得标准的食物和水。所有动物都按照处理指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。协议是由安卡拉大学实验动物伦理委员会批准,审批的参考号码是2011-115-449。

2.2。对等离子体氧化应激/抗氧化状态的评估和心脏匀浆

来自多不饱和脂肪酸,脂质过氧化物是不稳定和分解形成一系列复杂的化合物,其中包括活性羰基化合物,如MDA。血浆脂质过氧化作用是由测量丙二醛(MDA)水平与硫代巴比土酸活性物质(TBARS)试验设备(开曼化学公司)。MDA-TBA加合物形成高温、酸性条件下测量colorimetrically在530 - 540海里。

血浆谷胱甘肽地位是由测量减少谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)水平,开展与谷胱甘肽测定工具包(开曼化学公司)含2 - (N-morpholino) ethanesulfonic酸缓冲,GSSG标准,酶混合物,和5 5′-dithiobis (2-nitrobenzoate)。谷胱甘肽水平和GSSG计算使用减少谷胱甘肽标准和结果表示为μmol / L。谷胱甘肽的检测限制和GSSG 0.1μmol / L和0.001μ分别mol / L, intraassay变异系数对谷胱甘肽和GSSG分别为0.96%和6.45%,分别。

准备心脏匀浆,冰冻的心粉在液体N₂温度,然后均质(30.]。蛋白质含量均浆进行了分析通过使用布拉德福德(Bio-Rad)方法。牛血清白蛋白被用作蛋白质标准。蛋白质氧化水平心脏匀浆测定如前所述[31日]。

总巯基(SH)和酸溶性巯基(总硫醇和自由硫醇)组蛋白与Ellman估计试剂如前所述[31日]。不久,心脏匀浆被解冻,细胞溶解在0.2三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液pH值8.1,含2%钠dodecylsulfate。测定总SH组,0.05毫升的整除的细胞溶解产物混合0.8毫升蒸馏水和0.1毫升的2毫米,5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)。上层清液的吸光度在412 nm(日本岛津公司uv - 120 - 02分光光度计)。校正后与样品和试剂空白吸光度,计算每个样本的SH组水平使用1.31毫米的消光系数⁻¹·毫米⁻¹。确定水平的酸溶性SH组,0.7毫升整除的心脏匀浆溶解产物混合0.35毫升的20%三氯乙酸(TCA)和最后的沉淀与0.2毫升的20%柠檬酸清洗以类似的方式和浮在表面的结合,与氢氧化钠pH值8。上层清液的总SH水平测量如上所述免费SH测量。

2.3。电子显微镜

组织学检查进行了描述。电子显微镜评估,样品固定在2.5%的戊二醛磷酸缓冲在4°C和2 - 4 h后缀四氧化锇在1%。样品通过分级脱水后酒精浓度(50%,75%,96%,100%),心脏组织嵌入环氧树脂6005。嵌入式样本切片厚度4 - 6μm leitz则使用- 1512切片机。部分是沾染了铀酰柠檬酸acetate-lead审查通过使用一个狮子座906 E透射电子显微镜。

2.4。孤立Langendorff-Perfused心

心被孤立和灌注如前所述[30.]。短暂的,孤立的心被电刺激(DCS,哈佛大学仪器)300次/分钟的方波1.5毫秒时间阈值电压的两倍。心脏灌注共有50 - 60分钟和功能参数测定40分钟。左室舒张末压(LVEDP)孤立的心被测量的变化。

2.5。隔离心室心肌细胞

细胞隔离执行所述其他地方(31日]。简单地说,老鼠用戊巴比妥钠麻醉(30毫克/公斤,腹腔内)和心室从快速切除的心,碎成小块,轻轻的通过尼龙网。胶原酶消化后,分离心肌细胞与collagenase-free清洗解决方案。随后Ca^{2 +}在中逐渐增加到最后一个1.3毫米的浓度。细胞被保存在该解决方案只在37°C和Ca^{2 +}宽容的细胞用于实验。

2.6。胞质测量锌^{2 +}和Ca^{2 +}在休息和电刺激细胞

荧光变化记录使用显微分光光度计和FELIX软件(美国PTI、码、新泽西)如前所述[12]。心肌细胞都含有cell-permeable acetoxymethoxy FluoZin-3的导数或Fluo-3 (FluoZin-3-AM或Fluo-3点;35 - 40分钟孵化)和兴奋在0.2赫兹场刺激使用两个铂电极定位记录室的两侧。的基础水平和从Fura-2加载测量(4μM Fura-2点)在室温下心肌细胞如前所述11]。电刺激下的瞬态荧光变化,估计从峰值之间的区别和基底的水平,被检测到。所有实验在室温下进行。细胞被过冷与HEPES-buffered解决方案不断用于共焦成像。细胞兴奋FluoZin-3 488 nm和480 nm Fluo-3,和排放记录在520和515海里,分别。细胞表现出显著的荧光降低5分钟平衡期间被淘汰。锌的振幅^{2 +}或Ca^{2 +}在实验时间瞬态稳定在10%。

2.7。共焦测量锌^{2 +}- - - Ca^{2 +}火花

短暂的,微小的,局部光排放(名为火花)记录不同心肌细胞的35 - 40分钟后孵化FluoZin-3-AM或Fluo-3点,分别,如前所述12]。加载细胞转移到徕卡的实验室内安装在该阶段TCS SP5激光扫描显微镜。实验在静止的心肌细胞。FluoZin-3或Fluo-3很兴奋在485或506海里,收集和排放在535或526海里,分别。在一些实验中,记录了与HEPES-buffered解决方案补充与锌离子载体羟基吡啶硫酮(ZnPT;1到10μ米),随后添加50 mM N, N, N′, N′-tetrakis (2-pyridylmethyl)乙二胺(TPEN)将胞内自由锌^{2 +}水平为零。实验在室温下进行。

火花最初发现与ImageJ (SparkMaster、插件)是一个开放的访问计划(http://rsb.info.nih.gov/ij),然后手动选择。荧光变化的参数,如峰值振幅(,在那里;被确认为当地最大高程基准面的荧光强度,),峰值时间(TP),频率,持续时间在半峰,或上升时间(FDHM)自动计算使用ImageJ计划。

2.8。免疫印迹分析

为制备组织匀浆,冰封的心左心室压在液体样本N₂然后均质温度测量的磷酸化和蛋白质水平收缩机械复杂如前所述[20.](phospho-CaMKII-Thr286, CaMKII PKA、phospho-PKA-Thr198 FKBP12.6, RyR2, phospho-RyR2-Ser^2808年,phospho-NFκB, NFκB,β肌动蛋白被确定使用特定抗体与推荐稀释的圣克鲁斯生物技术(美国)或Badrilla有限公司(英国)公司)。密度分析的蛋白质乐队使用ImageJ执行计划。

类似的免疫印迹分析也在糖尿病大鼠心肌细胞从左心室进行孵化N乙酰半胱氨酸(NAC);1毫米)1 h在37°C。

2.9。化学物质和数据分析

除非另有说明,所有的化学物质都购自σ(Sigma-Aldrich应用化学,Steinheim,德国)。

组织进行了测试和比较使用单向方差分析和图基事后测试。的值作为具有统计学意义。重要性水平给出了文本和数据表现为±SEM手段。

3所示。结果

3.1。实验动物的一般特征

单一管理链脲霉素,STZ大鼠诱导糖尿病症状比aged-matched控制包括体重损失(克和g;数量的老鼠32和24)和血糖水平显著增加(mg / dL和mg / dL)。老鼠从一种抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(NAC)治疗糖尿病组(DM +南汽集团)增加体重的控制(克和g;老鼠)尽管他们有很高的血糖水平的实验时间(mg / dL和mg / dL)(图1)。为了证明是否有糖尿病老鼠的心脏肥大,以避免可能的麻木不仁的心体重比测量,我们测量细胞相比,分离心肌细胞和电容之间的值组。在7 - 8周,STZ-induced糖尿病大鼠心脏肥大没有测量(数据未显示)。

3.2。超微结构、氧化应激和氧化还原状态在糖尿病大鼠的心脏

高血糖诱导氧化应激的程度,脂质过氧化水平评估心脏匀浆MDA分析,显著减少N乙酰半胱氨酸(NAC)治疗糖尿病组(μ摩尔/毫克蛋白)相比,未经治疗的糖尿病组(μ摩尔/毫克蛋白),也显著高于对照组(μ摩尔/毫克蛋白),建议增加氧化应激和抗氧化作用的南汽在高血糖的心里压力。心中的程度改变氧化还原状态是通过测量发现谷胱甘肽比GSSG(谷胱甘肽(GSSG)。这一比率被发现显著降低糖尿病组()相比,控制()和NAC-treated糖尿病患者(),表明心脏细胞氧化还原状态的改变在高血糖的压力。此外,我们发现,氧化程度的protein-SH(硫醇)明显高于糖尿病大鼠心脏匀浆(自由硫醇水平:μ摩尔/ mg湿wt)相比的控制(自由硫醇水平:μ摩尔/ mg湿wt)(图1)。免费protein-thiol水平的匀浆NAC-treated糖尿病组(μ摩尔/ mg湿wt)被发现未经治疗的糖尿病组相比显著降低。此外,protein-thiol总水平没有影响糖尿病或NAC治疗(数据未显示)。因此,我们证明了有显著增加氧化应激在糖尿病患者除了高循环脂质过氧化水平[32从STZ-induced糖尿病老鼠,它可以控制到正常水平NAC治疗,这也证实了先前公布的数据(33- - - - - -35]。

虽然糖尿病大鼠没有显示异常的行为或任何心力衰竭的迹象以及任何组织坏死的迹象,正如先前所显示的(36),糖尿病大鼠心脏的超微结构显示各种形态变化包括心肌细胞直径的损失,改变作用和肌纤维的z轴,肌纤维变性,肌原纤维的破坏和损失肌节长度相比,控制心(数字2(一个)和2 (b))。糖尿病组的大部分线粒体嵴和细粒度矩阵的心肌细胞显示损失和增加数量的脂质滴(图2 (b))。NAC治疗规范化完全这些改变作用(图2 (c))。

量化的电子显微镜发现在糖尿病和非糖尿病的老鼠的心脏,我们调查的脂滴,观察到基本的数量和大小的脂质滴糖尿病组明显高于对照组(~ 40% ~ 15%糖尿病患者和对照组)虽然这些变化完全消失在NAC-treated组。心脏组织的脂质量化是由使用油红O染色显示严重的脂质积累的心。脂质内容被表示为脂质区域标准化组织调查总面积。

3.3。糖尿病大鼠心脏功能的心

以前,我们表明,注射STZ大鼠短期(4 - 5周)或长周期实验持续时间(8 - 12周)诱导标志着几个改变心脏的机电参数(12,29日,37,38]。左心室收缩和舒张功能障碍在这些变化。在目前的研究中,由于我们旨在调查可能的胞内自由锌的贡献^{2 +}除此之外的Ca^{2 +}释放由于增加氧化应激在高血糖,我们首先检查糖尿病大鼠心脏的舒张功能和比较它的控制N乙酰半胱氨酸(NAC)治疗大鼠。老鼠注射STZ后5 - 6周增加舒张功能不全(图发展3(一个)),约增加80%左ventircular结束舒张压(LVEDP)。NAC治疗糖尿病大鼠4周诱导LVEDP完全正常化。

3.4。基底细胞内游离锌的水平^{2 +}和Ca^{2 +}在Cardimyocytes糖尿病大鼠

识别和比较基底细胞内自由锌^{2 +}水平在糖尿病大鼠心肌细胞的控制,我们使用比率荧光染料Fura-2。为了比较个人数据,我们归一化初始荧光值获得公比心肌细胞,然后我们TPEN反应用于最小和最大荧光变化()。原来的荧光变化为基础给出了图3 (b)。给出的数据是为了比较糖尿病和比例变化N乙酰半胱氨酸(NAC)治疗糖尿病组与对照组。我们可以看到在图3 (b),添加membrane-permeant锌^{2 +}螯合剂TPEN (50μ米)引起荧光比率迅速下降()水平低于初始值,验证最初观察到荧光比例是由于细胞内基底免费的锌^{2 +}的水平。这种减少更大的糖尿病组比对照组在几乎同一水平NAC-treated糖尿病组和对照组。在同一个酒吧图表,可以看出荧光变化对基底细胞内自由钙的水平^{2 +}相比是明显高于糖尿病心肌细胞的控制和NAC-treated糖尿病组。目前的数据表明,增加细胞内基底免费的锌^{2 +}和Ca^{2 +}水平依赖于氧化应激增加,降低高血糖的大鼠抗氧化系统。

直接测试是否增加氧化应激可以诱导同时增加基底细胞内游离锌的水平^{2 +}和Ca^{2 +}糖尿病大鼠心肌细胞,我们从糖尿病大鼠心肌细胞孵化NAC(1毫米,1 h 37°C)在装货前与Fura-2细胞。从图可以看出3 (c),NAC孵化糖尿病心肌细胞(+南汽集团)诱导荧光比率相似的变化与基底细胞内游离锌的水平^{2 +}和Ca^{2 +}。这些团体的实验也证实,糖尿病可以引起显著增加不仅在基底Ca^{2 +}而且在基底锌水平^{2 +}水平,最多,由于增加了活性氧,活性氧。

3.5。当地的胞内释放的锌^{2 +}和Ca^{2 +}在糖尿病大鼠心肌细胞

最近,我们已经表明,有当地小锌^{2 +}版本(命名为锌^{2 +}火花),静止休息从三月大的雄性老鼠心肌细胞分离和富含锌^{2 +}特殊的荧光染料,FluZin-3,可以可视化以类似方式众所周知的Ca^{2 +}火花(12]。小学锌的贡献^{2 +}发布类似于Ca^{2 +}释放,锌^{2 +}或Ca^{2 +}火花,增加基础水平的锌^{2 +}和Ca^{2 +}(前一节中提到的)和改变锌^{2 +}/ Ca^{2 +}部分内容SR (SR Ca的函数^{2 +}发布渠道,RyR2)检查和监控参数的差异这些糖尿病患者和对照组之间的火花。代表扫描图像的两种类型的火花控制(CON组)、糖尿病(DM组)N乙酰半胱氨酸(NAC)治疗糖尿病(DM +南汽集团)老鼠(个人锌^{2 +}或Ca^{2 +}火花图像作为与t)是显示在图4(一)。最大荧光强度,确定锌的高峰^{2 +}或Ca^{2 +}火花(图4 (b);左和右,分别地。)和自发的锌^{2 +}/ Ca^{2 +}火花频率(图4 (c);左和右,resp)计算从个人伽马分布函数符合。最大FluoZin-3强度以及Fluo-3强度没有明显不同的DM和反对团体。另一方面,我们观察到显著增加两个荧光在糖尿病的发生频率。此外,时间(TP)的最大峰值FluoZin-3强度被发现相似的DM和反面人群;TP值最大Fluo-3在DM组相比,明显延长诈骗集团(图4 (d);左和右,职责)。此外,完整的持续时间在半峰(FDHM) FluoZin-3和Fluo-3也发现显著延长DM组对年龄CON组(图4 (e);左和右,职责)。N乙酰半胱氨酸(NAC)治疗糖尿病的老鼠(DM +南汽集团)为4周显著预防diabetes-induced锌的所有更改^{2 +}和Ca^{2 +}火花参数。

值得注意的是,如图4 (b)- - - - - -4 (e),本质上类似的结果在锌的参数^{2 +}和Ca^{2 +}火花在糖尿病大鼠心肌细胞分离得到1 h与1毫米孵化南汽在37°C(+南汽集团)。

3.6。监管的锌^{2 +}和Ca^{2 +}瞬变和抗氧化剂,N乙酰半胱氨酸

进一步了解糖尿病和NAC治疗糖尿病的影响在细胞内的分布自由锌^{2 +}和Ca^{2 +}孤立的心肌细胞的变化,我们执行一些额外的实验监测细胞内瞬态变化的细胞内自由锌^{2 +}或Ca^{2 +}引起电场刺激的。图5(一个)(左)显示了锌的原始记录^{2 +}和Ca^{2 +}瞬变引起的控制,糖尿病,N乙酰半胱氨酸(NAC)对糖尿病大鼠心肌细胞(4周)以及NAC-incubated糖尿病心肌细胞1 h和1毫米南汽在37°C。的平均荧光峰值振幅FluoZin-3和Fluo-3在糖尿病细胞明显小于在控制细胞(图5(一个)吧),而他们的振幅NAC-treated糖尿病大鼠心肌细胞或NAC-incubated糖尿病心肌细胞被发现是类似的控件。时间峰值振幅(TP)和恢复(DT的半场₅₀)的瞬态变化FluoZin-3被发现是类似的糖尿病患者和对照组之间以及NAC-treated或NAC-incubated糖尿病患者(图5 (b))。此外,相似参数的瞬态变化Fluo-3显著延长糖尿病组相比的控制。这些变化也大大阻止了NAC治疗糖尿病大鼠或NAC孵化糖尿病心肌细胞的1 h在37°C(图1毫米5 (c))。

3.7。生化分析心脏阿诺定受体,RyR2 Calstabin2

之前它已经表明RyR2的功能障碍在糖尿病的机制包括,在某种程度上,一个hyperphosphorylation RyR2由于磷酸化水平高的蛋白激酶a (PKA)和Ca^{2 +}钙调蛋白激酶ⅱ(CaMKII)高血糖(12]。RyR2的磷酸化水平在糖尿病和控制大鼠左心室心脏组织评估了使用特定抗体针对RyR2和磷酸化RyR2(图6(一)(左)。总RyR2糖尿病组比对照组低64%左右,估计从免疫印迹。从band-intensity分析,有一个强有力的证据在糖尿病大鼠心脏匀浆RyR2磷酸化虽然没有检测到乐队的心脏匀浆对照组。calstabin2的数量(FKBP12.6)下降了40%相比,糖尿病大鼠心脏的控制(图6(一),对吧)。蛋白质含量没有显著差异的肌动蛋白在糖尿病患者和对照组(图6(一),对吧)。此外,这些参数被发现明显阻止了NAC治疗糖尿病大鼠4周。

评估的抗氧化剂NAC的直接行动,我们第一次孵化新孤立从糖尿病大鼠心肌细胞1毫米NAC 1 h在37°C,然后执行类似的免疫印迹分析pRyR2, RyR2 FKBP12.6。孵化的糖尿病心肌细胞1毫米NAC RyR2 hyperphosphorylation水平显著下降,而没有效果(图的抑郁的蛋白质水平6 (b)(左)。同样,NAC孵化并不影响减少FKBP12.6蛋白水平在糖尿病心肌细胞(图6 (b),对吧)。

3.8。外部锌的直接影响^{2 +}在RyR2 Macromolecular-Complex心室的心肌组织

胞内自由锌^{2 +}分布与氧化还原代谢尽管锌^{2 +}本身不是redox-active和一般锌^{2 +}——被redox-inert [39,40]。因此,由于我们之前显示一个中介的快速、大,选择性的细胞内自由锌^{2 +}通过细胞内蛋白质硫醇的氧化还原状态的调制,在这里,我们旨在考察外部ZnCl的影响₂孵化(10μ米)心脏匀浆的控制和糖尿病组大鼠20 - 30分钟在37°C RyR2-macromolecular复杂的成员。从数据可以看出7(一)和7 (b)RyR2,总蛋白质含量及其附属蛋白,FKBP12.6, PKA, CaMKII,并不影响与1μ(数据没有显示)或10μM ZnCl₂孵化两组大鼠左心室心脏匀浆。然而,我们测量的磷酸化水平的RyR2明显增加,这两个ZnCl PKA, CaMKII₂孵化项目浓度的方式。最后一个数据进一步支持锌的假设^{2 +}不平衡导致信号不平衡引起的局部过剩的锌^{2 +}干扰细胞信号网络。

3.9。细胞内锌之间的关系^{2 +}和核因子(NF -κBκB)激活

有多个研究对NF -是否有不同的结论κB是保护或有害心脏功能在心脏病理(尽管其重要作用41,42已经证明。这个分歧并不奇怪考虑NF -的复杂性κB信号在几个步骤,包括多个组件和监管。此外,NF -κB是一个多效性的转录因子,其接收来自多个信号通路包括不同心脏重塑的重要调节器。驴可能直接细胞内锌的作用^{2 +}NF -κ外部ZnCl B,我们测试的影响₂孵化(10μ米)心脏匀浆的控制和糖尿病组大鼠20 - 30分钟在37°C,类似于前一节。从数据可以看出7(一)和7 (b)、总蛋白质含量的NF -κ10 B是没有影响的μM ZnCl₂孵化的左心室心脏匀浆控制和糖尿病组大鼠。然而,NF -的激活水平κB两组大鼠心脏匀浆明显增加ZnCl后(两组~三倍)₂孵化项目。这最后的数据进一步支持的假设虽然心脏重塑与氧化应激增加有关,炎症,内分泌系统高血糖和激活,细胞内ZnCl增加₂介导NF -κB激活似乎是一个明显的事实在其他人在高锌^{2 +}暴露的心。

4所示。讨论

本研究在N乙酰半胱氨酸(NAC)效应STZ-induced糖尿病大鼠报告中一个重要的角色增强细胞抗氧化的保护不仅通过调节舒张功能不全舒张期锌^{2 +}但也舒张Ca^{2 +}由于预防RyR2-leak糖尿病大鼠的心脏。首先,我们证实了有缺陷的细胞内锌^{2 +}信号,除了先前显示Ca^{2 +}信号(20.),在某种程度上,由于氧化应激增加/沮丧的糖尿病心肌细胞,抗氧化防御较低振幅的锌^{2 +}瞬态以及显著增加舒张压水平的锌^{2 +}和Ca^{2 +}因为所有这些改变可以预防NAC治疗糖尿病大鼠或NAC-treatment糖尿病心肌细胞。我们的电子显微镜数据进一步证实了这些发现。此外,我们明确糖尿病心肌细胞,这些缺陷可能归因于异常RyR2行为,揭示的时空属性的锌^{2 +}和Ca^{2 +}火花,特别是表现出慢动力学和更高的频率。减少数量的RyR2 FKBP12.6水平以及明显hyperphosphorylation RyR2可以负责这些观察,在某种程度上,由于氧化剂/抗氧化的比例不平衡。此外,本研究的初步结果表明,补充与南汽改善糖尿病大鼠的一般状况,影响身体体重增加和高血糖,保护心脏舒张功能,帮助维护基线心肌力学。

4.1。抗氧化剂N乙酰半胱氨酸防止RyR2泄漏,扮演着一个很重要的角色,通过增加水平的锌舒张功能不全^{2 +}和Ca^{2 +}在糖尿病的心

目前的研究表明,系统性的糖尿病大鼠抗氧化治疗保留两个锌的变化^{2 +}和Ca^{2 +}调控在糖尿病心肌细胞没有任何影响血糖水平高和恢复正常的大分子的复杂成分和功能RyR2渠道糖尿病老鼠的心脏。有相关的恢复心肌舒张功能和扭转糖尿病大鼠左心室的结构改造N乙酰半胱氨酸(NAC治疗4周。此外,我们明确糖尿病心肌细胞,这些缺陷可能归因于异常RyR2行为,揭示的时空属性的锌^{2 +}和Ca^{2 +}火花,特别是表现出慢动力学和更高的频率。这些变化可以用漏水的RyR2的行为完全一致在强氧化/ nitrosative压力。的确,众所周知,急性和慢性高血糖引发一些生化和电生理变化导致心脏收缩功能受损(2),最多,由于hypoglycemia-induced大数量的活性氧,活性氧,其次是组织/细胞损伤等靶器官心(3- - - - - -5,43]。此外,它已经表明,RyR2s调制与含巯基的氧化在心肌细胞biphasically [25]虽然高葡萄糖变弱蛋白质S-nitrosylation通过过氧化物生产(26),一氧化氮(NO)介导胞浆内和在细胞核内的锌^{2 +}释放(27]。此外,氧化还原修饰的一个重要贡献的RyR2直接和/或间接的氧化剂为SR Ca^{2 +}泄漏在心肌细胞也被证明在不同病变心脏模型诱导动物(21- - - - - -24]。另一个支持的事实我们当前的假设来自当前数据快速增加休息免费的锌^{2 +}由于锌在心肌细胞^{2 +}从细胞内释放商店通过活性,ROS / RNS [11]。此外,提出了ROS / RNS为直接和/或间接损害心肌细胞在糖尿病28,44),提供了一个亲密关系之间增加细胞内基底自由锌的和有害的影响^{2 +}在心脏。一群支持数据之前我们组所示,我们表明,抑制SR-Ca^{2 +}释放或增加Ca^{2 +}负载在低钠⁺抑制或增加锌的解决方案^{2 +}分别运动。此外,我们还表明,线粒体抑制剂显著降低锌^{2 +}瞬态以及锌^{2 +}火花。此外,氧化的H₂O₂酸性pH值抑制Ca或改变^{2 +}端依赖锌^{2 +}释放。考虑前面的数据,我们提出,锌^{2 +}释放的结果,在某种程度上,从锌^{2 +}位移由Ca^{2 +}离子与金属离子结合位点的可用性取决于pH值和心肌细胞的氧化还原状态,或者说,Ca^{2 +}触发生产活性氧诱导金属硫蛋白和其他金属绑定属性的变化redox-active蛋白质以及更多的锌^{2 +}老释放由于有缺陷的RyR2 [11,12,15,28,45]。另外支持这一假设,我们也证明了锌的增加^{2 +}改变一些酶的活动,导致RyR2磷酸化见病理条件。此外,本研究另一个支持数据已经由Kamalov et al。46]。他们的数据表明,基底细胞内自由锌^{2 +}水平增加了70%从雄性糖尿病大鼠心肌细胞被平行于一个不平衡的oxidant-status /抗氧化能力在同一个心准备,并在醛甾酮增多症逾200%。协调变化的基底细胞内自由钙的水平^{2 +}和锌^{2 +}最近也报道了我们组在实验条件下(细胞内锌吗^{2 +}细胞内钙超载或^{2 +}减少),以及在一个节拍(瞬变或基本事件)细胞(12]。

综上所述,这些数据表明,NAC治疗的好处之一在活的有机体内或在体外条件,可以改善心肌功能,锌的适应不良的缺陷^{2 +}信号除了已知Ca^{2 +}心肌细胞动作电位信号,平行或个人,糖尿病的老鼠。

4.2。增加细胞内游离锌^{2 +}磷酸化细胞内钙^{2 +}信号激酶和转录因子NF -κB

值得注意的是,在这里,我们表明,体内应用锌^{2 +}标志着RyR2磷酸化而造成蛋白质含量没有影响RyR2和从犯RyR2的蛋白质大分子复杂,FKBP12.6,以及更高的phosphorphorylations PKA和CaMKII浓度的方式,类似于高血糖。这些数据进一步支持,在某种程度上,与锌^{2 +}绑定蛋白隐钙素驻留在SR,可以绑定到200摩尔锌^{2 +}每摩尔,独立于绑定50摩尔Ca^{2 +}每摩尔隐钙素。它被称为一个协会的锌^{2 +}超过300的酶,它可以与电负性硫交互,氮,和氧气在多个协调半个形式,催化和结构角色在维持活性肽构象(47]。除了近年,锌^{2 +}最出名的是它的能力和稳定蛋白结合域,称为锌参与基因调控^{2 +}手指、锌^{2 +}集群,锌^{2 +}转折(48]。因此,它也承认,胞内自由锌^{2 +}扮演着关键的角色在氧化还原信号通路和维持正常的生理结构和各种细胞类型,它可以是有毒的心肌细胞(11,49,50]。尽管锌^{2 +}哺乳动物来说是一个至关重要的元素在一定范围内,一些诱因如ROS增加/ RNS、缺血、梗死导致释放锌吗^{2 +}从蛋白质和导致心肌损伤11,51- - - - - -54]。

因此,可以推测,锌^{2 +}可能竞争或替代金属离子的关键信号蛋白的活性。除了这一假说,它已经表明,锌^{2 +}有多个功能对Ca的影响^{2 +}/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CaMKII)和调节RyR1绑定在骨骼肌肌浆网囊泡biphasically [55,56]。因此,可以清楚地看到,胞内自由锌^{2 +}信号可以很容易干扰的Ca^{2 +}在心肌细胞信号,特别是在病理条件下,底层,在某种程度上,心脏功能障碍。此外,支持最后这句话,锌^{2 +}众所周知,诱发CaMKII自身磷酸化,抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶(55- - - - - -57)和电压门控钙^{2 +}渠道在哺乳动物细胞(58),和高度的细胞毒性59),而二价金属离子影响催化活性位点的可访问性cAMP-dependent蛋白激酶(60]。在这里,虽然可能作用等细胞内锌^{2 +}信号蛋白磷酸化的调制,这是一个强大的激活/磷酸化CaMKII的可能性和PKA由于增加细胞内自由锌^{2 +}变成一个过度磷酸化RyR2在细胞外高锌^{2 +}曝光。因此,增加细胞内自由锌^{2 +},最有可能的贡献增加细胞内自由钙^{2 +}下,增加氧化应激在一起通过高血糖与沮丧的细胞抗氧化诱导心肌细胞的兴奋收缩偶联的重要缺陷。这是进一步支持我们之前观察相关协调基底细胞水平的变化包括免费的Ca^{2 +}和锌^{2 +}在实验条件下,以及在一个击败分离心肌细胞(12]。

因此,锌的主要生理作用^{2 +}可能是细胞信号级联的调制,特别是那些涉及蛋白质磷酸化,也考虑到细胞内锌吗^{2 +}可以迅速上升,影响钙^{2 +}规定(49,58),锌的相对丰度很低^{2 +}在心肌细胞表明其可用性作为基因表达的第二信使[49,61年]。在早期的研究中,阿塔尔et al。49)表明,外部锌^{2 +}可以激活基因表达在GH3细胞由于锌修改表达式^{2 +}调节蛋白质的胞内自由锌的变化^{2 +}蜂窝系统(62年]。此外,与后来发现锌的直接监管^{2 +}手指的锌^{2 +}由锌指转录因子^{2 +}可用性(61年,63年),可以接受,胞内自由锌^{2 +}可能作为第二信使转录因子激活,因此,基因表达,以应对压力。因此,我们目前的数据显示,胞内自由锌^{2 +}可以直接和明显使磷酸化转录因子NF -κB在心肌细胞中,注意范围多在高血糖细胞。在心肌细胞特别感兴趣的,我们的数据表明,锌^{2 +}或锌^{2 +}携带金属离子可能从内部商店在增加氧化/ nitrosative释放压力,从而影响转录/翻译途径[64年]。

考虑所有现在和以前公布的数据,在这里,我们报告一个增强的抗氧化防御在糖尿病患者中,直接瞄准心脏,似乎防止舒张功能不全,与正常化RyR2 macromolecular-complex,从而预防锌^{2 +}和Ca^{2 +}泄漏导致基底细胞内自由钙水平正常化^{2 +}和锌^{2 +}在心脏。这是很好地符合早期报告上执行一个啮齿动物心脏与遗传性肌肉萎缩症,伴随细胞内的Ca^{2 +}重载和氧化应激增加细胞内自由锌^{2 +}(52]。此外,Kamalov et al。46)表明,细胞内游离锌的最佳射程^{2 +}/ Ca^{2 +}比必须保存在心肌细胞和线粒体对抗氧化应激。因此,提高胞质和线粒体释放锌^{2 +}感应耦合的氧化应激水平,而胞质和线粒体的抗氧化效果结果免费的锌^{2 +}水平伴随着金属反应元素的同时激活转录因子- 1及其感应metallothionein-1等抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶。然而,长期治疗,通过维持细胞redox-status和细胞内锌^{2 +}接近控制水平,抗氧化剂NAC防止后续改变细胞内Ca^{2 +}体内平衡包括锌^{2 +}/ Ca^{2 +}RyR2释放,从而导致心脏活动的主要缺陷。

利益冲突

没有潜在的利益冲突与本文相关的报道。Erkan Tuncay和欧洲证券与市场管理局n Okatan co-first作者一律平等。

确认

这项工作已经从图由格兰特sbag - 111 s042。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。这个研究没有收到额外的外部资金。作者要感谢b可以为她他们的调查。