文摘
缺氧neuroinflammatogen最近提出,使小胶质细胞产生促炎细胞因子,包括interleukin-1β(il - 1β)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和il - 6。考虑到蜂胶王亚南,抗肿瘤,抗氧化,抗炎作用,蜂胶对低氧诱导的神经炎症反应的保护作用。在这项研究中,蜂胶(50μg / mL)被发现显著抑制低氧诱导细胞毒性和促炎细胞因子的释放,包括il - 1β肿瘤坏死因子-α后,il - 6, MG6小胶质细胞缺氧暴露(1%啊2,24小时)。此外,蜂胶显著抑制低氧诱导的活性氧(ROS)从线粒体和核转录因子的激活κB (NF -κ在小胶质细胞B)。此外,全身治疗与蜂胶(8.33毫克/公斤,2次/天,i.p) 7天显著抑制小胶质il - 1的表达β肿瘤坏死因子-α、il - 6和8-oxo-deoxyguanosine, DNA氧化损伤的生物标志物,在老鼠的躯体感觉皮质受到缺氧暴露(10%啊24 h)。这些观察表明,蜂胶抑制低氧诱导神经炎症反应通过抑制NF -κB在小胶质细胞激活。此外,增加代线粒体ROS的NF -负责κB激活。因此,蜂胶在预防低氧诱导神经炎症可能是有益的。
1。介绍
大脑是非常容易被缺氧受损,因为它对氧气供应的高需求(1]。小胶质细胞是居民先天免疫细胞在大脑中,构成大脑的第一道防御侮辱(2,3]。人们普遍认为缺氧是大脑中的neuroinflammatogens之一,因为缺氧激活小胶质细胞引起过度分泌的促炎细胞因子,包括interleukin-1β(il - 1β)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)[4- - - - - -7]。也知道,小胶质细胞中分泌的促炎细胞因子促进老年人的认知缺陷和阿尔茨海默病(AD)患者(8,9]。在先前的研究中,我们发现,增强生产活性氧(ROS)由于增加了线粒体DNA损伤小胶质细胞负责夸大年龄动物炎症反应和脂多糖治疗后,由于增加了细胞内ROS水平激活核因子-κB (NF -κB)负责监管几个促炎细胞因子的表达10]。缺氧会让小胶质细胞产生活性氧(11- - - - - -14]。因此,它是合理的考虑,缺氧激活NF -κB诱发夸张的炎症反应通过增强活性氧的生产由于小胶质细胞线粒体DNA损伤。
蜂胶是蜜蜂所产生的树脂物质防御入侵者。有关治疗属性,自古以来被使用。蜂胶的化学成分取决于当地花卉现场收集的15,16]。考虑到蜂胶王亚南,抗肿瘤,抗氧化,抗炎作用17- - - - - -20.),蜂胶可能对低氧诱导的神经炎症反应的保护作用。在这项研究中,我们提供了第一个证据表明,蜂胶可以显著抑制il - 1的分泌β肿瘤坏死因子-α和白细胞介素- 6 (il - 6)通过抑制NF -小胶质细胞κB在小胶质细胞激活。此外,蜂胶显著抑制ROS的生成增加线粒体的NF -负责κB激活。这些观察表明,蜂胶预防低氧诱导神经炎症可能是有用的。
2。材料和方法
2.1。试剂
巴西绿蜂胶乙醇提取物(蜂胶)从山田养蜂购买中心,公司有限公司(日本)。细胞培养的合适浓度的乙醇滴定为了防止乙醇溶剂引起的干扰。山羊anti-mature il - 1β(mIL-1β),山羊anti-TNF -αanti-phospho-I、山羊anti-IL-6和老鼠κBα,兔子anti-IκBα、鼠标anti-phospho-p65买来圣克鲁斯生物技术(特拉华州大道圣克鲁斯,CA)。兔多克隆抗体anti-Iba1和光纯化学品购买从kouichi(日本札幌),和鼠标单克隆anti-8-oxo-deoxyguanosine (8-oxo-dG)从NOF购买公司(日本京都)。
2.2。小胶质细胞培养
c-myc-immortalized鼠标小胶质细胞系,MG6(这里细胞库、筑波、日本),是维护在杜尔贝科修改鹰中含10%胎牛血清(ICN生物医学,Inc .)与100年补充μ米的β巯基乙醇,10μ100年胰岛素,g / mLμ克/毫升的链霉素和100 U /毫升的青霉素(BD猎鹰,富兰克林湖,新泽西)21,22]。
2.3。测定细胞存活率
相对细胞生存能力是衡量使用CellQuanti-MTT细胞生存能力分析工具(生物测定系统,海沃德,美国)。分析是根据制造商提供的协议执行。570纳米的吸光率是由使用一个微型板块读者。
2.4。低氧暴露
为在体外研究中,MG6小胶质细胞(细胞密度的2×104细胞/毫升)镀下过夜,然后培养normoxia(20%啊2,5%的公司2)或缺氧(1% O2,5%的公司2,92% N2)在37°C指定时间使用室(模型:MCO 18米;三洋生物医学电子有限公司,日本东京)。为在活的有机体内研究中,十八C57B / 6 n小鼠(四周岁)有或没有治疗蜂胶(9老鼠,8.33毫克/公斤,2次/天,i.p) 7天被放置在一个暴露于低氧室(模型:MCO 18米)充满10%的氧气和95%的氮的气体混合物4 h。老鼠被允许恢复在常氧条件下24小时后杀死。十八岁的另一组老鼠保持外室被用作匹配控制。本研究机构批准的动物保健和使用委员会九州大学。
2.5。组织准备
老鼠被暴露于normoxia或缺氧预处理的propoplis(8.33毫克/公斤,2次/天)。小鼠暴露于低氧预处理为0.01 M磷酸盐(PBS, pH值7.4,2次/天)控制。老鼠与戊巴比妥钠麻醉(30毫克/公斤,i.p。)然后被灌注intracardially PBS (pH值7.4)和高碘酸赖氨酸多聚甲醛(PLP)固定剂含有钠metaperiodate 0.01米,0.075米l-lysine-HCl, 2%多聚甲醛,0.03%磷酸缓冲(pH值6.2)。大脑被移除和沉浸在相同的固定剂在4°C 6 h。2天的标本被cryoprotected 30%蔗糖在PBS然后被嵌入到一个最佳的切削温度复合(樱花Finetechnical有限公司,东京,日本)。连续冠状冻结部分(14μ躯体感觉皮质的m)与免疫组织化学染色和double-immunofluorescent染色准备之前报道(23,24]。
2.6。线粒体活性氧的检测
线粒体ROS测量使用MitoSOX红(美国表达载体),这是一个live-cell浸透的快速和选择性地针对线粒体(25]。一旦进入线粒体,MitoSOX红试剂是由过氧化物氧化和展品红色荧光(激发在510 nm,排放在580海里)。培养MG6的小胶质细胞(细胞密度1×105细胞/毫升)暴露在nomoxia或缺氧蜂胶(50的存在与否μg / mL)。收集细胞在治疗后24小时,然后孵化在汉克的平衡盐溶液(hbs)包含5毫米MitoSOX红10分钟37°C。孵化后,细胞被洗两次与PBS的细胞被安装在一个温暖的缓冲成像。图片收集使用×20物镜(NA = 0.50, 200 x放大,产生一个框架的0.575毫米2)。过程导致任意光密度值在0(背景染色)到255的规模。
2.7。免疫荧光成像
MG6小胶质细胞暴露于normoxia或缺氧60分钟使用一个室(模型:MCO 18米)蜂胶(50的存在与否μg / mL)和4%多聚甲醛固定,然后用鼠标anti-NF孵化-κB p65(1: 500年,F-6)一夜之间在4°C。孵化后anti-mouse Alexa 488(1: 2000年,杰克逊Immunoresearch实验室。Inc .)在4°C 2 h,然后他们被孵化与赫斯特(Sigma-Aldrich 1: 2000年,日本)和安装在抗衰落Vectashield媒介。荧光图像被使用共焦激光扫描显微镜(样品形貌;C2si、尼康、日本)。
部分水分,接受10%的驴血清1 h在25°C,然后孵化与每个主要抗体在一夜之间在4°C。主要是山羊多克隆抗体anti-IL-1β多克隆抗体(1:500),山羊anti-TNF -α(1:500),山羊多克隆anti-IL-6(1: 500),和鼠标单克隆anti-8-oxo-dG(1: 500)抗体和兔多克隆抗体anti-Iba1 (1: 5000)。部分是用PBS和孵化FITC-conjugated和rhodamine-conjugated二级抗体的混合物为2 h 25°C。部分被清洗,安装在抗衰落介质Vectashield(向量实验室),然后检查了一个共焦激光扫描显微镜(样品形貌,C2si、尼康、日本)。样品形貌图像的各个部分作为一个堆栈1μm步长沿z20 x方向与目标(数值孔径= 0.5),放大系数1.0。一个矩形(1024×1024像素)的大小为450×450μ被用来计算框架。样品形貌图像显示为堆叠的中间图像。
2.8。酶联Immunosorbant试验(ELISA)
培养MG6的小胶质细胞(5×10的密度5细胞与蜂胶(50 /毫升)μg / mL)受到缺氧的室充满气体的混合物含有1% O2,5%的公司2,92%的氮在37°C。MG6小胶质细胞在21% O孵化2,5%的公司2在常氧控制37°C。条件中收集在6、12、24、48小时后上面的孵化,和il - 1的含量β肿瘤坏死因子-α,il - 6小胶质细胞释放测量使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(研发系统)协议后,由制造商提供。450纳米的吸光率是衡量使用标。
2.9。电泳和免疫印迹
MG6小胶质细胞在培养5×10的密度5细胞/毫升,当时的胞质样本收集点15,30和60分钟后缺氧暴露缺氧(1%啊2)。样本在15%或12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳和蛋白质SDS凝胶转移electrophoretically硝化纤维膜。阻塞后,一夜之间,膜被孵化在4°C下温和搅拌与每个主要抗体:鼠标anti-phosphorylated我κBα(1:1000)和兔子anti-IκBα(1:1000)抗体在一夜之间在4°C。洗后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)标记anti-mouse(1: 2000年,贝克曼库尔特)和anti-rabbit(1: 2000年,贝克曼库尔特)抗体2小时24°C,然后使用一个增强化学发光检测系统检测到(艾克装备,Amersham法玛西亚生物技术)和图像分析仪(las - 4010,通用电气医疗保健,乌普萨拉,瑞典)。
2.10。统计分析
数据被表示为±SEM手段。统计分析使用一个单向或双向方差分析(方差分析),事后图基的测试使用GraphPad棱镜软件包。的值被认为是显示统计学意义(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。
3所示。结果
3.1。蜂胶对小胶质细胞的低氧诱导减少生存能力的影响,小胶质细胞低氧诱导Mitochondria-Derived ROS
我们首先研究了MG6的蜂胶对细胞活力的影响使用MTT检测小胶质细胞。平均细胞生存能力没有明显改变治疗后与蜂胶的最终浓度5到50μ克/毫升(图1(一))。另一方面,意思是细胞生存能力与蜂胶治疗后显著降低最终浓度为500毫克/毫升。因此,我们使用蜂胶与50的浓度μg / mL检查其对减少低氧诱导小胶质细胞的生存能力的影响。如图1 (b)低氧暴露(1%啊2,24 h)显著降低平均细胞MG6小胶质细胞的可行性。蜂胶治疗(50μg / mL)显著减少恢复了低氧诱导小胶质细胞的生存能力(图1 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
缺氧驱动小胶质细胞产生活性氧。在我们之前的研究中,线粒体在小胶质被发现是最容易受到氧化损伤(10,26,27]。这些事实促使我们研究低氧诱导的线粒体氧化生成的小胶质细胞使用氧化MitoSOX红探针,线粒体靶向hydroethidine导数(25]。MitoSOX红色氧化的意思是免疫荧光强度显著增加了MG6小胶质细胞缺氧后24 h(数字1 (c)和1 (d))。蜂胶(50μg / mL)显著抑制低氧诱导的平均荧光强度增加MitoSOX红色探针在小胶质细胞(数字1 (c)和1 (d))。这些结果说明蜂胶抑制小胶质细胞的低氧诱导从线粒体ROS生成。
3.2。蜂胶对低氧诱导的促炎细胞因子分泌的小胶质细胞
接下来,蜂胶对低氧诱导小胶质细胞分泌的促炎细胞因子的研究。il - 1β肿瘤坏死因子-αMG6, il - 6分泌的小胶质细胞在低氧暴露后的培养基是由ELISA测定(1%啊2,24小时)。il - 1的平均浓度β肿瘤坏死因子-α,il - 6在小胶质细胞的培养基小胶质细胞显著增加在24 h后缺氧(图2)。蜂胶(50μg / mL)显著抑制低氧诱导il - 1的分泌β肿瘤坏死因子-α,小胶质细胞il - 6(图2)。
(一)
(b)
(c)
3.3。蜂胶对低氧诱导激活NF -κB的小胶质细胞
蜂胶在NF -的影响κB暴露于低氧后激活下一个检查,因为NF -κ调节多种促炎细胞因子的表达,包括il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 6。我的表达κBα磷酸化在MG6小胶质细胞缺氧后显著增加(数据3(一个)和3 (b))。蜂胶(50μg / mL)显著抑制低氧诱导的磷酸化κBα小胶质细胞(数据3(一个)和3 (b))。此外,核易位p65在MG6诱导小胶质细胞缺氧后60分钟(图3 (c))。蜂胶(50μg / mL)显著抑制小胶质细胞的低氧诱导核易位p65(图3 (c))。这些结果说明蜂胶抑制低氧诱导神经炎症反应通过抑制NF -κB在小胶质细胞激活。
(一)
(b)
(c)
3.4。蜂胶对躯体感觉皮质神经炎症反应的小鼠暴露于低氧
最后,蜂胶对小鼠皮质小胶质细胞暴露于低氧暴露。在常氧条件下,皮质小胶质细胞表现出分歧的形态(数字4(一)-4(d))。相比之下,皮质小胶质细胞显示hyperactivated形态,以扩大细胞体与短流程4 h后缺氧常氧条件下24 h(数据恢复4(e) -4(h))。此外,平均细胞数量的皮质小胶质细胞阳性免疫反应性的il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和8-oxo-dG显著增加小鼠缺氧后4 h(数字4(e) -4(h)和4(m) -4(p))。当老鼠长期接受蜂胶(8.33毫克/公斤,2次/天,i.p)缺氧暴露前7天,皮质小胶质细胞的形态特点是小细胞身体长过程,类似于有分枝的小胶质细胞在常氧条件下(数字4(我)4(左))。同时,意味着细胞数量的皮质小胶质细胞呈阳性il - 1的免疫反应性β肿瘤坏死因子-α、il - 6和8-oxo-dG显著降低(数字4(我)4(左)4(m) -4(p))。然而,PBS的预处理(控制)并没有显示出抑制il - 1的激活形态和免疫反应性β肿瘤坏死因子-α、il - 6和8-oxo-dG小胶质细胞的缺氧暴露小鼠(数据未显示)。
4所示。讨论
本研究的主要发现是,蜂胶显著抑制NF -的低氧诱导激活κB-dependent小胶质细胞的神经炎症通路。NF -κB是一个转录因子促炎细胞因子的编码基因,包括il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6 (28]。它也知道NF -κB激活了条件增加细胞内氧化还原状态(29日]。在目前的研究中,平均荧光强度MitoSOX红探针,mitochondria-derived ROS生成的标记,被发现后小胶质细胞缺氧显著增加。此外,8-oxo-dG表达的增加,氧化受损DNA的生物标记(30.观察),主要在胞质小胶质细胞缺氧后,表明DNA受损的线粒体起源。我们曾发现活性氧破坏线粒体DNA和受损的线粒体DNA,反过来,损害呼吸链,形成一个恶性循环,促进活性氧生成(10]。综上所述,线粒体DNA损伤缺氧后被认为是一个主要的诱发因素的活性氧产量的增加,激活了NF -κB-dependent神经炎症通路。因此,蜂胶可以保护对低氧诱导的线粒体DNA氧化应激在其抗氧化性能(非独立18,19,31日]。
中风是最常见的hypoxia-ischemic脑损伤和仍然是一个主要挑战公共卫生由于其高发病率和危及生命的本质32]。在西方世界,超过70%的人患中风是超过65岁。由于预期寿命持续增长,患者中风的绝对数量在未来将进一步增加(33]。氧化应激和neuroninflammation称为两个重要的病理生理机制在hypoxia-ischemic脑损伤(33),因为老鼠缺乏NF -的p50亚基κB开发小得多的梗塞后瞬态局部缺血(34)和抗氧化剂减少梗死体积和提高行为赤字(35]。更多的证据进一步探讨小胶质细胞在卒中进展的关键作用,因为实验和后期研究揭示的存在活化的小胶质细胞在中风患者的大脑36,37),小胶质细胞被澄清为主要的细胞群,导致NF -κB-dependent upregulation促炎的分子,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β在中风。因此,蜂胶有效地减弱NF -的低氧诱导激活κB-dependent小胶质细胞和神经炎症途径可能在中风的预防和治疗是有益的,因为小胶质细胞激活的封锁阻止hypoxia-ischemic脑损伤(38]。
最近,已经受到了人们足够的重视与认知障碍协会缺氧。众所周知,缺氧痛苦登山者有明显较贫穷的记忆和浓度,和缺氧的影响持续时间显著回国后高度(39,40]。此外,我们曾发现,健康的人生活在高海拔在远足与认知缺陷(41]。类似的记忆下降引起的短暂缺氧暴露据报道在实验动物42]。脑氧含量在很大程度上依赖于脑血流量(43,44与(老化),下降44]。此外,脑血流量下降了20%的广告比同龄nondemented对照组(45]。老年人认知功能障碍脑氧含量较低的显示比那些正常水平(46]。因此,慢性缺氧可能导致认知能力衰退的老化和体内神经退行性疾病,如广告(47,48]。最近,我们报道,夸大了神经炎症反应引起的小胶质细胞与海马的损伤(LTP),长期电位化细胞记忆和学习的基础,因为二甲胺四环素,已知的小胶质激活抑制剂,显著提高系统性inflammation-induced障碍LTP的中年动物(49]。因此,它是合理的考虑,蜂胶有效对抗低氧诱导NF -κB-dependent小胶质细胞和神经炎症通路可能是有益的在预防神经退行性实行病种认知赤字。
生活在高海拔地区的人们每天暴露于低氧。我们初步的人类在高海拔地区进行的实验表明血液中促炎介质的平均水平的propolis-treated老年人组显著低于参与组。此外,propolis-treated老人组显示明显的认知测试得分高于老年人参与组(未发表的数据),这表明蜂胶也可能有助于防止老龄化带来的认知缺陷。
5。结论
目前的研究提供了第一手的证据的潜在保护蜂胶对低氧诱导神经炎症反应的影响。保护作用可能包括减少氧化应激和NF -κ在小胶质细胞B-dependent通路。从而使它有利于缺氧/ ischemia-induced认知缺陷的预防和治疗。我们正在进行的调查是明确个人的协同和添加剂的影响在anti-neuroinflammation蜂胶组件。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
这项工作是支持的山田吴z(没有研究资助。0124)。