文摘

目前,唯一的心力衰竭患者的治疗选择是移植。延长移植物中生存和调制先天和适应性免疫反应仍在进行临床和研究实验室。转录因子Nrf2控制主要细胞生存途径和调节炎症和免疫反应的核心。在这项研究中Nrf2水平的影响在主机接收方C57BL / 6小鼠Balb / c同种异体移植物生存了。重要的是,Nrf2−−/收件人老鼠不支持平均超过7.5天的贪污,而激活Nrf2 Nrf2的萝卜硫素+ / +主机延长移植物存活13天。一些免疫细胞在受体小鼠的脾脏不变;然而,CD11b+巨噬细胞在Nrf2显著增加−−/老鼠。此外,IL-17移植移植到Nrf2 mRNA水平升高−−/老鼠。尽管Nrf2似乎在移植物的生存起到至关重要的作用,具体的作用机制尚未完全清楚。

1。介绍

心脏移植是终末期心力衰竭的唯一恢复技术,成功的移植和同种异体移植物排斥反应仍然是一个重要的障碍。一个同种异体移植物的免疫反应是一个正在进行的交换之间的先天和适应性免疫系统,如果任其发展,最终将导致移植器官排斥。此外,植入移植被认为是“非我”的接受者免疫系统由于不和谐的主要组织相容性复合体(MHC);更重要的是,其他免疫原性信号,如造成组织损伤器官和缺血/再灌注损伤也能促进宿主免疫反应和移植排斥。

转录因子核因子(erythroid-derived 2)——2 (NFE2L2)或“Nrf2”是一个主调节器的细胞抗氧化反应。绑定Nrf2促进细胞存活的抗氧化反应元素(是)启动子的下游靶基因促进外源性物质的解毒和清除活性氧(ROS)。Nrf2激活的好处已经证明在各种病理状态如糖尿病、化学预防、心血管和神经系统疾病(1- - - - - -5]。

Nrf2在炎症和免疫调节细胞正迅速成为建立。激活Nrf2似乎TGF等对抗炎症通路 1、NF - B (6,7]。对移植的生存(即Nrf2的影响。,liver or cardiac stem cells) has been investigated from the side of the donated tissue [8- - - - - -10]。然而,Nrf2基因型和/或调制的接收方主机尚未研究。本研究的目的是确定在接收方主机Nrf2如何影响移植物生存在一个同种异体心脏移植的小鼠模型。

2。方法

2.1。动物和手术

Nrf2+ / +(WT)和Nrf2−−/(KO) C57BL / 6小鼠(前面描述的11)年龄在8 - 12周被用作受体小鼠心脏移植研究。六十八周的Balb / c小鼠购自杰克逊实验室和用作心脏移植捐赠者的研究。所有的动物都收到了水和食物随意。Nrf2 WT老鼠不及时治疗或者萝卜硫素(SF) (WT + SF)腹腔注射(12.5毫克/公斤体重)一天移植之前,每48 h后移植到动物被牺牲了。KO小鼠不及时治疗,或一个更小的子集也接受了科幻治疗完全如前所述评估科幻代理通过Nrf2通路的特异性(数据没有显示)。器官接受者动物牺牲,收获了分析移植后第二天,5天。额外接受动物每天监测评估可行性的供体心脏通过监测跳动在颈部皮肤下。这些受体小鼠牺牲,一旦移植器官收获了分析不再是可行的。研究设计的图和动物组织(包括N造)提供在图1。


图1
研究设计图表。研究设计的示意图,时间点,N造为每个组提供。短暂,供体心脏和受体术后脾脏移植后2天,5天,收获和捐赠心脏移植存活的最后一天的收获分析。为Nrf2+ / +萝卜硫素治疗组(SF),动物被注射移植前1天,然后每48 h直到组织收获。

颈部异位心脏移植的小鼠模型都使用了鹭袖口技术和一直在前面描述的老鼠12]。总之,正确的颈颈总动脉和颈外静脉在收件人C57BL / 6小鼠孤立吻合。夹子被放置在最尾的颈动脉和颈外静脉,而颅结束的结扎和切断。聚四氟乙烯“袖口”放在尾颈动脉和颈静脉,和Balb / c捐赠者主动脉和肺动脉连接到套管的接受者颈颈总动脉和颈外静脉结扎和固定。血液供应被释放尾夹立即恢复,和颈切口关闭如果移植心脏跳动的很好而没有明显的出血。亚利桑那大学的制度动物保健和使用委员会批准了所有动物处理和手术协议。

2.2。组织学

移植供体的心是福尔马林固定和石蜡包埋,和部分被削减 4μ米厚度的苏木精和伊红())染色和免疫组织化学(包含IHC)分析。心沾)进行评估一般组织学和拒绝根据国际社会对心脏和肺移植13]。短暂,心脏部分移植后第二天,5天由训练有素的病理学家进行评估和评估拒绝等级定义如下:1 r =温和,局部血管周的和/或间质浸润无肌细胞损伤;2 r =中等,多病灶的渗透与肌细胞损伤;3 r =严重,多功能的扩散渗透与广泛的肌细胞损伤和/或水肿和/或出血和/或血管炎;或“奎尔蒂”=炎症由外向内的,也就是说,从心外膜和侵入心肌,可能由于感染,而不是排斥。

2.3。流式细胞术分析

单细胞悬浮体脾被剁了器官的细胞通过一个过滤器菜和彩色根据标准程序。如果没有提到的,所有的抗体购自BioLegend(美国圣地亚哥)。流式细胞术在BD FACSCanto或执行Accuri C6流式细胞分析仪(美国圣何塞BD生物科学)。细胞表面染色CD3、CD4、CD8 B220, NK, NKT,巨噬细胞,和DCs标准协议后执行;脾细胞总数和PMA刺激(50 ng / mL) / Ionomycin (1μg / mL) (在体外为4 h与莫能菌素);细胞内染色FoxP3,干扰素-γ、IL17 IL4完成使用eBioscience染色缓冲区。所有的数据进行了分析使用FlowJo软件(美国亚什兰FlowJo)不含细胞对比。

2.4。RNA隔离和qPCR

从供体心脏组织总RNA分离使用试剂盒。RNA质量评估使用NanoDrop (DE)威尔明顿的260/280的比率。样品的比率1.7 - -2.1被用于下游基因分析。大约1μ从每个示例使用M-MLV reverse-transcribed g总RNA (Promega,麦迪逊,WI), oligo-DT,随机引物,从罗氏核苷酸(印第安纳波利斯,)。互补脱氧核糖核酸被稀释~1:25日在核酸酶用于qPCR自由水。基因内区生成,使用的所有引物和基因表达水平进行了分析使用TaqMan化学与罗氏的引物和探针设计普遍调查图书馆设计中心。所有实验LightCycler 480(罗氏)。使用2相对基因表达进行了计算−ΔΔCT方法(14根据MIQE],研究设计指南(15]。所有家务和目标基因评估、标准曲线进行评估系列稀释10倍控制cDNA确定反应效率。管家之间的效率和目标基因不同> 5%,效率可能占480年LightCycler软件在分析相对基因表达。目标基因的完整列表和引物在表提供1。特异性引物对评估通过使用no-RT和水模板控制样本。只有引物没有放大一个以上的产品或任何产品no-RT和水控制用于最后的实验。

表1
引物用于qPCR实验。
2.5。统计分析

单向方差分析使用Tukey-Kramer事后分析之间的差异意味着评估统计差异动物组织和时间点为生存时间和流式细胞术。数据分析了qPCR使用罗氏LightCycler相对比较软件,基于2−ΔΔCT方法。每个引物组的效率由标准曲线分析和考虑软件算法来确定相对管家基因表达,鸟氨酸脱羧酶(Odc)。

3所示。结果

3.1。激活Nrf2延长移植物存活小鼠的心脏移植

检查Nrf2在心脏移植移植物存活率,心从Balb / c小鼠移植到C57BL / 6 Nrf2+ / +(WT)有或没有萝卜硫素(WT + SF)治疗或Nrf2−−/(KO)老鼠。表2说明Nrf2损失函数在老鼠导致显著短Balb / c移植物的存活时间与野生型同行相比,这意味着Nrf2在移植物的生存具有保护作用。值得注意的是,收件人Nrf2待遇+ / +与老鼠的Nrf2活性科幻显著延长移植物的存活到近13天。图2提供了一个代表性的例子Nrf2水平移植移植后2天。注意最小Nrf2 Balb / c的表达在几个核供体心脏移植到Nrf2 WT(图2(一个))和KO(图2 (b)老鼠,而Nrf2表达式是增加在移植Nrf2 WT收件人老鼠接受了科幻治疗(图2 (c))。重要的是要注意,治疗Nrf2科幻−−/小鼠没有表现出对贪污的总体生存时间的影响(数据未显示),表明科幻治疗保护心脏移植排斥反应主要是通过Nrf2激活。因此,激活Nrf2有很大的治疗潜力在移植延长移植物的存活。

表2
整体Balb / c供心的生存。
(一)
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(c)
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图2
Nrf2包含IHC染色捐赠Balb / c心脏移植后2天。Formalin-fixed和石蜡包埋的心脏捐赠者Balb / c小鼠心脏移植后分析Nrf2表达式两天。Nrf2水平温和如图所示的最小核染色C57BL / 6接受者Nrf2 WT (a)和KO (b)组。治疗C57BL / 6接受者Nrf2 WT与科幻小说(c)增加核表达Nrf2捐献者。箭头表示积极核染色。
3.2。治疗与萝卜硫素受体小鼠延迟移植排斥反应

分析了捐赠Balb / c的心在2和5天移植后组织学和拒绝的分类。的总结分析和表中提供了完整的数据表示3,代表图像每个动物的病理组织学分类显示在图中3。总之,Nrf2+ / +和−−/动物显示出一些低级的拒绝(见图3 (b)1级代表图像的r)在移植后2天被观察到了类似水平的淋巴细胞浸润。值得注意的是,Nrf2+ / +动物使用科幻没有组织学表现出排斥移植后2天(见图3(一个)代表图像),这表明激活Nrf2可以延缓移植排斥反应。然而,所有的动物都显示明显的迹象移植排斥移植后5天(见图3 (c)为代表的形象年级2 r), Nrf2+ / +动物的所有迹象显示“奎尔蒂”,这一现象被认为是独立于拒绝,显示来自心外膜的渗透和渗透向内(见图3 (d)为代表的形象“奎尔蒂”)。这些数据表明,激活Nrf2科幻能够延迟移植排斥和免疫细胞的浸润,至少第一次移植后2天,可能导致显著增加整体移植生存观察这些动物。

表3
萝卜硫素预处理延迟移植排斥。
(一)
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(c)
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图3
代表组织学捐赠Balb / c的心。心隔离在移植后2和5天被拒绝的组织学分级进行了分析。代表图像显示没有拒绝(a), 1级拒绝(b), 2级拒绝(c)或“奎尔蒂”现象(d)。图片在20 x。
3.3。在接受者的脾脏Nrf2 IL-17影响生产

T细胞是急性移植排斥(主玩家,因审查16])。调查一个潜在机制调解拒绝Nrf2 KO小鼠中,我们分析了t细胞免疫反应在受体小鼠的脾脏。没有显著的差异,总T细胞(CD3的数量+),CD4+,CD8+,Th1、Th2 Tc1、Tc2脾脏的接受者(图4)。然而,Th17细胞因子和IL-17 mRNA水平明显高于KO的捐赠心脏移植受者移植后2天(图5)。认为Nrf2损失函数一起促进心脏移植排斥(表2贪污),高架IL-17生产可能导致拒绝。符合组织学分析,在移植后5天IL-17捐赠心脏的mRNA水平升高所有接受者群体不管基因型或治疗,这意味着其他因素存在于graft-specific免疫反应由于改变Nrf2函数。

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图4
t细胞的数量通常不变的脾脏移植受者。流式细胞术分析脾脏与受体小鼠(Nrf2 WT, KO,或WT + SF)在第二天(2 d)或移植后第五天(5 d)。没有发现显著差异在t细胞数量包括总(CD3+)(a)、亚群(b), CD8+CD4 (c)+(d), Th1+(e), Th2+(f), Tc1+(g),或者Tc2+(h)。N大小范围从4到7动物每组,每个时间点。
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图5
Th17 IL-17趋势在脾脏和移植,分别从Nrf2 KO接受者。流式细胞术分析受体小鼠的脾脏(Nrf2 WT, KO,或WT + SF)在移植后第二天(2 d)显示了一个趋势增加Th17细胞KO组(a)。这是支持,尤其是高IL-17 mRNA的表达在移植隔绝Nrf2 KO接受者在2天(b),组间没有差异在5天。
3.4。Nrf2 KO小鼠反应中生成一个人口大大增强巨噬细胞移植

评估从收件人C57BL / 6小鼠脾脏non-T-cell免疫细胞显示CD11b大幅提升+F4/80+在KO小鼠巨噬细胞(图6(一)),而其他non-T-cell人群如NK、特区和B细胞是不变不管基因型,治疗,移植后或时间点(图7)。这些数据暗示可能联系的高架脾脏巨噬细胞人口KO小鼠心脏移植排斥。评估是否这些额外人口KO动物巨噬细胞与巨噬细胞浸润增加贪污,我们评估包含IHC CD11b表达式,以及CD11b F4/80 mRNA表达从每个动物移植组。分析包含IHC formalin-fixed CD11b,石蜡包埋移植产生不确定的结果由于移植物内最小的阳性染色(数据没有显示)。此外,评估mRNA水平CD11b F4/80没有显示任何显著的变化表达(小于2倍)组间数据归一化到Nrf2 WT第二天集团(图6 (b))。

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图6
CD11b+巨噬细胞显著增加脾脏Nrf2 KO接受者。(一)流式细胞术分析脾脏隔绝受体小鼠(Nrf2 WT, KO,或WT + SF)在第二天(2 d)或5天(5 d)移植后显示CD11b大幅上升+KO脾脏细胞。(b)说明了相对mRNA水平CD11b(固体酒吧)和F4/80(条纹酒吧)捐赠Balb / c的心在移植后2到5天。没有显著改变Nrf2收件人群组之间的观察2倍以上。
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图7
没有改变non-T-cell免疫人群无论Nrf2基因型。流式细胞术分析脾脏与受体小鼠(Nrf2 WT, KO,或WT + SF)在第二天(2 d)或5天(5 d)移植后并没有透露其他差异non-T-cell免疫细胞如NK (a)、NKT (b),树突状细胞(c),或者b细胞(d)。

4所示。讨论

目前心脏移植是终末期心力衰竭疾病的唯一选择,和延长移植物存活仍然是热门的研究主题。在这项研究的影响Nrf2宿主防御和同种异体移植物的生存。我们的结果支持,Nrf2需要保持移植物存活率,Nrf2通路的激活可能会被证明是有利于延长移植心脏的生活。

Nrf2在先天和适应性免疫系统继续被发现。最近,Nrf2涉及改变成熟的树突状细胞(dc) [17,18]。此外,激活Nrf2在老年小鼠移植Th1免疫力维持直流氧化还原平衡(19]。虽然我们没有直接评估DC成熟或costimulatory反应在最近的研究中,没有改变直流总人口观察脾脏的Nrf2 WT, KO、WT +科幻治疗老鼠。更重要的是,激活Nrf2的常见食品防腐剂,叔丁基氢醌(特丁基对苯二酚),似乎斜CD4细胞+向Th2 T细胞分化;然而,没有可观察到的CD4细胞的差异+或Th2+在任何我们的治疗组T细胞。在当前的研究中,我们利用一个著名Nrf2催化剂,异硫氰酸酯的萝卜硫素。一种可能性是,或者这两种活化剂的作用机制可能脱靶效应通过non-Nrf2-mediated通路影响t细胞分化。

Nrf2 KO小鼠已被证明患有脾肿大和脾脏细胞死亡和炎症在老年,也导致增加引起的溶血性贫血封存IgG-bound红细胞在脾脏20.]。尽管Nrf2损失与其他自身免疫性疾病21),李等人是贫血的研究而不是损伤诱导的氧化应激增加。很难确定一个潜在的免疫介导性贫血的KO小鼠在这项研究可能影响移植排斥的系统性免疫反应;然而,考虑到年轻的老鼠在目前的研究中,它是不可能的。

在细菌感染和败血症,Nrf2已被证明有助于动员免疫反应和抵消单核细胞的氧化应激22,23]。事实上Nrf2在调制是至关重要的一个“适当的”水平的炎症反应,以免损害宿主器官和细胞。Nrf2损失显著影响生存在实验脓毒症由于管制和激活炎症Nrf2可以改善生存的24]。一些这方面的证据是目前研究中发现CD11b的地方+脾脏巨噬细胞明显升高的Nrf2 KO在心脏移植后2天,指示一个不成比例的先天反应移植后早期。然而,后续的分析包含IHC和qPCR不能确切提供证据的巨噬细胞浸润增加Nrf2 KO接受者的动物。Nrf2 WT老鼠当基于科幻小说并不显示CD11b显著降低+计数。一种可能性是,Nrf2激活通过科幻小说能够减少先天反应早期移植排斥从而延长整个移植物的生存 5和 分别3天在KO和WT老鼠。综上所述,在KO脾脏巨噬细胞数量的增加可能不会导致增加渗透到贪污;然而,增加巨噬细胞的外周淋巴器官可能导致生产额外的因素,如细胞因子、ROS活动,和应激反应,导致前面的拒绝。

额外大道值得追求的未来工作的具体清除ROS介导的Nrf2途径。与器官移植缺血再灌注损伤是一种常见的问题,之前的研究已经证实,决定拒绝在接受者的免疫反应(25]。可怜的移植耐受的一种解释Nrf2 KO小鼠可能是由于他们缺乏清除活性氧的能力。缺血再灌注损伤本身产生高水平的ROS,建立一个环境的炎症和浸润白细胞。治疗接受者Nrf2 WT与科幻老鼠可能减少ROS生产和协助减少炎症趋化因子环境以及改变贪污推迟入侵的接受者免疫效应器。

有趣的是,t细胞之间只有细微的差别和受体小鼠的脾脏non-T-cell人口研究。尽管CD11b+巨噬细胞是唯一的细胞群,达到统计学意义,Th17细胞趋势被高Nrf2 KO小鼠,这得到了压倒性的存在IL-17 mRNA在移植后2天从KO小鼠移植。相反,IL-17 mRNA明显降低移植收获2天从WT移植后小鼠接受科幻。这些数据支持,尽管可能没有差异在t细胞分化或总人口,也许贩卖的免疫细胞是不同Nrf2 WT KO基因型。

5。结论

这里介绍的工作显示的重要性Nrf2移植物生存在一个同种异体心脏移植的小鼠模型。这些数据提供一个初始的洞察Nrf2激活在移植治疗的好处。需要做更多的工作来证明假设提出了在这项研究中,以及完全审问Nrf2(及其激活)在心脏移植能够延长移植物的存活。虽然机制是至关重要的,在临床中使用Nrf2催化剂的影响,提高同种异体移植物存活率是我们目前的工作了。

利益冲突

作者没有利益冲突披露,如金融资产、社会兼职、顾问职位,董事会成员,专利控股,或参与任何商业次要利益。

作者的贡献

w·吴和问:秋同样这项工作。