文摘
氧化应激可能发挥核心作用在许多疾病的发生在新生儿期。丙二醛(MDA)是一种脂质过氧化作用的标志。本研究的目的是评估一个新的标志,血红蛋白(MDA-Hb)丙二醛加合物,这是测量红细胞(红血球),因此不需要额外的血液样本。在这个前瞻性研究中,我们第一次改编Hb解决方案描述的测量方法之前获得红细胞表面清洗,然后评估方法是否适合新生儿使用。MDA-Hb浓度被液体色谱-光谱法测量。我们比较的浓度MDA-Hb早产和新生儿。红细胞从60健康新生儿在出生时收集的样本(足月29日和31日早产),以及来自50个早产新生儿没有产后并发症的进化在生命的最初几个月。我们找到了一个明显高于MDA-Hb早产儿出生时浓度()。在生命的最初几个月,MDA-Hb 9.4 nanomol / g Hb浓度在早产儿住院。MDA-Hb可以用来评估早产儿氧化应激。结合临床变量,它可以是一个有用的标记在这些高风险患者氧化应激博览会。
1。介绍
越来越多的证据表明氧化应激之间的不平衡(OS)和抗氧化防御机制中起着重要的作用在许多疾病的发生新生儿期(1,2]。出生与一个强大的操作系统与相对缺氧子宫内环境的快速变化,子宫外环境(5倍增加肺泡PO2)和一些生理过程交付3,4]。这些变化和过程大大增加自由基的生产,必须控制的抗氧化防御系统已经成熟的妊娠期(5,6]。
自由基是太短暂而不能直接在临床系统检测到,但氧自由基和脂质产生脂质过氧化反应产品,当测量作为间接的生物标志物在活的有机体内氧化应激状态及相关疾病。在这些产品中,丙二醛(MDA)的一个主要研究最多和低分子量终端产品。强烈的细胞毒性的蛋白质或核酸结合的能力非常快(7]。
硫代巴比土酸活性物质的方法(TBAR测试)经常被用来评估MDA浓度,但它缺乏特异性醛以外的MDA(甲醛、乙醛等)和非脂类物质与硫代巴比土酸反应(8,9]。前特定衍生化液相色谱等分析技术与紫外线或质谱检测提出了更精确地测量MDA (10]。应该注意的是,所有这些技术反映措施只有在一个特定的时刻,虽然过氧化反应会随着时间变化而波动。
决定蛋白加合物,尤其是Hb,已被证明是一个有用的方法来监测在活的有机体内暴露于基因毒性化合物(11]。加合物是形成低分子化合物结合生物分子(11]。Hb加合物是稳定的产品来自亲电反应的化合物,通过共价连接,涉及生物分子亲核中心为亲电的采样和分析提供可能性,短暂的化合物(12]。
的决心MDA-Hb得到一个非常复杂的方法已经被提出评估暴露于脂质过氧化产品(13]。在健康成年人,MDA-Hb值0.01到10 nanomol / g Hb报道(14]。此外,这些研究中使用的方法极其敏感,足以探测MDA的水平的变化加合物引起的脂质过氧化反应,与剂量之间的直接关系和影响15]。
MDA-Hb测量可以提供评估系统在新生儿中项,因为(i)之间的稳定的共价连接MDA和Hb和(2)MDA-Hb消除,这是依赖于相对明确的红细胞的寿命(120天成人,更短的新生儿)(16]。我们测试我们是否能够确定MDA-Hb新生儿采取更多的血液,因为这是一个至关重要的问题在极低出生体重新生儿(出生)。我们假设从血常规红细胞剩余样本为电解质的决心就足够了。
我们因此在新生儿MDA-Hb测量的可行性进行评估,试图建立正常MDA-Hb范围健康足月新生儿出生时和简单的早产新生儿在出生和生活的第一个月。
2。方法
2.1。研究人群
评估MDA-Hb出生时,新生儿出生在克罗伊的产科病房Rousse大学医院,里昂,法国连续参加2009年2月到5月之间。他们分为两组根据孕龄(GA)。在第一组中,入选标准是:健康的新生儿出生后足月妊娠(≥37周),顺产没有并发症,并呈现良好的适应子宫外的生活(没有复苏,没有证据表明围产期缺氧,或呼吸窘迫),出生体重(BW)适合遗传算法(17在出生时,正常的临床检查。在第二组,入选标准:早产新生儿(几个星期)不需要重症监护(没有插管,没有胸部压缩,或复苏药物),氧气疗法,或任何类型的药物。排除标准如下:需要复苏,围产期缺氧的证据(在脐带血,5分钟阿普加分数)或呼吸窘迫,先天性畸形,败血症和小GA (17),和多个妊娠。测量MDA-Hb出生时进行29个足月,31过早的新生儿。
测量MDA-Hb在生命的最初几个月,我们从简单的早产新生儿收集血液样本,也就是说,没有辅助通风,肠外营养、输血、或抗炎治疗前五天内血液采样。我们记录了BW, GA、性别和出生后的年龄在样本收集。测量MDA-Hb在生命的前8周进行50简单早产新生儿之前定义。
这项研究是完全集成到足月的日常保健和早产新生儿有不需要补充血液采样。所有的父母都签署知情同意的形式。伦理委员会批准的这项研究是大学医院中心的里昂,法国,(CPP里昂Sud IV)。
2.2。测定MDA-Hb
2.2.1。收集的样本
评估所需的MDA-Hb红细胞的集合。出生的时候,动脉脐带血(5毫升)收集从足月和早产新生儿满足入选标准。脐带血的pH值是系统地评估在我们医院出生,血液样本的目的我们的研究也获得了。
住院期间满足入选标准的早产儿,红细胞样本收集同时作为常规的静脉血液采样通常需要评估在这些新生儿血清电解质。按照常规程序,血清和红细胞被离心分离(10分钟,4000 G)在医院生物化学实验室。管被立即冷藏在4°C到样本的准备。
2.2.2。试剂
Malondialdehyde-bis-dimethylacetal (tetramethoxypropane TMP) 99%纯度和偏磷酸买来σ-奥尔德里奇化学GmbH (Steinheim,德国)。Dideuterated tetraethoxypropane是从CDN同位素(Pointe-Claire里柯克街88、QC、加拿大)。2,3-Diaminonaphthalene从TCI(丹)获得。无水磷酸二氢钾(Suprapur),乙醇,甲醇,乙腈梯度年级来自默克(达姆施塔特,德国)。所有其他化学物质和溶剂均为分析纯。水解决方案是用纯净水(电导率MΩ),Elga纯实验室选项(Elga、法国)。
标准储备溶液获得的TMP 608海里的七个连续稀释TMP(1/10):在乙醇三次然后在乙醇/水三次(40/60,v / v)与NH最后在水中4哦90毫米最终浓度。
整除的这个解决方案是稳定的氮在−3个月20°C在黑暗中。二级MDA标准(76、152和304海里)被稀释在水里准备日常标准的股票的解决方案。
2.2.3。材料
质进行分析是一个安捷伦LC与安捷伦1100系列色谱仪LC-MSD SL单四极探测器。色谱流动相是醋酸铵5更易/ L,调整pH值1.8与甲酸含有15% (v / v)的methanol-acetonitrile(1: 1)混合。Derivatized样品和标准(10μL)被注入Uptishere HDO C18 (3μ米颗粒大小)列(Interchim、Montlucon、法国)。流量为0.23毫升/分钟的列柱温箱保持在50°C。
进行了量化dideuterated MDA (d2-MDA)内部标准,MDA的衍生品和d2-MDA ESI中发现积极的模式在米/z分别为195.2和197.2。
2.2.4。方法
测量MDA-Hb的过程包括三个步骤:(我)隔离Hb和delipidation为了避免任何artifactual脂质过氧化作用,(2)水解和衍生的MDA与丹加合物形成diazepinium复杂,(3)然后由质diazepinium的量化。
第一次离心后,红血球(200μL)与四卷的生理盐水洗两次(9 g / 1000毫升),和离心机(5分钟,1000克)。150年μL红细胞表面的清洗和包装resuspended蒸馏水(450μL)和冻干−80°C 5分钟然后融化在热水(水下30秒60°C)。之后的第二个周期冻结drying-thawing, Hb离心获得的解决方案是在8000 G 4分钟;一个整除是用来测量Hb浓度和另一个整除(200μ与100年L)迅速delipidated通过混合μL Folch试剂(甲醇/氯仿,1 vol. / 2卷)。并在13000 G离心5分钟。delipidated Hb的最高阶段是水解和derivatized丹或储存在−20°C到分析。
水解和衍生,免费修改描述从原始方法和原生质的MDA,根据表进行1。初步实验表明,减少吸附的diazepinium (MDA和丹)之间形成Hb,衍生化必须做在氯化钠(60 g / L)。
MDA的加合物在nanomol Hb表达每克Hb (nanomol / g Hb)。
2.2.5。再现性的样本处理
红细胞表面样品处理(清洗、溶血和delipidation)检查在两个系列的测量四个和六个样品,分别。每个样品加工四到五次,这取决于可用的样本体积。
2.2.6款。处理样品的稳定性
24个样本充分准备、整除和储存在−20°C检查处理样品的稳定性。分析了整除后7、20和32天的存储。
2.3。统计分析
分类变量表示为数字和百分比,而连续变量表示为中位数和范围。所有变量描述整个人口和每组:足月(≥37周)和早产新生儿(< 37周)。我们比较的特点(GA、BW和性别)的足月和早产儿。分类变量比较使用测试,并与Mann-Whitney MDA-Hb浓度比较测试。MDA-Hb浓度之间的相关系数和GA, BW和性别与斯皮尔曼测试测试。所有的测试被认为是重要的值小于5%。分析使用SPSS 15.0版(统计产品与服务解决方案15.0;SPSS Inc .)、美国芝加哥,Il)。
3所示。结果
3.1。衍生化条件的优化
的主要修改样品衍生化,根据表完成1是,使用的试剂都是准备在氯化钠(60 g / L)的吸附减少形成diazepinium Hb。
3.2。质分离和可重复性
图1显示了一个典型的色谱MDA的加合物作为diazepinium来衡量米/z195.2和相应的内部标准米/z197.2。该方法被发现线性1000海里。十的重复性连续注射相同的样本比95%(个人资料)。
3.3。再现性的样本处理
即使众所周知,红细胞表面处理包装是很棘手的,没想到,第一个实验表明,最终结果的变化本质上来自样品处理。优化和一个良好的实践后,变异系数(CV)样品处理评价Hb delipidated测量样品(两个系列6和4样品分别地。每四次测量)低于5%,除了一个样本(简历= 5.98%)。
3.4。处理样品的稳定性
图2显示24加工样品的稳定性、整除和储存在−20°C至少一个月。整除分析天0 7后,20,32天的存储。
3.5。测量MDA-Hb
研究人口的特点提出了在桌子上2。出生时MDA-Hb浓度明显高于在早产儿(8.8nanomol / g比足月新生儿(4.6 Hb)nanomol / g Hb) ()(图3)。
MDA-Hb值在早产儿住院收集(32.3以适当的GA和BW(1495周)g)和测量进行产后12岁天(图4)。在生命的前8周,50个样本分析50简单的早产儿(每个早产新生儿只有一个样本)之前定义。MDA-Hb浓度分别为9.4nanomol / g Hb。之间不存在相关性BW或病人性别和MDA-Hb浓度。
出生时,GA明显与MDA-Hb浓度呈负相关。
4所示。讨论
我们报告一个方便的方法来确定MDA加合物的浓度在新生儿乙肝,足够灵敏检测低浓度的MDA-Hb和特定足以评估脂质过氧化作用。
评估MDA-Hb方法是可靠和有效的适应方法(10)用来评估肠外营养成分对脂质过氧化的影响(18- - - - - -20.]。MDA-Hb质是用一个非常具体的方法基于diaminonaphthalene衍生化(10]。该方法的优点是它的高灵敏度和特异性,依赖于丹的使用。当反应与MDA,丹形成diazepinium质量194道尔顿高于本地MDA(72道尔顿)使其检测容易,因为一种改进的关联为反相柱和更高的质量以外的背景噪音。这种高灵敏度的直接后果是低体积测量所需的样本(只有200μL)。这是特别有趣的新生儿护理。典型intra-assay可变性是好的(5%)、观察和良好的重现性。尽管这种新方法要求严格的样品制备和测量条件和可能导致构件的形成,它的优势是相对简单的,这对于临床实践是很重要的。因此我们的研究结果表明,这个方法是有用的,敏感的,具体分析新生儿的脂质过氧化作用。
此外,这个试验有几个优点从临床的角度来看,最重要的是简单的收集血液(红细胞)的一个组成部分,也就是说,通常被丢弃后血清电解质评估已从常规血液样本。Hb的寿命相对较长,控制是一个重要原因选择这种蛋白质的剂量监测以电解活性化合物。Hb预定寿命等于红细胞。MDA-Hb可以是一个长期的氧化应激指标。此外,由于蛋白质如Hb在血液中存在更大的数量,测量蛋白加合物有利于高容量的检测(11]。
我们观察到的方法测量Hb加合物敏感地检测MDA-Hb浓度的变化在不同气体在出生时。正如预期的那样,我们观察到显著提高早产儿比足月新生儿MDA-Hb水平。事实上,增加氧化应激在早产儿出生被描述使用其他氧化应激标记(4,6,21,22]。
基于这些初步结果,看来这个标记可能是有用的在各种病理条件下,如出生新生儿,应验证,因此,其临床意义更大的人口。是非侵入性检测脂质过氧化在早产新生儿护理尤为重要。一种非侵入性技术将成为一个伟大的援助在改善这些患者的氧化应激和评估未来的知识改善新生儿护理(辅助通风,氧气疗法,和肠外营养)活性氧相关疾病。
总之,我们的结果表明,在活的有机体内评估新生儿的MDA-Hb可行,blood-sparing,和简单的方法来确定氧化应激,特别是早产儿。
缩写
| BW: | 出生体重 |
| 丹: | Diaminonaphthalene |
| 遗传算法: | 孕龄 |
| Hb: | 血红蛋白 |
| 质: | 液相色谱-光谱法 |
| MDA: | 丙二醛 |
| MDA-Hb: | 丙二醛与血红蛋白加合物 |
| 红细胞表面: | 红细胞 |
| ROS: | 活性氧 |
| TMP: | Tetramethoxypropane |
| 操作系统: | 氧化应激 |
| 出生时: | 极低出生体重。 |
确认
作者感谢林人,Blandine Vallet-Sandre帮助收集样本,克里斯汀•Delore凯瑟琳Castrichini,和苏菲Vasseur帮助处理样本分析,和c Carmeni进行编辑。