文摘

早产儿(PT)尤其暴露于氧化应激(OS),和blood-sparing标记,血红蛋白(MDA-Hb)丙二醛加合物,可能是有用的准确评估OS-related新生儿发病率。在未来的研究中,MDA-Hb浓度在两组PT评估,有和没有严重的新生儿发病率估计的严重的发病率(ISM)的综合指数。所有PT出生在一个三级护理NICU (32周,出生体重包括g)连续。MDA-Hb和血谷胱甘肽(GSH)含量测定的液相色谱-光谱法在生命的前6周。线性回归和多级模型拟合研究MDA-Hb或谷胱甘肽和供应管理协会(ISM)之间的关系。83年的PT(平均数±标准差:周,g),呈现严重的新生儿发病率21%。在多变量模型中,MDA-Hb ISM +组浓度明显高于在ISM -集团在生命的最初6周()。谷胱甘肽浓度之间的观察组无显著差异()。MDA-Hb是对评估氧化应激的标记在PT和可能有助于评估策略来改善围产期结局的影响。

1。介绍

极低出生体重(出生时婴儿礼物一个prooxidant和抗氧化系统失衡1- - - - - -3),它们在高应激- (OS)相关伤害的风险。抗氧化酶在妊娠后期,成熟和母胎传输的抗氧化分子α-生育酚和抗坏血酸在早产新生儿不完整(4]。然而,这些婴儿也常常需要氧气疗法和肠外营养。虽然肠外营养的解决方案包含抗氧化剂分子像维生素A、C和E,它们还含有多不饱和脂肪酸过氧化反应特别敏感,而产生有毒副产品的活性氧5,6]。这些解决方案取决于他们组成的脂质过氧化反应和增加曝光7- - - - - -9]。脂质过氧化作用之间的关系被建议和一些常见的早产的发病率,包括支气管肺的发育不良(桶),早产儿视网膜病变,室旁脑栓塞,坏死性小肠结肠炎(NEC) (10- - - - - -13]。然而,研究表明差异,因为不同的过氧化反应评估。丙二醛(MDA)是研究最多的多不饱和脂肪酸过氧化的产物,但是大多数化验的基础上开发的衍生化硫代巴比土酸(稍后通知),而可怜的特异性(14,15]。其他方法,如液相色谱结合质谱分析,提出了改善MDA评估(16,17]。我们最近验证一个新的敏感和特定的方法来测量MDA与血红蛋白加合物(MDA-Hb)在新生儿18]。这种方法将有利于系统评价在几周或几个月MDA-Hb稳定性的基础上,为消除取决于红细胞的寿命(19]。MDA-Hb以红细胞,避免额外的血液掠夺,这使得该方法适合出生婴儿。

这个试点研究试图确定血MDA-Hb浓度之间的关系和新生儿发病率出生婴儿。第二个目标是评估的影响围产期条件MDA-Hb浓度。

2。方法

2.1。人口

所有PT出生胎龄(GA) 24 - 31周,出生体重(BW)低于1500 g,并承认在生命的最初6个小时我们的三级护理新生儿加护病房在克罗伊Rousse大学医院,里昂,法国,连续参加了这个前瞻性研究。婴儿主要先天性异常(包括心脏、神经、肾脏和消化系统畸形)或代谢疾病,和那些需要手术,被排除在外。这项研究是完全集成到常规治疗的PT住院单位。没有额外的血液抽样需要在目前的研究中,呼吸和营养保健的协议并没有改变在研究过程中。国际营养建议对所有婴儿随访。所有的父母都签署知情同意的形式。伦理委员会批准的这项研究是大学医院中心的里昂,法国(CPP里昂Sud IV)。

2.2。研究设计

患者包括出生时和生命的研究持续了前6周或婴儿转移/死亡。一个人收集的临床资料(c . Cipierre)。我们前瞻性记录变量关于产前环境四类:胎儿生长受限(FGR)(估计胎儿体重<第十百分位),子痫前期(特点是高血压和蛋白尿)涉嫌孕产妇产前感染(阳性血培养,孕妇发烧≥38.5°C, C反应蛋白> 20 mg / L),和其他原因(子宫出血、胎盘异常)。出生时我们也收集数据:GA, BW,阿普加分数在5分钟,需要特定的密集的复苏(插管,胸部压缩,或复苏药物)。婴儿被视为增长限制在BW <−2 SD [20.]。我们还收集的数据关于呼吸道护理(辅助通风、氧气供应和表面活性剂),血液动力学(血管活性的胺,布洛芬政府),营养(全静脉供应),住院期间和并发症(早发性败血症,晚发型败血症,桶,NEC,脑室出血、脑栓塞和室旁)。

严重的发病率的综合指数(ISM)被认为是目前(ISM +)在生命的前6周时患者严重呼吸道,神经、消化发病率。上证综合指数严重的发病率(ISM)被认为是当至少一个的三个障碍。严重呼吸道发病率被定义的存在至少有下列之一:氧依赖性在36周postconceptional年龄或辅助通风时间>中值+ 2 SD与通风的平均持续时间在同一人口GA婴儿住院服务在2005年和2007年之间(109婴儿出生在佐治亚州< 28周:中值= 249小时(IC 95%: 288 - 417)和202婴儿出生在佐治亚州≥28周:中值= 321小时(IC 95%: 57 - 844))(个人资料)。严重的神经系统发病率被定义为至少一个的存在以下异常:严重脑室出血(3或4级)或脑栓塞室周的。严重的消化发病率被定义为NEC 3或4级(21]。

2.3。氧化应激指标的测量

MDA-Hb和减少谷胱甘肽(GSH),一个关键的抗氧化剂,每周测量一次前6周的生活,它不需要额外的血液样本。我们假设从血常规红细胞剩余样本为MDA-Hb评估电解质的决心就足够了。

在出生和MDA-Hb谷胱甘肽浓度当时评估新生儿入院的单位,也就是说,在第一个小时的生活与生俱来的婴儿在生命的最初6个小时之前outborn婴儿。

所有样本存储在−80°C到分析。这些标记是衡量一个独特的实验室,如前所述[18]。

测量MDA-Hb的过程包括三个步骤:隔离Hb和delipidation避免任何artifactual脂质过氧化反应,水解和衍生化的加合物,然后加合物的测量。总之,第一次离心后,红血球(1卷)与四卷的生理盐水洗两次(9 g / 1000毫升),离心机(5分钟,1000克)。150年μL resuspended红细胞表面清洗和包装的蒸馏水(450μL)和冻干−80°C 5分钟然后融化在热水(水下30秒60°C)。之后的第二个周期冻结drying-thawing, Hb离心获得的解决方案是在8000 G 4分钟;一个整除是用来测量Hb浓度和另一个整除(200μ与100年L)迅速delipidated通过混合μL Folch试剂(甲醇/氯仿,1 vol. / 2卷)。并在13000 G离心5分钟。delipidated Hb的最高阶段是储存在−80°C到分析。原始的方法derivatize原生质的MDA与diaminonaphthalene(丹)曾描述(22]。初步实验表明,减少吸附的diazepinium (MDA和丹)之间形成Hb,衍生化必须在盐水中完成。的量化是由质dideurated内部标准;MDA的衍生品和dideuterated MDA被检测到米/z195.2和197.2,分别描述了Steghens et al。16]。MDA的加合物在nanomol Hb表达每克Hb (nanomol / g Hb)。

谷胱甘肽评估中,我们使用全血(25μl)保持的守卫针静脉穿刺的末尾。如[23衍生化后,谷胱甘肽测定N-ethylmaleimide(NEM)来避免任何artifactual生产氧化谷胱甘肽(GSSG)由于蛋白质酸性降水。谷胱甘肽的方法测量,但是有的歧视GSNEM检测m / z= 433.7保留时间为2.9分钟,GSSG检测m / z= 614.1的保留时间为4.4分钟。微摩尔每升(表达的结果μmol / L)的全血。

考虑输血的可能的贡献,我们测量了MDA-Hb和全血谷胱甘肽浓度在五个随机选择了红细胞在早产儿使用包含在我们的研究中。

2.4。统计分析

所有收集到的变量是研究人口和描述在两组中定义的结果。分类变量表示为数字和百分比,和连续变量值和极值。百分比比较使用Fisher精确检验,和中位数比较使用Wilcoxon测试。差异被认为是重要的P值< 5%。我们比较MDA-Hb和出生时谷胱甘肽的浓度两个主义团体(缺席/礼物)对四个产前上下文先前描述。线性回归拟合研究MDA-Hb之间的关系和ISM(缺席/礼物)在生命的前6周。因为MDA-Hb措施每周重复在每个婴儿,多级模型与随机效应,或弱点,用于占措施之间的相关性在同一个婴儿由于未被注意的因素。MDA-Hb值对数转换正常分布。研究重复MDA-Hb测量的趋势随着时间的推移,时间在周被引入作为连续变量除了ISM模型。类似的模型适合谷胱甘肽。分析使用R软件(R发展核心团队;接待员:一种语言环境和统计计算,维也纳:R基金会,2008年)和SPSS 15.0版软件(统计产品与服务解决方案15.0;美国SPSS公司,芝加哥,IL)。

3所示。结果

83年2月至2009年7月,出生婴儿连续登记在这项研究中,40%的人非常不成熟(GA≤28周内)。17人(21%)提出了一个综合指数严重的发病率(ISM +),其中3次婴儿死亡。第一个4天后死于感染性休克。两人死于严重神经系统并发症(艾滋病毒第四阶段、状态)2,10天后的生活。

正如所料,婴儿的特点严重新生儿发病率(ISM +)明显不同于婴儿没有发病率(ISM−)(表1)。ISM +集团由更多的成熟和可靠的儿童辅助通风,氧气供应,肠外营养更长时间比在ISM−组。他们也更频繁地提出了动脉导管未闭要求布洛芬和晚发型败血症,他们收到了更多的输血:14 17婴儿的ISM +组至少有一个输血,和10的收到了超过2输血。出生后的中值年龄第一次和第二次输血,分别为ISM +组7和12天,7和13天的ISM−组。产前因素之间没有显著差异ISM +和ISM−组。

根据产前MDA-Hb出生时浓度不同上下文(图1)。浓度明显高于MDA-Hb观察在婴儿与孕产妇产前感染与婴幼儿感染()。出生时相反,谷胱甘肽浓度相似不管产前环境(与怀疑的孕产妇产前感染婴儿和婴儿没有相比,)。

MDA-Hb浓度在出生在ISM +组显著高于在ISM−组,但谷胱甘肽浓度两组相似(表2)。最大MDA-Hb价值ISM−集团与只有一个婴儿,它可以被认为是一个异类。这是一个新生儿出生在30周后通过剖腹产9 h罗与低能的母亲PCR(30毫克/升)。没有新生儿感染。

此后,在生命的最初6周,这些标记明显的浓度不同ISM +和ISM−组(图2)。MDA-Hb浓度显著高于中位数ISM +集团在此期间(),在6周,他们在ISM +高出近三倍(25.5 nanomol / g Hb)比在ISM−(9.3 nanomol / g Hb) ()。相反,无显著差异之间的谷胱甘肽浓度观察组在生命的前6周()(图2)。

的增量MDA-Hb可以关联到高胆红素血或光疗,我们调整存在与否光疗和最大血清胆红素浓度,使用多变量分析。MDA-Hb仍具有统计学意义的差异(分别地。和)。

MDA-Hb和全血谷胱甘肽浓度中位数5红色细胞,分别8.4 nanomol / g Hb - 1568μM / L。

4所示。讨论

据我们所知,这是第一个报告在新生儿丙二醛与血红蛋白加合物(MDA-Hb),操作系统的一个标志以红细胞,也就是说,不需要额外的血液样本。我们观察到MDA-Hb浓度是影响临床背景下,研究与MDA中描述(11]。

发表资料背景水平的人类MDA-Hb稀缺。Kautiainen et al。24)评估MDA-Hb浓度在一个健康的成年老鼠。他们报道较低的值(0.2和3.8 nanomol / g Hb)不与我们,因为他们使用了截然不同的和复杂的方法:使用4毫升样品体积,最后测量3哦公关Val得到与硼氢化钠还原后(NaBH4),透析,球蛋白沉淀,与PFPITC衍生化,与链霉蛋白酶和胰蛋白酶蛋白质水解,最后Dowex色谱法。这不是可用在人类新生儿(血容量、复杂的分析)。此外,这些价值观得到一小部分科目(1成人和一些老鼠)值相比,不能获得大量的新生婴儿。

为目的的监测、Hb可以首选DNA因其增速甚至寿命和更灵巧的加合物的化学识别。特别是,约半数居住的加合物氨基端缬氨酸在Hb大约是6天25];因此,它是可能的,这种类型的加合物可能积聚在新生儿的血。

目前的研究也有一些局限性,需要解决。首先,这是我们的严重病态的综合指数的定义。严重病态的综合指数包括几种类型的新生儿发病率随着时间不同的课程。例如,呼吸道发病率在几周发展,而NEC的发病是非常快速。我们的全球方法可能被视为精确比如果我们单独考虑每种类型的发病率,但全球对我们的研究方法是至关重要的因为我们的目标是包括所有的情况下携带重要的发病率。尽管患者的数量不是很大,人口相当均匀,代表人口的PT 24 - 31周。此外,人口足以揭示关系的操作系统和产前上下文和新生儿发病率。在我们的人口,我们发现最大MDA-Hb价值在一个婴儿的控制(ISM−)组。它可以被认为是一个异类。它也可能是一个假阳性结果。 There was no neonatal infection. We do not have any explanation for that high value。然而,当我们旨在评估MDA-Hb是否可以作为氧化应激的标记早产儿人口,我们不能期望100%的特异性。

我们的人口代表了四类早产的病因:孕产妇产前感染,子痫前期,胎儿生长受限(FGR),和其他原因(子宫出血、胎盘异常)。前三个与炎症有关,这是会影响氧化还原平衡(26]。出生时我们发现明显MDA-Hb最高浓度在孕产妇产前感染的病例,其特点是由蜕膜炎性细胞因子的释放,胎膜,导致早产和自由基和活性氧的生成在胎儿和产妇流通27]。相比之下,谷胱甘肽浓度在出生时相似不管产前环境和类似于健康成人(谷胱甘肽浓度23]。较低的谷胱甘肽浓度观察出生婴儿足月的婴儿相比(28),但谷胱甘肽在出生时没有被研究出生婴儿与围产期的背景下,我们的知识。

各种基本和临床数据突显了操作系统的核心作用在当前早产新生儿疾病相关的生理病理学(29日- - - - - -33]。因此,更高浓度的氧化剂标记将病情加重婴儿,我们的确发现MDA-Hb之间的关联,脂质过氧化反应的一个索引,新生儿发病率。这一发现同意之前发现使用其他氧化标记(1,29日,30.,34]。

MDA-Hb浓度在出生时可能有用的识别高危新生儿严重的发病率,我们发现高值在ISM +组比ISM−组。这很符合最近发表的结果Perrone et al。35),报告的水平明显高于氧化剂标记在早产婴儿的脐带血与NEC在早产儿NEC (29日,34- - - - - -36]。高MDA-Hb浓度被发现在ISM +集团不仅在第一次产后一周,经常描述(29日,34,37),而且在生命的前6周。

操作系统坚持至少一个月的证据强烈建议抗氧化剂和oxidant-generating系统之间的长期失衡,导致氧化损伤在早产儿。

全血谷胱甘肽的耗竭是发生在早产儿,与谷胱甘肽与孕龄38,39]。因此,谷胱甘肽浓度应该是较低的不成熟的婴儿(ISM +集团)比在ISM−组。事实并非如此,这表明没有一个明确的谷胱甘肽浓度和严重的新生儿发病率之间的关系。两种解释为我们发现可能的小尺寸的影响研究人口和输血(更频繁的在ISM +集团)。然而,我们应注意,谷胱甘肽浓度在ISM +和ISM−组类似的健康成年人,以Steghens et al。使用相同的剂量方法(23]。很少有研究报道减少谷胱甘肽测定,其中大部分研究有关新生儿的脐带血样本还没有接触到真正的操作系统,而早产儿健康足月的婴儿。据我们所知,本研究首次评估之间的关系严重的发病率在早产儿出生和超过6周的年龄和谷胱甘肽浓度。

研究出生几天后,执行较低的谷胱甘肽浓度从气管吸入物(在红细胞和细胞)在早产儿呼吸窘迫综合症(39,40]。在目前的研究中,没有区别在ISM +谷胱甘肽浓度和ISM−团体在生命的前6周。最低浓度的谷胱甘肽在ISM +组观察MDA-Hb峰值的时候,在生命的第二周。这可以解释为抗氧化系统的异常在ISM +婴儿,那些暴露于高水平的操作系统相关的过度消费和/或减少谷胱甘肽合成的能力由于肝不成熟或半胱氨酸的赤字,谷胱甘肽合成的主要酸胺调节器(41- - - - - -43]。

婴儿在ISM +组有更多的输血,这可能影响了MDA-Hb,谷胱甘肽浓度。例如,MDA-Hb浓度可能是低估了由于输血的影响。这将解释MDA-Hb减少生命的第三周在ISM +组。此外,MDA-Hb随着时间的累积效应也可能受到影响。另一方面,这个集团的谷胱甘肽浓度可能被高估了,但是对于我们的谷胱甘肽结果还无法得出任何结论,但没有区分团体仍然有趣的从临床的角度。估计输血的影响,我们不得不衡量MDA和五个随机选择的包装红细胞谷胱甘肽浓度用于早产儿包含在我们的研究中。包装MDA-Hb和全血谷胱甘肽浓度红细胞既不低也不高。当他们接近以健康足月新生儿出生时(18),输血的贡献MDA-Hb和早产儿的谷胱甘肽水平是不可能的。

看来在ISM +操作系统级别组氧自由基产生,反映的MDA血红蛋白加合物,超过了抗氧化防御系统。强有力的证据支持/抗氧化失衡引发了很多问题的介入操作系统在新生儿并发症的生理病理学,没有能够建立一个因果关系。

总之,目前的研究的第一步是验证技术来评估产后操作系统而不需要额外的血液抽样。MDA-Hb浓度越高的病情加重婴儿表明MDA-Hb标记感兴趣的估算和量化OS出生婴儿。这种非侵入性方法可能有助于增强我们对操作系统的理解,从而提高修改治疗的准确性(辅助通风,氧气疗法,和肠外营养),以减少自由基生成和为未来发展提供指南的应用抗氧化剂治疗早产儿。尽管这些发现需要确认在一个更大的人口,我们的研究结果提供了洞察MDA-Hb和新生儿发病率之间的关系。

缩写

桶:	支气管肺的发育不良
BW:	出生体重
供应管理协会(ISM):	指数严重的发病率
丹:	Diaminonaphthalene
FGR:	胎儿生长受限
遗传算法:	孕龄
谷胱甘肽:	减少谷胱甘肽
Hb:	血红蛋白
质:	液相色谱-光谱法
MDA:	丙二醛
MDA-Hb:	丙二醛与血红蛋白加合物
NEC公司:	坏死性小肠结肠炎
操作系统:	氧化应激
PT:	早产儿
加拿大皇家银行:	红细胞
ROS:	活性氧
出生时:	极低出生体重。

确认

作者感谢林人,Blandine Vallet-Sandre为他们帮助收集样本;克里斯汀•Delore凯瑟琳Castrichini,和苏菲Vasseur帮助处理分析;和c Carmeni进行编辑。