文摘

肝脂肪变性可进化性脂肪肝(纳什)通过一系列的生化肝细胞氧化应激相关的步骤。提出了抗氧化剂,如silybin、患者的治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和纳什。在这项研究中,我们评估,患者的组织学检查记录了纳什,氧化剂/抗氧化状态和在NASH患者的血清脂质“指纹”,无论是在基础条件和12个月的治疗后silybin-based食物积分器Realsil (RA)。氧化剂/抗氧化状态分析显示一组患者的存在基础疾病严重程度更高(NAS得分4.67±2.5)和第二组对应于临界纳什(NAS分数= 3.8±1.5)。慢性风湿性关节炎治疗改变了NAS分数两组达到统计学意义只在2组,其中也有明显降低血清脂质过氧化作用。lipidomic概要显示脂质成分类似的健康受试者恢复自由的价值观胆固醇,lysoPC, SM,电脑只与RA组2的患者在治疗后。结论。这些数据表明,lipidomic和/或氧化状态患者的血清纳什可能是有用的预后标记的抗氧化剂治疗的反应。

1。介绍

众所周知,非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是“代谢”表现的慢性肝损伤由于受损的“交通”的脂质在脂肪组织中,肌肉,肠道和肝1]。

非酒精性脂肪肝的发生与肝脏的脂质成分发生了诸多变化(2),这些患者的转移向权威肝病(纳什)与等离子lipidomic剖面的变化(3]。纳什的临床重要性有关进化的能力在肝硬化和肝癌4]。纳什的发展面临的主要风险因素是胰岛素抵抗[5- - - - - -7)增加脂类分解并释放出游离脂肪酸(FFA)造成肝损伤(8- - - - - -10)过度肝脏脂质积累。供应过剩的游离脂肪酸诱导线粒体H的增加₂O₂反过来,生产氧化线粒体膜和调节活动的解偶联蛋白2和肉碱棕榈酰转移酶1 (11]。线粒体在肝细胞新陈代谢,起到关键作用的网站β氧化和氧化磷酸化。使用代谢组学方法,它最近表明,纳什也以降低磷脂酰胆碱(PC)和改变n3 n6多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢2,3,12]。重要的是,花生四烯酸的水平(20:4 n6),许多生物活性的前体类花生酸,似乎耗尽(3]。现在还不知道如果这些变化可以导致循环变化lipidome如果纳什可以,因此,关联到一个不同的lipidomic签名。目前,没有直接证明了纳什和引入药物治疗能够降低氧化应激,与降低脂质积累,可能是重要的在这些疾病的控制。Silybin是一种天然黄酮类和水飞蓟素的主要成分。它的导数Realsil (RA)是一种化合物,silybin共轭与磷脂酰胆碱(PC)和维生素E来增强其肠道吸收和顺向生物利用度与抗氧化剂和antifibrotic活动(13]。Silybin有显著的抗氧化活性在体外和体内,因此调节葡萄糖在肝细胞内稳态13- - - - - -15]。我们最近报道,慢性治疗(12个月)的膳食补充剂RA口服一天两次都极大地提高了肝损伤(AST、ALT和血浆标志物水平GT)和肝脏组织学在大约50%的患者(非酒精性脂肪肝和非16]。在这项研究中,我们还发现,尽管没有观察到显著变化在全球人口饮食疗法和身体成分,在RA患者,大约15%的人减少的BMI值和35%减少血糖和HOMA测试(胰岛素抵抗的标志)。

在本回顾性研究中,我们解决慢性治疗RA的影响等离子体氧化应激标志物和lipidomic概要NASH患者。此外,我们也评估了在体外影响从纳什患者血清脂质积累引起的肝母细胞癌HepG2细胞。

2。对象和方法

研究伦理委员会批准后执行根据赫尔辛基宣言。这次审判是在欧洲注册临床试验数据库(EudraCT,参考2005-000860-24)。我们为目的选择冷冻血清80−30°患者组织学记录纳什根据文献数据(17与Realsil)和治疗连续12个月(意大利IBI-Lorenzini RA)(活性成分:silybin 94毫克,磷脂酰胆碱194毫克,和维生素E醋酸50% (α生育酚30毫克)89.28毫克)口服每日两次。基线临床特点研究的人口是总结表1。组织学诊断成立使用)和马森的三色的污渍formalin-fixed石蜡包埋肝脏和分级蒙蔽的方式根据提出的非酒精性脂肪肝评分系统国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的纳什临床研究网络。NAFLD活动得分(NAS)≥5与“最终纳什”的诊断,分3 - 4与“边缘纳什”,和得分< 3对应于“简单脂肪变性”(16,18]。

2.1。提取血清脂质和MALDI-TOF MS分析

磷脂中提取chloroform-methanol据布莱和染料(19]。Methanol-chloroform (2: 1 v / v;800年μL)添加到血清(200μ通过添加200 L)。引起相分离μL的水。混合物在1000 g离心10分钟。上阶段都被丢弃而降低氯仿相蒸发干燥在一连串的氮。的脂质于100年解散μL(氯仿。一个2μL整除用于MALDI-TOF女士的决心。MALDI-TOF女士实验由加载脂质混合物(1毫升解决方案0.02毫克/毫升的H₂O /不锈钢v / v的TFA) 0.1%的目标加上1μL矩阵2,5-dihydroxybenzoic酸(10毫克1毫升MetOH / 0.1% v / v组织)。光谱是PerSeptive生物系统公司(美国弗雷明汉,MA)旅行者DE-PRO质谱仪,配备了N₂激光(337海里,3纳秒脉冲宽度)操作在线性或反射器正离子模式下,使用延迟提取技术。在分析脂质,激光功率维持在最低可能的值,以防止生产的碎片。检查可重复性,光谱获得至少一式三份。

2.2。硫代巴比土Acid-Reactive物种(TBARS)水平

样本与0.5毫升的20%醋酸孵化,pH值3.5和0.5毫升的0.78%硫代巴比土酸的水溶液。在95°C 45分钟加热后,样品在4000 r.p.m离心机。5分钟。在上层的分数TBARS量化了分光光度法在532纳米20.]。结果表示为TBARSμ米/μ血清蛋白的g。每个数据点都是一式三份的平均值测量,每个实验重复进行。

2.3。亚硝酸盐含量

没有迅速转化成稳定的终端产品亚硝酸盐和硝酸盐。亚硝酸盐测定的格里斯反应报道文献[21]。简单地说,10μL的血清与同等容积的格里斯试剂混合(0.5%磺胺,2.5% H₃阿宝₄,0.05% naphthylethylene二胺在H₂O)和孵化在室温下10分钟。吸光度在550 nm化验,而使用亚硝酸钠标准曲线获得。

2.4。过氧化氢酶活性

过氧化氢酶(CAT)活性测定使用过氧化氢酶试验设备(开曼化学安阿伯,MI)根据制造商的协议。每个数据点进行了一式三份,结果报告为意味着吸收±标准差。

2.5。超氧化物歧化酶(SOD)的活性

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定超氧化物歧化酶的分析工具(开曼化工、安阿伯、MI)根据制造商的协议(22,23]。每个数据点进行了一式三份,结果报告为意味着吸收±标准差。

2.6。HepG2细胞的治疗NASH患者的血清

脂肪变性的组织定义的可见脂滴的积累超过5%的肝细胞。来确定病人的血清纳什可能诱发脂肪变性,HepG2细胞培养与池72小时血清组1和2的患者。我们使用两种血清T0和病人的时间。油红O(奥罗)方法用于检测细胞内脂质。

2.7。统计分析

值表示为均值±SE。之间的差异控制的意义,每个实验测试条件被未配对学生的分析以及,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。评价血清氧化应激标志物和代谢参数在NASH患者在基础条件和慢性治疗RA

虽然我们没有发现任何显著性差异NASH患者和控制之间的平均值,由于高个人间变异性和样本量,个人分析氧化应激标记(TBARS和没有)和抗氧化酶活动(SOD和CAT)显示的存在两个不同的组的患者。在第一组(组1)NASH患者(11/30),我们发现相比非常低水平的TBARS如果健康的控制。在这组,治疗RA显著(约5倍,)增加意味着血清TBARS和没有克服了平均值记录在健康受试者()。第二组(组2)19/30的NASH患者提出了非常高的意思是基底(T0) TBARS值如果健康受试者相比;在这些患者治疗RA显著降低TBARS平均值(2倍,),而不是平均值几乎是受药物治疗(表的影响2)。在表2我们还报道,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在前后两个之前定义组12个月的RA的治疗。在第1组明显降低(猫活动)的平均值被发现如果相比正常人,而在组2显著增加SOD活性的平均值()被记录。单独的评分系统非酒精性脂肪肝的特点,称为非酒精性脂肪肝活动得分(NAS),是作为一种工具来衡量变化在非酒精性脂肪肝的治疗试验(18]。有趣的是,组1提出更高的NAS分数(2(组)相比,)表明更高的基础疾病的严重程度。慢性风湿性关节炎治疗改变了NAS分数两组(表3);在组1中我们观察到一个无意义的减少(,),第2组并发症发生率明显降低(,)。纳什被报道的一个组成部分,所谓的“代谢综合症”,即一个集群异常与胰岛素抵抗密切相关的表型(24]。在1组平均体重指数、胰岛素和HOMA值没有显著改变治疗后(),而意味着血液葡萄糖浓度显著下降()。另一方面,在2组平均体重指数()、胰岛素和HOMA值显著降低(),而葡萄糖的浓度药物治疗后并没有改变。

3.2。Lipidomic概要文件的控制和纳什前后患者慢性治疗RA

每组的血清受试者参与研究(病人健康受试者和组1和2)分别汇集分析lipidomic概要的正离子MALDI-TOF女士在图1的质谱正离子MALDI-TOF有机脂质提取健康受试者的血清(CTR),组1、组2后的NASH患者在T0和慢性风湿性关节炎管理局(病人)所示。lysophosphatidylcholine水平(lysoPC)在棕榈酸()没有明显不同的三个研究小组之一。然而,脂质物种自由胆固醇、鞘磷脂(SM)和pc NASH患者在T0(组1、组2)基底健康受试者的如果相比下降。只有纳什患者12个月的RA治疗后2组(病人)显示类似的健康受试者的血脂恢复自由胆固醇值,lysoPC, SM和电脑。在表4主要的等离子体的识别和量化循环脂质在健康受试者,组1、组2在T0和病人报告。的山峰米/z在520年和524年之间被确认为LysoPC在亚麻油酸(十八2)十八烯(第18章)、硬脂酸(18:0)。在健康受试者中,三个类脂质一致表示,而纳什的两组病人显示的主要比例内lysoPC硬脂酸(18:0)如果lysoPC 18:1和18:2相比,即使在治疗类风湿性关节炎。电脑之间的比率百分比的健康主题和纳什的病人病人被报道在图2。只有在组2后的比例大约是1慢性风湿性关节炎。这些发现可能是由于增加的Δ9 stearoyl-coA desaturase (SCD)和elongase活动。重要的是,在纳什的病人PC与花生四烯酸(表的水平4),许多生物活性类花生酸的前体,是非常低的,但是他们只增加2组病人。RA治疗诱导PC 18:0/20:3两组增加,部分恢复他们的健康受试者的水平。

3.3。在体外从纳什患者血清脂质积累的影响在HepG2细胞

脂肪变性的组织定义的可见脂滴的积累超过5%的肝细胞。以确定NASH患者的血清诱导脂肪变性,如果RA可以参与脂质细胞积累,HepG2细胞培养与汇集72小时血清组1或2在T0和病人或健康受试者。油红O(奥罗)方法用于检测细胞内脂质(图3)。奥罗染色显微镜显示脂滴堆积在细胞质中HepG2细胞治疗后的血清(组1和2)T0和减少细胞内脂质细胞孵化组2在病人血清(数字3(一个)和3 (b))。没有记录在改变细胞暴露在健康受试者的血清(数据没有显示)。为了定量评估HepG2细胞脂质积累,我们执行奥罗比色测定(25]。在图3面板(c),定量奥罗比色测定对HepG2细胞72 h后孵化与纳什血清组1和2在T0和病人。两组的血清的影响1和2在T0决定增加约2.5倍的脂质滴如果比未经处理的HepG2细胞()。组2 NASH患者治疗后的血清RA(病人)诱导脂质积累的40%显著下降,如果比HepG2 T0的血清(处理)。

4所示。讨论

纳什的诊断被定义为特定的存在在肝脏活检组织学异常确定。因此,在所有的研究和试验非酒精性脂肪肝,肝组织学反应治疗的黄金标准评价(17]。血清标记物的脂质过氧化作用通常用来评估“氧化应激”的地位在活的有机体内在纳什的患者。本研究的数据表明,尽管显然类似的临床、生化、组织学特点,被发现在所有患者中,两个不同的组的患者可以根据参数的修改被发现氧化应激和脂质分析。这两组病人也不同灵敏度与RA的治疗。组1为特征,降低脂质过氧化TBARS试验评估,不是因为增加SOD和CAT活性,而第二组显示更高的TBARS值与正常活动的食腐动物酶值。胰岛素抵抗(IR)是两个组的共同特征。此外,组1提出更高的基底组织学评分()对应于一个更大的疾病严重程度,而第二组有一个NAS得分对应于临界纳什(17]。过度的肝脏脂质积累NASH的发病机理可以从一个或以下的组合结果代谢改变:(i)下降β脂肪酸的氧化;(2)增加由于upregulation脂肪生成的脂肪酸合成途径;(3)增加脂肪酸从脂肪和其他器官由于脂类分解与外周胰岛素抵抗(IR)和抑制VLDL-triglyceride [16]。

TBARS值较低的血清组1可能是由于更大的肝细胞内的积累循环FFA、动员通过红外,证明不代谢奥罗值的三倍增加显著的细胞治疗组1 T0血清。2组高TBARS值可能相关的肝细胞累积循环FFA, IR,所动员的部分代谢β氧化与生产有毒的醛及其后续释放进入血液循环。有趣的是,低水平的血清TBARS相关NAS高分数,而高TBARS NAS对应分数水平温和的疾病相关。慢性治疗RA诱导血清氧化状态的变化,代谢参数,和NAS分数两组。在组1中,我们观察到TBARS值的增加,呈现价值高于控制,降低空腹血糖,NAS得分的变化与边缘型纳什(见表3),减少约30%的奥罗值相比T0 sera-treated细胞。相反,组2显示,TBARS值明显降低,体重指数、胰岛素水平、HOMA测试,和奥罗值略高于control-treated细胞,在RA治疗。这些结果表明,12个月的长期管理RA疾病显著提高组2如图所示的NAS得分从3.6变化,对应“边缘型纳什”,对应于“简单脂肪变性。”

在目前的研究中,我们也评估治疗血清的影响“lipidomics”MALDI-TOF质谱分析。更具体地说,磷脂是所有哺乳动物细胞的重要组成部分,有各种各样的生物功能:(i)形成脂质提供结构完整性的影响蛋白质功能所必需的;(2)他们函数作为能源储层(例如,甘油三酯);和(3)作为各种前兆第二信使。在这种情况下,类脂和磷脂代谢有重要作用的确定纳什和血清中的修改的研究能反映肝脏中油脂的代谢(2,3]。事实上,研究循环“lipidome”并不提供直接信息变化在肝脏但它是一个工具来确定慢性治疗全身脂质代谢的影响。我们发现,脂质物种自由胆固醇,SM和PC纳什T0(组1、组2)患者健康受试者相比下降。在组2纳什患者中,慢性风湿性关节炎治疗恢复了胆固醇和磷脂正常价值。值得注意的是短信合成腔的高尔基体(26)和移动到外层膜多孔质膜的膜运输(27]。此外,短信有高亲和力的胆固醇和胆固醇形成一个复杂的外质膜的传单。RA治疗诱发,只有在组2,释放自由血清胆固醇和SMs。它可以推测,这个版本可以是由于增加的生产Lyso-PC 18:0,是一种两亲水脂分子,拥有“detergent-like”属性可能促进cholesterol-SM流出(28]。这些efflux-promotive效应lyso-PC被证实的事实,组2病人奥罗染色显示低于sera-treated细胞基底细胞(HepG2治疗组2 T0血清)。这些结果表明,lyso-PC可能抑制脂质积累在肝脏和纳什的发展疾病或增强其回归通过刺激cholesterol-SM流出。

总之,这是第一个研究中,至少据我们所知,这表明,12个月的治疗RA可以有用,以改善病人的代谢资产受到轻微的纳什。最后,我们的研究结果表明,这些患者的治疗RA诱导特定lipidomic剖面的变化可能由于不同的代谢反应的病人,应分层也为其他代谢改变(年龄、性别、AST、ALT、GGT水平,等等)。理解的基础代谢改变的纳什可能是有用的在未来拥有强大的预测血清标记能推动临床医生治疗这种疾病。

缩写

ALT:	丙氨酸转氨酶
AST:	天冬氨酸转氨酶
γGT:	γ谷氨酰转移酶
体重指数:	身体质量指数
非酒精性脂肪肝:	非酒精性脂肪肝病
纳什:	非酒精性脂肪肝炎
肝细胞癌:	肝细胞癌
FFA:	游离脂肪酸
LPC的:	Lysophosphatidylcholine
SM:	鞘磷脂
PC:	磷脂酰胆碱
ROS:	活性氧
没有:	一氧化氮
HSP27:	热休克蛋白27
稍后通知:	硫代巴比土酸
NAS:	非酒精性脂肪肝活动得分
PUFA:	多不饱和脂肪酸。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的部分L.5 Regione坎帕尼亚。作者感谢m . r . Cipollaro r . Viscardi, r·德拉圣技术援助。