文摘
红花黄色(SY)是红花提取物和中药之一。当前工作的目的是探讨SY对脊髓缺血再灌注损伤的影响(SCIRI)兔子。脊髓缺血再灌注模型(SI / R)构造,和post-ischemic损伤程度的评估通过的神经功能缺损评分和血浆脂质过氧化水平reactioin和神经元形态学变化。SCIRI显著影响的功能活动后肢和活性脂质过氧化反应。SY可以减弱凋亡SCIRI提高bcl - 2表达和抑制伯灵顿caspase-3激活。
1。介绍
根据病理学特点,脊髓损伤主要分为主要伤害和二次伤害。主要损伤主要包括直接损伤和缺血性损伤,它通常发生在一个相对短的时间内受伤后(通常被认为是最早4 h后损伤),与不可逆的神经损伤(1]。灌注后脊髓缺血可能会进一步加剧损伤并导致脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)。SCIRI是一种最常见的类型的继发性脊髓损伤,加重四肢的神经功能障碍。二次损伤通常会持续更长时间,7天或更长时间,二级神经损伤能够逆转通过适当的干预措施(2]。脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)定义如下:删除后的因素导致脊髓缺血和脊髓的恢复血液供应,其神经功能得不到提高和缺血损伤比原来的更强烈的水平,甚至出现在不可逆转的迟发的死现象在脊髓神经元(3]。的原因一般认为SCIRI包括无氧radical-induced脂质过氧化反应,白细胞激活和炎症和神经细胞凋亡。近年来,尽管有许多脊髓损伤的临床治疗,结果并不令人满意。
红花黄色(SY)从花中提取的植物红花(Carthamus tinctorius)和中药已经广泛用于心肺脑血管疾病的治疗。SY可以促进血液循环,消除瘀血,从而改善毛细血管循环现场组织损伤(2]。SY水溶性查耳酮成分的混合物,在这两个羟基红花黄色(HSYA)和红花黄色B (SYB)是主要的组件。已经表明,红花注射液极好地保护心脏的心脏收缩和舒张功能改善,增加冠脉血流量,加强bcl - 2(抗凋亡基因)蛋白表达4]。另外,我们之前的研究表明,SY减轻受伤的跟腱粘连和炎症反应,促进了修复肌腱受伤的2]。然而,这仍然是未知的SY能否有效地防止SCIRI。因此,本研究构建SCIRI模型与新西兰兔子确定脊髓损伤的程度和SCIRI SY的保护作用。
2。材料和方法
2.1。动物
成年雄性新西兰兔(体重2.0 - -2.5公斤),来自南方医科大学动物实验中心,被用于这项研究。所有程序都严格按照中国机构伦理委员会批准的协议。兔子被安置在单独的笼子在温控室(22 - 25°C)和适应了在实验前1周。食物被8 h研究前,但所有的动物都可以免费获得水。
2.2。模型建立
与氯胺酮麻醉后(10毫克/公斤体重,肌肉),气道维持了气管插管(ID = 3.5毫米,深度10 - 12厘米)和机械通气是35 - 45毫米汞柱P等二氧化碳。聚乙烯导管是正确插入到股动脉监测平均动脉压(MAP)和血液样本,和一个是进入右股静脉输液的解决方案。腹主动脉是形象化的中线剖腹手术。SCIRI模型建立了阻塞腹主动脉左肾动脉下40分钟(当腹主动脉闭塞地图下降到0毫米汞柱)其次是再灌注所描述(5]。
2.3。试验协议
24只兔子被随机分为三组(每组):sham-operated控制(续),脊髓缺血再灌注(),处理红花黄色()。对照组只执行麻醉和手术,除了使腹主动脉闭塞。的组静脉注射2毫升/公斤的16%的解决方案(wt /卷)SY(1毫升,含有1.6毫克SY, Z20050146;永宁制药,浙江省,中国),其次是连续注入共有5毫升/公斤通过右股静脉再灌注的时候开始40分钟后腹主动脉闭塞。相同体积的0.9%生理盐水在控制和管理组。血液样本得到的0小时(),4小时(),12个小时()、24小时(),48小时(再灌注后,血浆分离和储存在−80°C进行进一步分析。所有动物都牺牲后48小时再灌注灌注,并迅速与0.9%的氯化钠,和L2-5段脊髓很快被删除。腰2 ~ 3段在每个动物被用于免疫印迹和其他环节(L4-5)沉浸到10%中性甲醛为2 - 3天,是用于形态分析。
2.4。后肢神经赤字分数
4小时(h),年底12 h, 24 h,和再灌注后48 h,神经功能缺损评分的后肢记录根据标准如下(6]。0:后肢绝对是瘫痪,不能移动。1:后肢轻微但不能对抗重力。2:后肢可以移动,但不能走或跳。3:后肢可以走和跳明显的共济失调。4:正常后肢能跳。
2.5。与ELISA测定MDA、SOD和引发
等离子体水平的MDA、SOD和引发测定使用商用兔子酶联免疫试剂盒(BenderMed,维也纳,奥地利)。血浆样品(PBS)使用亲和吸附剂和亲和柱纯化(开曼化工、安阿伯、MI),然后进行分析处理,根据制造商提供的说明(Quantikine;研发、明尼阿波利斯、MN)。光密度(OD)值为490 nm波长。空白控制的OD值减去每一个标准的样本,然后是起草的标准曲线。MDA的含量、SOD和引发计算根据标准曲线描述的方法在我们之前的研究(2]。
2.6。免疫印迹分析Caspase-3
冷冻脊髓组织均质使用裂解缓冲然后离心机在15000 g 40分钟在4°C,和蛋白质浓度测定用布拉德福德化验(美国Bio-Rad)。50μg总蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(10% sds - page)和转移到PVDF膜(微孔)。膜在阻断缓冲区孵化TBST脱脂牛奶(5%),然后用兔子anticaspase-3 (Abcam 1: 800年,美国),和GAPDH(1: 2000年,细胞信号技术,贝弗利,MA)在一夜之间TBST 4°C (7]。膜被孵化处理二次抗体与辣根过氧化物酶共轭TBST 2 h在37°C。墨迹是由增强化学发光和数字扫描。每个生成的标记带的光密度测量在一个图像分析程序。
2.7。他染色
浸泡在10%中性甲醛后2 - 3 d,脊髓样本(L4-5段)是固定的,通过分级脱水乙醇系列、嵌入式、分段在5毫米冷冻切片机,然后安装和覆盖。部分是常规脱蜡和水化,正如我们之前研究描述(2]他们被他和脱水染色,清除和覆盖。
根据神经元形态学标准(8),前角神经元被观察到放大200倍。五的视觉领域被随机选择和八个部分分别随机选取了每一段每一个动物。前角运动神经元数,正常神经元总神经元比率计算。
2.8。TUNEL免疫组织化学染色
TUNEL染色法用于检测细胞凋亡蛋白的表达在脊髓前角神经元的兔子。部分与TUNEL染色(原位细胞死亡检测装备,豆荚;罗氏,巴塞尔)根据制造商的指示。五个黑暗视觉领域在每个部分中,随机选择和TUNEL-positive神经元和神经元的总数在选择性视觉领域。TUNEL-positive指数(TUNEL-positive整个神经元比例)计算。八个部分每个动物从所有组织用于测量,和五个高性能视觉从每个部分被随机选中测量TUNEL-positive索引。
2.9。免疫组织化学染色对巴克斯和bcl - 2
检测proapoptotic蛋白质和抗凋亡蛋白的表达,脊髓部分,分别沾伯灵顿和bcl - 2(美国圣克鲁斯,CA)根据制造商的指示。五的视觉领域被随机选择在每个部分中,选择和八个部分在每一个动物。伯灵顿和bcl - 2阳性神经元的OD值,分别测量Image-Pro + 6.0软件。OD值是所有阳性神经元像素OD值的总和除以地区的脊髓前角地区。
统计分析。所有的实验数据都表示为±SD方法。结果的统计学意义被单向方差分析评价与SPSS 17.0软件,和被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。基本数据
没有动物实验期间去世。5例术后尿潴留膀胱按摩后改善。所有动物的基本生命体征包括心率(HR)和地图是稳定和组之间没有显著差异(表1)。术后腹部切口没有耀斑和脓性分泌生长良好。
3.2。神经赤字的后肢
动物后肢出现不同程度的功能活动的限制和组。统计结果表明,分数的组都高于组,,,时间点(,图1)。在集团得分明显降低比在,,()。动物的功能活动组更好和比在和,但比较和没有统计学意义(),也无显著差异和()。
3.3。的MDA和SOD的活动水平
结果表明,MDA水平在对照组的不同时间点没有明显变化(,图2)。血浆MDA的水平集团也逐渐增加来(),类似的趋势逐渐增加,MDA也见过的集团()。在时间点,MDA的水平和组没有统计学意义(),但他们高于对照组()。超出了时间点,在同一时间点来,MDA含量明显降低组比集团()。
SOD的变化活动Cont.组没有统计学意义在不同的点(,图3)。在时间点,SOD的活动集团和组明显低于对照组(),但之间的比较集团和组没有统计学意义()。从来,SOD的活动集团逐渐减少,和他们都低于();此外,他们都在同一时间点低于对照组()。相比之下,组,SOD的活动在同一时间点(组高),但他们都低于对照组()。
3.4。引发的血清水平的变化
类似于MDA和SOD的变化在对照组,引发的表达水平随时间没有显著差异(,图4),但它是更高的集团(与控制),并显著降低组。
3.5。Caspase-3蛋白表达
西方墨点法(图5)透露,caspase-3蛋白表达组与对照组相比显著增加(),这明显减弱集团(与,图5 (b))。
(一)
(b)
3.6。前角神经元的形态学改变
组织病理学变化。和他的部分染色观察光微观层面的侦探最初蒙蔽的小组任务。结果表明,脊髓运动神经元的虚假的对照组(图6(一))与清晰的轮廓,形态正常,多边形神经元胞体和圆形细胞核。没有液泡周围这些神经元。相比之下,在组,正常豚鼠的数量明显减少(图6 (b))。此外,观察神经元结构变化,包括神经元固缩、染色tigroid光身体,细胞核萎缩和核仁消失,等等。此外,出血性斑点被分散到组织结构和空泡的变化观察在细胞质中。神经元的形态结构集团基本上是正常的,除了轻微的水肿(图6 (c))。统计分析表明,正常豚鼠的比例更大组(66.75%±4.37%的神经元)比组(33.74%±5.31%的神经元,;图6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
光显微镜(LM)的观察凋亡TUNEL-Positive细胞。脊髓部分与TUNEL染色,观察到高亮度微观层面(放大200倍,图7)。结果表明,在脊髓前角神经元结构假对照组基本上是正常的和罕见的可检测TUNEL-positive染色(图7(一))。脊髓前角的集团、液泡的出现和大量TUNEL-positive神经元观察(图7 (b))。相反,细胞凋亡神经元通过TUNEL标记组明显降低(图7 (c))。计算凋亡指数(TUNEL-positive神经元整个神经元)的比率表明,凋亡指数小的组比集团(,图7 (d)),尽管两个损伤组的凋亡指数都高于对照组。
(一)
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(c)
(d)
LM的观察伯灵顿和bcl - 2蛋白表达。脊髓部分,分别沾伯灵顿和bcl - 2,并观察到高LM级别(放大200倍,数据8和9)。结果表明,伯灵顿蛋白质更强烈的表达比其他组群(,图8 (d)),但bcl - 2的表达集团显然是强烈的人物9(一个)- - - - - -9 (c)),其OD值也高于对照组集团(,图9 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
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(c)
(d)
4所示。讨论
脊髓血供明显节段,其侧枝循环是相对贫穷的,这样很容易遭受缺血损伤(5]。由于血管恒定,很少变化分布在腰部,脊髓损伤的程度是稳定的高重复性和更少的并发症。因此,我们建立脊髓缺血再灌注模型在兔子Zivin的描述(5]。
脊髓神经元的细胞膜富含脂质含量和大量的儿茶酚胺和不饱和脂肪酸,使他们更容易受到氧自由基攻击(9]。活性氧species-mediated脂质过氧化作用中扮演一个重要的角色在各器官缺血再灌注损伤10- - - - - -12]。脊髓受到损伤后,脂质过氧化反应是广泛活性和MDA在很大程度上是生产,但SOD活动明显减少。增加SOD活性有明显减弱脊髓损伤(2]。
许多中药作为天然氧自由基清除剂和降低毒性的优点的不良行为违背自然的产品,对缺血再灌注损伤具有保护作用[13]。红花及其提取物发挥重要作用的抑制脂质过氧化和清除氧自由基。红花注射液可显著提高谷胱甘肽过氧化物酶的活动(SE-GSHPX)和SOD和MDA含量减少缺血再灌注损伤心肌。目前的研究表明,降低MDA和SOD的整个身体的反应SCIRI,他们与损伤程度密切相关。再灌注后立即(再灌注0小时),脊髓神经元的脂质过氧化反应再灌注组(包括SY治疗组)开始加强观察MDA含量的变化,在再灌注后4小时内的血浆MDA水平的生产组进一步增加,SOD活性进一步减少。这些结果表明,脂质过氧化引发缺血阶段,然后在再灌注阶段进一步增加,加重脊髓缺血再灌注损伤。然而,脂质过氧化作用组减毒(这意味着较低的MDA含量和SOD活性高)在再灌注后不同时间点。这些结果表明,SY脊髓保护中发挥了重要作用,减轻脂质过氧化反应。
研究已经证实,引发是一种重要的细胞因子,参与炎症反应(14]。它主要通过细胞膜表面受体发挥作用。与其他细胞相比,嗜中性粒细胞表面显著提高引发受体表达,这引发主要引起中性粒细胞趋化因子的趋化作用,可能是一个重要的中介嗜中性粒细胞趋化因子聚合(15]。目前的结果表明,与sham-cont组相比,引发内容再灌注组没有SY治疗明显增加。此外,随着再灌注的恶化,引发水平逐渐增加,达到峰值后再灌注前12 h开始减少。在组有相同的变化趋势,但它是低于组在不同时间点。这一结果表明,SY可能抑制引发表达和SCIRI引起的炎症反应。
细胞凋亡的机制是非常复杂的,受到许多因素的影响,特别是通过基因调控。半胱天冬酶家族,一种calcium-dependent半胱氨酸蛋白酶,是关键蛋白酶引发细胞凋亡和细胞凋亡存在于整个过程(16]。目前的研究证实,caspase-3表达的变化符合SCIRI后细胞凋亡的变化,表明caspase-3可以作为评估post-ischemic脊髓损伤的生化指标。目前的结果表明,caspase-3的表达水平组明显低于组,这表明抑制caspase-3表达式可能代表SY授予SCIRI防护的一种机制。细胞凋亡的过程是由一个复杂的交互proapoptotic(伯灵顿集团的蛋白质)和凋亡(bcl - 2家族的蛋白质)的线粒体膜蛋白的激活效应半胱天冬酶(17]。的结果研究脊髓损伤的神经细胞在动物模型应有助于提高我们对受损神经元的形态学特性的理解,神经损伤的识别机制,和,因此,对SCIRI开发更有效的治疗方法。
5。结论
显著影响后肢神经功能和活性脂质过氧化反应,促进了炎性细胞因子释放。SY可以减少缺血后脂质过氧化反应和炎症反应,有效减弱SCIRI兔子。
作者的贡献
刘Daiwei周和范冰冰同样对本文亦有贡献。
确认
这项研究由美国国家科学基金会支持广东省(没有。9151031701000002)。