西地那非变弱肝细胞损伤在大鼠肝脏缺血再灌注后:一项初步研究

文摘

我们评估西地那非的作用在大鼠肝脏缺血-再灌注模型。四十个雄性老鼠被随机分配在四组。虚假的组接受中线剖腹手术。西地那非组,西地那非是腹腔内接种虚假的剖腹手术前60分钟。缺血再灌注(I / R)组老鼠进行45分钟的肝缺血后再灌注120分钟,而在小鲱鱼+ I / R组大鼠受到类似的模式I / R后的西地那非,缺血前60分钟。两个小时再灌注后,血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测定和组织病理学检查叶受到缺血以及TUNEL染色法对凋亡的身体。此外,髓过氧化酶(MPO)活性和细胞间粘附的表达molecule-1 (ICAM-1)进行了分析。血清肝细胞损伤的标志是小鲱鱼+ I / R组显著降低,这也表现出较低的组织病理学病变的严重程度和更少的凋亡的身体,比I / R组。I / R组显示ICAM-1 MPO活性显著升高和高表达,而小鲱鱼+ I / R组。使用西地那非的预处理剂在大鼠肝脏I / R模型产生保护作用。

1。介绍

肝切除术在某些类型的血管控制目前的许多外科医生,因为他们可以保证少出血性外科领域利用肝脏宽容温暖性常温缺血(1,2]。虽然这些演习是无价的防止失血过多,让安全性能的过程中,他们总是复杂化缺血/再灌注(I / R)损伤(3]。此外,肝脏I / R损伤也会发生在其他各种临床情况下,包括肝移植、低血容量性休克、低产出综合症(4,5]。特别是,缺血导致细胞能量的损耗,积累细胞内钠、钙、和活性氧(ROS),导致细胞损伤和激活多种酶系统(3]。重建的血流再灌注会加重局部组织损伤继发于随后的急性炎症反应。Reperfused组织是由多形核白细胞和血小板激活,同时进一步渗透到组织损伤是通过细胞因子介导白细胞生产,补体的激活,当地一氧化氮(NO)水平不平衡,积累的血小板激活因子和内皮细胞粘附分子,最后形成自由基(6,7]。这种过度的炎症反应表现为血管收缩,血管内血浓缩,中性粒细胞迁移和依从性,血小板聚集(8- - - - - -10]。随后microcirculatory失败终于可以高潮对肝脏肝细胞凋亡和坏死的影响以及遥远的器官(11- - - - - -13]。

没有是一个关键分子,这被认为是一个重要的,但有争议的调解人的生理和病理过程中固有的I / R损伤,因为它已被证明有保护和有害的对细胞功能的影响(14]。它已被证明通过多种第二信使级联虽然大部分的影响通过环鸟苷酸(cGMP),反过来catabolised的5型磷酸二酯酶(PDE5)将cGMP转化为不活跃的GMP和终止其行动15]。没有从精氨酸合成三种亚型的NO合酶(NOS)、内皮合成酶(以挪士),诱导合酶(间接宾语),神经元合成酶(nNOS) [16]。以挪士负责的生产基础,维护正常的血管基调。进气阀打开,以挪士相反,是钙不敏感,特别是诱导氧化应激条件下,与有争议的结果在缺血再灌注(关于其作用16,17]。神经元(nNOS)是参与了缺血-再灌注神经信号没有参与事件(18]。

eNOS-derived没有被认为cytoprotective效应与cGMP I / R损伤起着重要的作用在调节细胞内钙水平和良好的调制的血小板功能刺激造成的松弛收缩的细胞和血管舒张(17,19]。因此,抑制PDE5抑制剂的cGMP退化可能保留cGMP池,从而促进有利的行动没有最终衰减的I / R损伤的表现。

西地那非是一种强有力的PDE5的选择性抑制剂,广泛用于治疗男性勃起功能障碍。它也被调查中持续肺动脉高压满意结果(20.]。有证据表明,西地那非也能够诱导preconditioning-like效应在I / R损伤的各种组织,如心脏、肺、肾脏和大脑(21- - - - - -24]。尽管数量显著的药理研究策略针对衰减肝脏I / R损伤的表现,文学是稀缺的使用西地那非在这个上下文。因此,我们设计了这个实验研究以评估效果的西地那非肝脏I / R大鼠模型,用组织病理学和生物化学参数。在特定的,我们测试了西地那非的假设对肝脏的保护作用,因为这已经证明了其他组织受到I / R的侮辱。

2。方法

2.1。动物和实验设计

这个协议是动物研究委员会批准的雅典和大学的生物伦理委员会的Aretaieion医院。处理和护理的动物是按照欧洲伦理动物研究指南。

四十雄性Wistar鼠体重300 - 350克。动物被安置在单独的笼子里,在恒温条件下(21°C),与交替12小时光/暗周期。他们也保持在一个标准的饮食和水随意。

动物被随机分配成四个组:一组不接受任何治疗,只接受中线剖腹手术(虚假的集团,),一组接受中线剖腹手术只是虚假的集团管理后的西地那非0.3毫克/公斤60分钟前操作(小鲱鱼+虚假的集团,),一群受到部分肝脏缺血和再灌注(I / R组,),一组接受了肝脏缺血和再灌注后的西地那非0.3毫克/公斤60分钟前诱导肝缺血(小鲱鱼+ I / R组,)。

西地那非是服用剂量为0.3毫克/公斤腹腔内注射。这个剂量的等效剂量用于肺动脉高压的管理(25- - - - - -27]。

2.2。外科手术

所有的动物与腹腔麻醉管理氯胺酮100毫克/公斤,甲苯噻嗪10毫克/公斤。老鼠与聚乙烯吡咯酮碘腹部剪掉头发,准备解决方案。所有后续程序进行使用无菌技术和无菌设备和接口。老鼠接受了4厘米中线腹部切口通过肌肉组织和腹膜。二十IU /公斤的肝素腹腔内接种。识别后的肝脏叶,门静脉被确认。在I / R和小鲱鱼+ I / R组门静脉和肝动脉闭塞使用防止损伤的血管夹,立即分岔后正确的侧枝。夹部分,旨在阻止门户静脉和肝动脉血液供应的值和左外侧叶肝脏。这产生了大约70%的肝缺血,保持45分钟时间。我们针对局部缺血为了避免长时间的血液淤积在脏的床上,这可能导致内脏的拥堵和肠道损伤。 For this reason, the gut was monitored macroscopically throughout the ischemic period for signs of portal hypertension. At the end of this period, the clamp was removed and portal and arterial blood flow were restored. Reperfusion was confirmed macroscopically by change of the color of the liver. In the sham and the sild+sham groups, only the hepatic pedicle was identified and hepatic vessel clips were not applied.

缺血性时期之后,两个小时再灌注。在此期间中线的腹部被关闭。结束的时候再灌注期腹部重新开放,从腹主动脉收集血液样本。从肝脏活检被叶受到缺血。

麻醉维持整个实验周期与腹腔内政府氯胺酮和甲苯噻嗪,在实验的最后,麻醉的动物被放血而牺牲了。

2.3。肝功能测试

收集后,血液样本在4000转离心20分钟和血清储存在−70°C到分析。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平测定在体循环使用维度RXL分析仪(戴德·贝林·杜邦,特拉华州)。

2.4。组织病理学评价

缺血性肝的组织样本叶缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡,然后切成3 - 5μ米的部分。下部分是沾hematoxylin-eosin标准组织学方法并通过光学显微镜进行了评估。病理评分系统,评估肝细胞肝坏死,五点评分量表和炎症浸润三点评分量表,如表所示1。

2.5。髓过氧物酶测定

组织样本的缺血性肝叶是髓过氧化酶(MPO)免疫组织化学染色。短暂,formaldehyde-fixed石蜡包埋部分是孵化30分钟在室温下以1%多克隆兔反人类的髓过氧化物酶抗体,根据制造商的说明(Dako病理产品,德国汉堡)。MPO染色是量化根据MPO的表达在三个光学领域(40 x放大)如表所示2。显微镜检查时都是由一个专家病理学家,谁不知道治疗组。

2.6。测量细胞间粘附Molecule-1 (ICAM-1) mRNA水平

的表达分析了ICAM-1逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)。从肝组织总RNA分离使用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。后来,5μg RNA用于互补DNA合成。ICAM-1基因表达规范化了肌动蛋白基因的表达。在下列温度:rt - pcr进行ICAM-1,变性在94°C 45秒,主要退火30秒55°C,和底漆扩展为90秒和72°C肌动蛋白,94°C 1分钟,1分钟55°C,分别为2分钟和72°C。引物的序列集被手枪GCT广汽有条件现金援助GGA GAG CA和CAG GGA CTT CCC ATC CAC ICAM-1 CT。那些肌动蛋白是答GGA ATC CTG TGG猫CC和ACA棉酚GCA ATG CTG柠檬酸CC。Semiquantification进行基因表达和mRNA的表达ICAM-1提出的比例肌动蛋白。

2.7。细胞凋亡检测

标本4μ厚也减少与TUNEL染色试验。这个试验是由标签免费3′-哦结束后所产生的DNA链断裂DNA碎片在细胞凋亡过程中,用荧光核苷酸与末端转移酶的酶标记方法。在我们的研究中一个商业工具Apoptosis-1 5(伊伦、罗马、意大利)是用于TUNEL分析,根据制造商的指示。10个随机领域每个TUNEL-stained组织样本进行了分析。所有幻灯片都进行同样的病理学家,谁不知道治疗组。数据对TUNEL染色表示为平均数±标准差的比例每大功率领域包含凋亡细胞核的身体。

2.8。统计分析

分布的变量检测正常Kolmogorov-Smirnov测试。AST和ALT值和ICAM-1 mRNA水平的比例肌动蛋白和凋亡的尸体正态分布实验群体之间的差异进行了分析和方差分析的一种方法(方差分析),其次是Holm-Sidak测试事后各个组之间的比较。组织学和MPO染色分数并不遵循正态分布和实验群体之间的差异进行了分析克鲁斯卡尔-沃利斯在方差分析,其次是Mann-Whitney测试事后各个组之间的比较。所有计算都是为Windows使用SPSS 17.0进行。统计显著性水平的设置。结果被表示为平均数±标准差或中位数(25 th - 75百分位数)根据常态分布。

3所示。结果

3.1。血清AST和ALT水平

肝脏I / R明显增加血清肝细胞损伤的标志。具体地说,两个小时的再灌注后,AST和ALT水平仅在I / R和小鲱鱼+ I / R组明显高于骗局和小鲱鱼+假组。然而,西地那非预处理的肝细胞损伤,如AST和ALT值小鲱鱼+ I / R组显著降低,而I / R组(ASTUI / dL和UI / dL,,图1)(ALTUI / dL和UI / dL图2)。

3.2。组织病理学分析

虚假的组和小鲱鱼+假组显示任何明显的组织学研究。肝脏I / R组样本显示广泛的领域3坏死区。此外,正弦拥堵,microthrombosis,嗜酸性变性肝细胞液泡化,中性粒细胞浸润。组织样本小鲱鱼+ I / R组表现出更低的病变的严重程度自肝细胞坏死和白细胞浸润病灶明显抑制相比I / R组(数字3(一个)和3 (b))。形态学研究结果进一步证实了半定量的评估,在小鲱鱼+ I / R组显著降低大量的肝细胞坏死和炎症浸润,如表所示3。

3.3。髓过氧化物酶染色

动物受到肝脏I / R的表达增加肝组织MPO活动相比,动物的骗局和小鲱鱼+假集团和MPO活性显著高于表达的动物相比,小鲱鱼+ I / R组()(表3)。

3.4。测量ICAM-1 mRNA水平

通过评估mRNA转录、肝脏I / R损伤相当ICAM-1 mRNA表达的增加,而小鲱鱼的西地那非预处理+ I / R组减毒I / R-induced mRNA表达(表3,图4)。

3.5。通过TUNEL染色评价肝细胞凋亡

小鲱鱼+ I / R组标本显示被TUNEL染色阳性细胞明显减少对I / R组(与含凋亡细胞核的身体比例;)(表3,图5)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们使用一个部分在大鼠肝脏缺血-再灌注模型,以模拟肝手术下血管闭塞的各个方面,包括手术治疗肝肿瘤、肝移植和肝创伤。之前的研究表明,炎症、细胞凋亡和改变微循环组织学发现明显甚至在肝缺血再灌注损伤的早期阶段。

我们的研究结果表明,西地那非用作预处理王亚南在部分肝脏缺血再灌注损伤大鼠模型。这是可以通过抑制增长的AST和ALT,大量坏死,减少衰减形态肝损伤和凋亡的活动。减少ICAM-1 mRNA的表达和减少leukocyte-endothelial互动,就是明证减毒MPO染色sildenafil-treated老鼠,也观察到。

过去,几项研究没有调查的作用在部分肝缺血-再灌注模型具有争议性的结果(14]。是否具有保护或有害影响可能取决于类型的侮辱,不产生的来源和数量,和肝脏的细胞氧化还原状态16,28- - - - - -31日]。认为内生(基底)不,由早期的短暂激活以挪士,保护肝细胞和内皮细胞在肝脏对再灌注损伤(32]。没有抵消endothelin-1引起的血管收缩,这是参与微血管功能障碍,特别是在肝脏I / R的早期阶段(33]。例如,人们已经发现,I / R损伤加剧e-NOS缺乏动物模型(34,35),而以挪士的基因超表达可以减弱肝脏I / R损伤大鼠模型(36]。因此,以挪士表达式通过保持基底的影响cytoprotective保护地生产行为水平对I / R损伤的早期阶段的正弦结构的保存和维护通过肝微循环血流量,从而限制I / R损伤的程度通过cGMP通路(14,16]。以挪士表达式表达下调导致肝脏再灌注期间以挪士活动的抑制氧化应激和缺血期间没有血窦内的流14]。没有从以挪士减少产量的增加肝内血管阻力的循环,有助于microcirculatory失败后再灌注(8,10]。类似的结果在微循环也被证明在肝硬化的上下文中。特别是,减少NO-related放松反应或减少肝没有生物利用度介导通过减少以挪士活动似乎是一个机制导致肝硬化肝脏的肝内阻力的增加(37]。同样,增加PDE-5的表达,可提高肝cGMP的退化和参与的减少血管舒张反应没有,一直在观察肝硬化大鼠肝脏的肝内血管38]。

另一方面,伊诺的诱导,刺激由氧化应激在再灌注和再灌注后6小时内,似乎会增加reperfusion-mediated肝损伤(16,17,39]。一旦引起什麽,没有过多的生产。在过氧化物的存在,没有形成过氧亚硝基,一个强大的氧化剂和蛋白质硝化剂和细胞的剧毒物质。过氧亚硝基随后可以分解生成类似于氢氧自由基的强氧化剂反应(40]。因此,除了有利的行动,不,生产过剩,也可以证明有害和有细胞毒性的潜力与超氧化物阴离子通过其互动和导致肝脏损伤伴随后期阶段或再灌注。在正常情况下,过度生产间隙是通过血红蛋白。然而,postreperfusion微循环失败可能导致受损的间隙,进一步加强再灌注期间没有的有害影响。

西地那非是一种有效的PDE5抑制剂,催化作用cGMP的崩溃。因此,西地那非保护区管理局NO-driven cGMP水平减少退化和提高其行动作为一个强有力的血管舒张和血小板聚集抑制剂(17,19]。cGMP激活蛋白激酶G,进而打开线粒体三磷酸腺苷(mitoK钾_{三磷酸腺苷})频道,赋予对I / R损伤的保护作用[17]。西地那非也已被证明能够移植以挪士表达式,从而直接提高没有生物利用度(41,42]。此外,大量的实验证据表明,蛋白激酶C的激活可能是细胞内的信号转导通路控制sildenafil-dependent心脏保护兔子的心(43]。mitoK西地那非的直接行动_{三磷酸腺苷}渠道也被建议调解sildenafil-induced预防缺血性损伤(44]。此外,西地那非已被证明有保护作用独立于任何/ cGMP途径[45]。最后,直接中和自由基归因于西地那非(46]。

西地那非已经使用在过去的缺血再灌注实验模型的各种器官如心脏、肾、大脑和肺21- - - - - -24]。它还在肺动脉高压的设置与管理良好的结果(20.,47]。文学是非常稀缺的,如果有的话,关于使用西地那非在肝脏I / R损伤的设置。

在目前的研究中我们选择管理西地那非在剂量为0.3毫克/公斤。此剂量对应剂量的肺动脉高压的研究和选择,因为它已被证明是耐受性良好,没有明显的血流动力学不稳定(25- - - - - -27]。腹腔内政府的首选每个操作系统政府由于肠道和肝第一轮效应特点,当口服药物生物利用度降低到14.6% (48]。的理由使用西地那非减弱I / R损伤,尽管已知的有害影响伊诺在再灌注诱导没有生产,是一种选择性PDE5抑制剂,作为预处理缺血和再灌注之前,没有提高的有益作用在以挪士reperfusion-induced抑制生产。此外,西地那非代谢和消除将防止任何增强的晚期再灌注时伊诺感应已被证明是细胞抑制剂和抗增殖。

根据我们的结果,在动物身上使用西地那非在肝缺血发作之前,肝细胞坏死和炎症浸润的衰减指出与动物的I / R组表现出更大程度的坏死和炎症在微观评价。这些发现描绘了西地那非预处理在细胞水平的有利影响。同样,肝细胞损伤的标志,AST和ALT减毒的动物使用西地那非。这表明,西地那非可能减弱氧化aggression-induced组织损伤通过肝细胞和正弦内皮细胞膜的稳定性和细胞内钙超载的最小化或通过改进正弦血液流动。西地那非管理的有益作用在微血管水平和血窦中也得到了证实肝硬化。在实验研究中,急性孵化的西地那非肝硬化大鼠肝脏血管舒张反应没有增加(38]。在人类研究中,西地那非急性管理增加肝的生产没有和cGMP减少肝硬化患者肝正弦信号电阻(49]。慢性西地那非政府似乎也有有益的影响。特别是,在动物研究中,一个星期的西地那非治疗增强生物利用度,导致肝内的衰减电阻在肝硬化大鼠肝脏50]。在这研究中,结果表明,西地那非的政府调节肝蛋白质的表达以挪士和增加肝内没有生产。此外,PDE-5水平sildenafil-treated肝硬化肝脏明显减少。最后,显著增加正弦信号区域指示增加血管舒张的正弦曲线和增强的体积流量是通过荧光显微镜的使用和microcirculatory分析。因此得出结论,没有/ cGMP途径是肝微循环,增强,引发血管舒张,增加肝内血流量(50]。没有增加和抑制PDE-5的西地那非的增加可能导致肝cGMP水平。它也表明,高流层流剪切应力增加的生产没有虽然激活以挪士(51,52]。因此可以推测cGMP的sildenafil-mediated增加产生的流剪切应力增加肝微循环有助于肝的生产没有增加了西地那非。西地那非的有利影响微循环中也得到了证实的肺和大脑血管。Tantini等人表现出抗增殖效果的西地那非人类肺动脉平滑肌细胞通过抑制血小板衍生生长factor-mediated激活信号转导途径(53]。此外,Rosengarten等人表现出有益的西地那非对大脑血管反应性的影响(54]。类似的良好的血管反应可能构成改进的组织病理学和生物化学概要文件在启动前动物使用西地那非I / R的实验研究。提供的hepatoprotection昔多芬可以在一定程度上也与hepatoproliferative属性被归因于西地那非和其下游信号通路。特别是,西地那非促进肝细胞再生的肝损伤大鼠模型引起的慢性乙醇喂养,表现的更大的肝细胞有丝分裂指数sildenafil-treated老鼠(55]。此外,西地那非管理在老鼠模型中剩余的部分肝切除术加速回复速度质量,所表达的细胞增殖标记和有丝分裂计数(56]。西地那非的有利影响肝再生在细胞水平上最近演示了在一个paracetamol-induced肝中毒大鼠模型(57]。

此外,MPO染色sild-I / R组明显减弱而nonsildenafil-treated动物。MPO neutrophil-specific酶,这期间分泌多形核的积累和用作肝指数白细胞浸润[58,59]。如前所述,在缺血,中性粒细胞积聚在内皮和这样的积累可能是再灌注后明显加速。激活中性粒细胞释放各种细胞毒性物质与内皮细胞相互作用,从而导致组织损伤(60]。此外,聚合中性粒细胞可以身体阻碍毛细管流,导致进一步缺血组织和,最后,它们释放大量的活性氧,导致氧化损伤与肝I / R损伤(61年]。因此,作为MPO活性成正比的嗜中性粒细胞计数,降低MPO染色sildenafil-pretreated动物可以归因于减毒中性粒细胞迁移和再灌注期间激活。

减少ICAM-1 mRNA的表达与西地那非政府也被观察到。ICAM-1是粘附分子发挥重要作用在leukocyte-endothelial细胞相互作用的过程。微血管内皮细胞白细胞的粘附是I / R损伤的表现,是由多种细胞表面分子ICAM-1。这个分子出现在低水平在大多数的内皮细胞,调节炎症和I / R损伤(10,62年]。事实上,阻止其活动与单克隆抗体被发现对I / R损伤的保护(63年,64年]。此外,没有发现捐助者减弱leukocyte-endothelial细胞反应和尽量减少粘附白细胞和内皮细胞表面之间的相互作用,从而维护血管开放(65年- - - - - -67年]。因此,它是可能的,西地那非,通过其下游通路,最小化这些粘附白细胞和内皮细胞表面之间的相互作用,抑制中性粒细胞组织一起迁移和浸润,如图所示的衰减MPO活性,保持血管渗透性,改善肝脏微循环。

sildenafil-pretreated集团关于凋亡反应显示显著减少细胞积极TUNEL染色的动物相比,I / R组。尽管过度炎症反应和坏死被广泛认为是肝损伤后的主要特征在这个过程中I / R损伤,也有证据表明,细胞凋亡也可以损伤的主要机制(11,12,68年]。很可能这部分保护作用引起西地那非可授予通过调制的凋亡反应。西地那非已经被证明可以直接保护成年小鼠心肌细胞对I / R损伤后细胞凋亡模型(42,69年,70年]。它也表明,生理刺激不可溶性鸟苷酸环化酶抑制细胞凋亡(71年]。另一项研究表明,eNOS-derived并不可能协助减少凋亡细胞的比例在肺缺氧/复氧模型(72年]。此外,Akao等人的一份报告表明,mitoK开证_{三磷酸腺苷}通道能够降低氧化应激诱导细胞凋亡在新生大鼠心肌细胞73年]。因此,我们可以假设一个NO-cGMP信号通路可能是通过其mitoK西地那非对肝细胞凋亡的保护作用_{三磷酸腺苷}通道开放属性,因为这已经证明在兔心脏模型(44]。我们的研究首次证明西地那非的凋亡效应实验通过TUNEL染色肝脏I / R损伤。虽然需要进一步的研究来描述具体的凋亡通路参与西地那非行动。

我们的研究有一定的局限性,包括简短的监测期以及这一事实没有血流动力学监测的动物在我们的实验。此外,我们研究了单一剂量的西地那非,所以我们只能推测不同给药方案的效果。

总之,这项初步报告表明,西地那非的结果似乎减弱肝脏缺血再灌注损伤时腹腔内接种前肝缺血根据形态和功能标准,与preischemic政府模仿预处理的生理现象。这个概念需要进一步研究使用不同的剂量方案,政府时期,为了推断和持续时间的治疗实验研究的结果真实临床环境中,为了能够评估sildenafil-mediated保护肝细胞在肝脏移植和设置的主要肝切除术,代谢和能源支持的小肝残骸可能是非常重要的。此外,西地那非管理后处理的方式也可以调查,因为可能有临床事件的发生再灌注是更可预测,它可能更可行的启动政府在再灌注而非缺血性事件。最后,未来的研究应该包括血流动力学监测的西地那非政府设置的肝脏I / R损伤以及评估西地那非行动的确切机制细胞凋亡通路。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者要感谢辉瑞,希腊,请提供西地那非粉。

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