文摘

环前列腺素(PGI₂),一个强有力的血管舒张和血小板antiaggregatory类二十烷酸,cytoprotective在脑循环。从花生四烯酸(AA)合成顺序动作的环氧合酶(COX) 1或2和环前列腺素合成酶(PGIS)。因为环前列腺素是不稳定的在活的有机体内,PGI₂类似物已开发和演示预防脑缺血。这项工作试图有选择性地增强PGI₂合成混合胶质文化或帕金森病(PD)模型通过直接adenoviral环前列腺素生物合成的基因转移酶和在文化或者检查是否能提供保护在活的有机体内。融合性的混合胶质文化积极代谢外源性AA铂族元素₂和PGD₂。这些动力主要是NS398敏感和视为cox - 2的产品。基因转移的AdPGIS文化有效地分流的AA分解代谢环前列腺素的合成,同时减少细胞增殖。此外,PGIS超表达显著降低LPS刺激的文化。在活的有机体内adenoviral基因转移bicistronic COX-1 / PGIS黑质保护6-OHDA -诱导多巴胺损耗和改善行为赤字。综上所述,本研究表明,增强环前列腺素合成减少胶质激活hemiparkinsonian老鼠和改善运动功能障碍。麽可能有神经保护作用在退化nigra-striatal通路调节炎性反应。

1。介绍

帕金森病(PD)的特征是黑的进行性变性多巴胺(DA)伴有炎症变化导致激活的小胶质细胞和星形胶质细胞1]。黑质(SN)的大脑特别丰富的小胶质细胞(2,3]。此外,多巴胺能神经元的SN降低抗氧化能力,使他们容易受到各种侮辱。炎症反应也与多巴胺能神经毒素的影响,有关6-hydroxydopamine (6-OHDA)或1-methyl-4-pheny-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物)。活化的小胶质细胞和DA细胞损失被发现在灵长类动物注射SN年后MPTP药物治疗(4]。的纹状体和SN 6-OHDA-lesioned老鼠大脑,突出小胶质激活周后检测到损伤(5]。Intranigral注射LPS的老鼠也导致小胶质激活和DA系统的退化6,7]。是否激活小胶质保护或加剧神经损失目前争论,尽管大多数研究表明:活化的小胶质细胞对神经元的毒性作用。

前列腺素类,一种天然的二十烷类的子类,脂质介质生成的氧化代谢20-carbon脂肪酸(eicosa希腊20),主要是花生四烯酸(AA)。前列腺素(后卫),从AA合成环氧合酶(cox),有不同的生物学行为由当地工作介质。在中枢神经系统(CNS),动力维护重要功能,逆行突触使者和神经损伤的早期介质。PG的生产水平是由考克斯的表达和活性。考克斯存在于两个截然不同的亚型,本构COX-1和诱导COX - 2。cox - 2负责生产的增加前列腺素类在炎症和压力(8,9]。在大脑中,COX - 2表达起来从而也(主要考克斯对碘氧基苯甲醚10,11主要生产铂族元素)₂和PGD₂(12,13]。环前列腺素(PGI₂),合成顺序动作的考克斯和环前列腺素合成酶(PGIS),是一个强大的内生的血小板聚集抑制剂。它能抑制血小板分泌活动和聚合,维护血管舒张,块monocyte-vascular墙相互作用和vasoprotective [14]。因为它的不稳定性在活的有机体内,几个PGI₂类似物已被开发和演示减少缺血性脑损伤(15- - - - - -17]。

我们之前的结果表明,过度COX-1和PGIS能够产生大量的PGI₂在人类内皮细胞(18]。使用adenovirus-mediated COX1转让或COX1 / PGIS,林et al ., (19和我们的同事20.)表明,增强PGI₂合成在缺血性神经元文化或者大脑神经,突出对小胶质细胞的影响。这项工作试图有选择性地增强PGI₂合成混合胶质文化和hemiparkinsonian老鼠通过直接adenoviral PGIS基因转移或bicistronic COX-1 / PGIS和检查是否能提供保护或诱导细胞损伤在帕金森病(PD)。诱发的小鼠Hemiparkinsonian老鼠6-OHDA中层前脑束(地铁消防队),黑系统的提升途径。我们的研究结果表明,增强环前列腺素合成抑制胶质激活和hemiparkinsonian老鼠是有益的。

2。材料和方法

2.1。材料

脂多糖(LPS);大肠杆菌0111:B4), OHDA,多巴胺,阿朴吗啡和methylthiazol四唑(MTT)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。CAY10449从开曼群岛购买化学(安阿伯市MI)。培养媒体和抗生素从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。(6 -³胸苷H], [1 -¹⁴C]花生四烯酸(AA)和放射性前列腺素类从Amersham购买生物科学(英国白金汉郡)。乙腈和其他有机溶剂从默克公司(达姆施塔特,德国)。除非另有规定,所有其他化学品都从Sigma-Aldrich有限公司购买

2.2。重组腺病毒(广告)

Replication-defective第一代E1-deleted运载体。腺病毒编码绿色荧光蛋白(水母的绿色荧光蛋白表达),PGI₂合酶(PGIS)或bicistronic COX-1 / PGIS使用磷酸甘油酸酯激酶(PGK)作为启动子。的准备,体外扩张,净化这些广告跟着前面描述的方法(18,20.,21]。纯化的病毒滴度的广告是由点状化验及~ 10的范围¹⁰空斑形成单位/毫升。

2.3。细胞培养和在体外转导

混合的神经元或神经胶质细胞培养是从胚胎中脑的地区准备Sprague-Dawley (SD)大鼠胎儿在妊娠14 - 16天中描述蔡et al。22,23]。短暂,细胞分离混合物的木瓜蛋白酶或蛋白酶/脱氧核糖核酸酶(0.1%:0.1%:0.03%)的密度和涂镀到poly-D-lysine菜1 ~ 2×10⁵细胞/厘米²在DMEM补充10%的边后卫。第二天细胞播种后,文化感染了AdGFP AdCOX-1或AdCOX-1 / PGIS。混合神经细胞神经元和神经胶质文化与反被免疫染色三世微管蛋白(1/300稀释;美国CA Covance)。混合胶质细胞准备从新生大鼠大脑如前所述24,25]。短暂,磨碎皮质,免费船舶和脑膜,通过尼龙布料和镀在75厘米²烧瓶在DMEM补充10%的边后卫。细胞被孵化的37°C在水饱和的气氛中5%的有限公司₂空气/ 95%。当细胞达到融合,细胞在烧瓶亚文化和山肩到多井盘子。文化显示超过90%的阳性染色为胶质原纤维酸性蛋白(美国Chemi-Con兔子或鼠标anti-GFAP),一个astroglial标记。Subconfluent文化被用于衡量增殖活动(氚化胸腺嘧啶核苷掺入或MTT还原;见下文),而支流文化被用于测定反应的代谢活动¹⁴C-arachidonic酸(AA)。为在体外与生长介质传导,细胞被美联储。Ad-GFP、Ad-PGIS或Ad-COX-1 / PGIS了培养细胞的感染复数(MOI, pfu /细胞)20。重组Ad-GFP被用作矢量控制和优化感染条件。广告转导三天后,细胞处理类二十烷酸测量或处理有限合伙人(600 ng / mL) 2天。培养基是然后化验一氧化氮(NO)和细胞免疫印迹分析处理。CAY10449在500海里被添加到混合胶质细胞AdPGIS转导后2小时。文化与介质和药物培养5天加一次。文化是MTT还原处理。

2.4。花生四烯酸(AA)代谢产物的提取和分析在混合混合胶质文化和神经元和神经胶质的文化

文化汇合的胶质或神经元胶质文化AdGFP之后,AdPGIS AdCOX-1,或AdCOX-1 / PGIS转导测量AA代谢活动。简而言之,培养细胞在DMEM培养包含10(血清)M (1 -¹⁴在37°C C) AA 10分钟。免疫印迹分析细胞得救了,而分数发布含有放射性二十烷类,提取Sep-Pak C₁₈墨盒(水Associates米尔福德,MA)作为描述(20.,21]。导致提取的¹⁴C-labeled AA代谢物(类花生酸)分析了反相高效液相色谱法(高效液相色谱法;水模型2690)配备在线放射性同位素检测器(帕卡德150 - tp)如前所述18]。简单地说,固定相是Inertsil 7 ODS-3(4.6×150毫米;Vercopak、台湾)。之间的流动相由编程梯度洗脱溶剂(乙腈)和溶剂B(0.1%乙酸,pH值3.7)1毫升/分钟的流量如下:34% B 10分钟,34 - 40% B在4分钟,1分钟内B 40 - 50%, 50%为5分钟,50 - 75%在10分钟,10分钟内B 75 - 100%, 100% B 10分钟。类花生酸被确定的保留时间与真实的放射性同位素标准。

2.5。(H]胸腺嘧啶核苷掺入试验

后的增殖活动混合胶质文化广告转导研究subconfluent 0.5文化通过文化的脉搏Ci /毫升(³H]胸苷10小时根据我们以前的方法(26,27]。后(³H]胸苷脉搏,培养媒体删除很仔细,细胞与PBS洗两次。三氯乙酸(250整除的冰冷的10%信用证)被添加到细胞。细胞溶解产物的放射性测量闪烁计数器。

2.6。6-OHDA病变

成年SD大鼠体重250 - 300克。这些动物被异氟烷麻醉(1-chloro-2 3 4-trifluoroethyl醚、Aerrane)与氧气在手术。操作是使用在无菌条件下操作显微镜。所有程序涉及动物动物委员会批准台北荣民总医院。外科手术,术后护理,和监控前面描述的(28- - - - - -30.]。黑途径进行的单方面6-OHDA病变大鼠异氟烷麻醉下立体定位注射6-OHDA哈佛商业评论(20g /老鼠;在PBS车辆)溶解在抗坏血酸盐(0.02%)。5毫升的6-OHDA (2克/L)注入两个站点(5提升黑通路中的L /网站)附近的地铁消防队的成年SD大鼠(描述31日]。两个地铁消防队的注射是美联社的坐标——4.2毫米(前囱后面),ml - 1.1毫米(侧中线),dv - 7.8毫米(7.8毫米低于硬脑膜),美联社——4.4毫米(前囱后面),ml - 0.9毫米,dv - 7.8毫米。针被允许保持在大脑中5分钟前年底收回6-OHDA输液。

2.7。Intranigral注入广告向量

后,把大老鼠放到立体定位框架(Tujunga科夫仪器,CA)注射了生理盐水或6-OHDA注入广告向量的大脑区域。1L Ad向量悬浮在PBS注入SN的附近(协调美联社−5.3毫米,毫升−2.1毫米,和前囱DV−7.2毫米)或到纹状体(AP + 0.5毫米;毫升+ 2.0毫米和DV−5.0毫米前囱]。广告注入是通过5L汉密尔顿注射器装有30-gauge斜皮下注射针0.2 5分钟的速度L / min。停止注射后,针是在5分钟前被慢慢地退出了大脑。广告向量进行注射后30分钟内注入6-OHDA地铁消防队。1微升的存储缓冲区,Ad-GFP或AdCOX-1 / PGIS包含大约点状单位(pfu)注入。AdGFP被用作模拟控制和检查感染性取向。

2.8。Apomorphine-Induced盘旋的行为

1到4周后注入6-OHDA和广告,进行行为测试来确定治疗的疗效。老鼠从所有组织管理与DA受体激动剂阿朴吗啡(0.5毫克/公斤,南卡罗来纳州。)并立即分离成单个丙烯酸盒子的笼子里。十分钟后,侧旋转到损伤的数量记录在每个老鼠每5分钟的总时间60分钟。每个被定义为一个完整的旋转360°转弯。结果表示为总匝数,老鼠在60分钟完成。在目前的研究中,老鼠6-OHDA病变仅净侧旋转不对称500转/小时。

2.9。生化检测

一氧化氮(NO)的生产,是亚硝酸盐积累,化验在媒介使用与格里斯试剂比色反应萘乙二胺盐酸盐(磺胺1% / 0.1% / 2%磷酸)描述(23]。MTT还原程度是用来测量细胞生存能力或增殖活动。治疗后,MTT加入培养细胞最终浓度为0.1毫克/毫升,存活细胞的反应4小时37°C。了蓝色甲瓒产品可溶性和测量在570 nm的吸光度26]。

2.10。免疫组织化学

与4%多聚甲醛灌注老鼠intracardially PBS深与戊巴比妥钠麻醉下的实验。大脑被移除,后缀在一夜之间在4%多聚甲醛,然后在PBS cryoprotected含有30% (w / v)蔗糖为3天。组织切除,嵌入在组织Tek 10月(日本东京樱花好技术,)然后截面20m低温恒温器的厚度。组织部分收集到玻片和干在37°C。组织部分是孵化主要抗体,紧随其后的是各自的所述第二抗体组织学评价(30.,32]。检查AdGFP感染性取向,老鼠组织学分析处理在三天后nigral AdGFP感染。双GFP细胞组织化学染色标记是在冠状进行大脑部分。细胞标记抗体包括anti-tyrosine羟化酶(TH)(鼠标,稀释1/150,Chemicon,泰梅库拉,CA)对多巴胺神经元,anti-GFAP(兔子,稀释1/1000;Chemicon泰梅库拉,CA)星形胶质细胞,生物素化的Griffonia simplicifolia凝集素我isolectin B4(生物素化的GSLI-IB4,稀释1/100;矢量b1205)或anti-ED-1(鼠标,稀释1/250;小胶质细胞Serotec,英国牛津大学)。

2.11。免疫印迹分析

大脑组织或培养细胞中可溶性裂解缓冲包含7 M尿素,2 M硫脲,4%的皮套裤,40毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液,pH7.5,蛋白酶抑制剂(罗氏,曼海姆,德国),1毫米PMSF, 1毫米Na₃签证官₄德勤,1毫米。合成的蛋白质浓度溶解产物决定使用Bio-Rad蛋白质化验(Bio-Rad大力神,CA)。等量的蛋白质被加载,分开使用8% - -12%凝胶(sds - page)所描述的33]。电泳后,蛋白质在凝胶转移到PVDF膜(美国微孔Corp .)和孵化一夜之间在4°C抗体PGIS(兔子,稀释1/3000)cox - 2(兔子,稀释1/5000,开曼群岛),诱导一氧化氮合成酶(进气阀打开,鼠标,稀释1/5000,BD生物科学、美国),或肌动蛋白(山羊,稀释1/5000,圣克鲁斯生物技术,美国),后跟一个辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1/2000稀释,杰克逊实验室)在室温下1小时。免疫反应性被可视化增强化学发光检测(美国珀金埃尔默股份有限公司)。

3所示。结果

3.1。分析类花生酸产生的胶质细胞培养在回应[1 -C] AA治疗

净化广告成功地扩大和纯化之前进行在体外和在活的有机体内实验。高纯度腺病毒编码绿色荧光蛋白,PGIS bicistronic COX-1 / PGIS,从10¹⁰~ 10¹¹空斑形成单位/毫升,被用于本研究。以前,我们已经证明了高混合胶质文化的包容性AdGFP感染[22]。几乎所有细胞表达绿色荧光蛋白在2天后20月Ad-GFP转导(类似的结果在图所示4 (f))。直接在目前的研究中,我们审查的活动类二十烷酸生物合成的活动在Ad-transduced混合胶质细胞反应C-AA脉搏。因为混合胶质神经细胞的文化枯竭,研究神经胶质AA代谢活动的文化会给一些线索相对角色的神经元和神经胶质细胞。我们用[1 -孵化文化¹⁴C] AA 10分钟,由一个C类花生酸从介质中提取₁₈筒,类花生酸的高效液相色谱分析。两个主要的山峰,前列腺素(PG)和PGD₂在参与文化(图中发现1(一))。PGI很少或没有₂(环前列腺素),显示为其水解产品6-keto-PGF_1α(6 kp)被发现。的转导AdGFP没有改变代谢概要文件(数据未显示)。的6-keto-PGF_1α主要是减少峰值(80%)细胞用NS398预处理时,选择性cox - 2抑制剂(图1 (b))。此外,没有6-keto-PGF_1α峰值检测细胞使用消炎痛时,COX-1和cox - 2抑制剂。这表明cox - 2在混合胶质类二十烷酸的主要酶合成文化回应¹⁴C-AA。有趣的是,AA代谢物在AdPGIS转导分流的通过环前列腺素合成。非常小的铂族元素₂和PGD₂留在AdPGIS-transduced文化。这表明overexpressing酶从AA内皮功能活跃在生产。相比之下,AdPGIS-infected神经元和神经胶质的文化没有增加6-keto-PGF_1α合成(见补充图1网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/649809和蔡et al .,20.])。AdCOX-1-infected神经元和神经胶质的文化产生了主要的铂族元素₂和PGD₂峰值。只有bicistronic AdCOX-1 / PGIS-infected神经元胶质文化显著增强6-keto-PGF_1α合成。

3.2。增强环前列腺素合成减少细胞增殖和LPS刺激混合胶质细胞

检查加强环前列腺素合成的影响细胞增殖,subconfluent胶质细胞转导与Ad-PGIS 2天。氚标记的胸苷加入文化细胞收获前10小时。表1同时表明,过度的PGIS的胶质细胞增强环前列腺素生产(6-keto-PGF水平_1αPGI的产物₂水解)和抑制astroglial扩散(胸腺嘧啶核苷掺入)。检查的效果是否overexpressing PGIS细胞增殖是通过IP(环前列腺素)受体介导,CAY10449被添加到混合胶质细胞在AdPGIS转导后2小时。如图2,AdPGIS转导减少混合胶质的MTT还原程度的文化。高亲和性IP拮抗剂,CAY10449 500海里部分显著但废除环前列腺素对细胞增殖的影响。有限合伙人是一个强大的免疫挑战。LPS诱导释放细胞因子治疗已被证明,不,从巨噬细胞和促炎的因素34,35]。对LPS刺激效应overexpressing PGIS检查在混合胶质的文化。汇合的胶质转导AdGFP或AdPGIS文化。三天后,细胞与有限合伙人进一步治疗的剂量为2天600 ng / mL。在我们之前的论文(20.),我们使用100 ng / mL LPS刺激神经元和神经胶质的文化。但是,有限合伙人未能影响混合胶质细胞在100 ng / mL,需要更高浓度的LPS有效细胞刺激。如图3,Ad-PGIS转导增强PGIS而伊诺和cox - 2的表达水平几乎没有检测到。相比之下,LPS诱导治疗增加控制和AdGFP-infected伊诺和cox - 2表达的细胞。AdPGIS转导有效减少LPS-induced cox - 2和伊诺的水平。同时,LPS-stimulated亚硝酸盐释放被显著地抑制AdPGIS-transduced细胞(图3(b))相比,控制和Ad-PGK-infected细胞。这表明增强环前列腺素合成PGIS-overexpressing细胞显著抑制伊诺表达,没有生产。

3.3。感染性AdGFP转导中脑的神经元或神经胶质的文化取向和大鼠黑质(SN)

首先,我们调查了感染性AdGFP在中脑神经元和神经胶质的文化取向是富含DA神经元。AdGFP (~ 10⁶空斑形成单位/每个)添加到或血清血清培养基培养细胞。如图4,AdGFP主要转导nonneuronal细胞。在无血清条件,AdGFP感染细胞% astroglial (GFAP-positive)细胞,%小胶质细胞(ED1-positive)细胞,% NG2-positive细胞。没有三世tubulin-positive神经元或者TH-positive DA神经元显示绿色荧光蛋白免疫反应性。此外,AdGFP感染性效率血清培养基(10% FCS)相比,在减少无血清条件。使用相同的效价AdGFP神经元或胶质文化,GFP-positive文化保存在无血清细胞和血清条件和细胞/毫米²,分别。我们进一步执行double-labelled AdGFP-infected日冕部分包含SN染色。后注入AdGFP正常SN,观察GFP的表达在注射部位出现的。图5显微图显示了代表double-labelled免疫染色结果。一些SN GFP-positive细胞也积极为TH染色,这表示多巴胺神经元(图5(一个)箭头)。一些GSLI-IB4-positive小胶质细胞(在图5 (b)似乎,箭头)免疫反应性的GFP。相比之下,几乎没有double-labelled染色细胞被发现与GFAP GFP或巢蛋白免疫反应性(数据5 (c)和5 (d))。这些结果表明,转基因的表达可以实现神经元或小胶质细胞后注入AdGFP SN在活的有机体内。AdGFP取向文化和SN的结果也不一致。我们也感染AdGFP纹状体和检查了感染性取向(补充图2所示)。与AdGFP-infected SN中观察到的结果一致在活的有机体内,GFAP-positive TH-positive ED1-positive nestin-positive细胞被发现与GFP标记大鼠纹状体的两倍。

3.4。影响Nigral注入Ad-COX-1 / PGIS Hemiparkinsonian老鼠

我们之前的研究表明,bicistronic AdCOX1 / PGIS感染神经元和神经胶质的文化产生了著名的环前列腺素的合成,而AdPGIS感染没有(20.]。我们因此直接注入AdCOX-1 / PGIS鼠SN内皮保证生产。6-OHDA剂量为20g /老鼠注入正确的地铁消防队的老鼠。后30分钟内6-OHDA输液,AdGFP或AdCOX1 / PGIS (空斑形成单位)随后被注入到右SN。行为测试是检查每周由apomorphine-induced将手术后。老鼠牺牲后4周治疗。地区的黑质和纹状体microdissected多巴胺水平测量。数据6(一)和6 (b)演示6-OHDA治疗严重枯竭TH-positive神经元对SN比未经处理的网站。一些TH-positive神经元获救AdCOX1 / PGIS基因转移(图6 (c))。治疗获救TH-positive神经元侧基因传递。在所有情况下,广告在侧SN治疗没有效果。Apomorphine-induced转变行为,运动损伤的标志,在6-OHDA-lesioned老鼠图所示6 (d)。6-OHDA-treated老鼠表现出相当数量的旋转。这效果是显著降低大鼠转导AdCOX1 / PGIS ()。AdGFP转导产生治疗组相比没有明显的旋转行为的变化与6-OHDA病变。综上所述,nigral Ad-COX-1 / PGIS感染防止6-OHDA-induced多巴胺损失和行为缺陷。

4所示。讨论

Adenovirus-mediated基因转移是一种很有前途的治疗神经退行性疾病的工具。运载体重组目标基因表达的神经系统,并提供长期的表达外源蛋白(23,33,36]。在这里,我们目前的证据表明,神经胶质文化,中脑的神经元和神经胶质的文化,或nigral多巴胺神经元(SNpc)可以有效地感染了重组腺病毒,从而表达转基因。我们的数据与胶质文化证明如果细胞积极代谢外源性AA铂族元素₂和PGD₂。这些动力主要是NS398敏感,因此视为COX-2-derived产品。这是与低AA在神经细胞的代谢活动,发布仅检测到类花生酸(20.]。有趣的是,基因转移的Ad-PGIS胶质文化有效地分流的AA通过合成6-keto-PGF分解代谢_1α内皮的水解产物。这表明overexpressing酶的功能与考克斯内源性内皮产生的积极合作。因此,增强环前列腺素生产有效地抑制胶质增生,部分内皮通过IP受体。此外,显著增强环前列腺素合成抑制LPS刺激通过抑制cox - 2和伊诺表达,没有生产。细胞的异常,测量中LDH释放介质,不受广告影响感染或有限合伙人治疗(数据未显示)。

众所周知,有限合伙人,革兰氏阴性细菌外膜的主要组成部分,诱发炎症反应通过细胞因子的生产37]。我们发现混合胶质细胞不太敏感的LPS刺激相比,混合neuron-glial文化。有限合伙人是一个功能强大的工具,小胶质细胞的激活。虽然有限合伙人对神经元没有已知的直接毒性作用,激活小胶质细胞释放神经毒性因子(38,39]。神经元,通过机制和信息交互,也调节小胶质细胞的反应性40,41]。在目前的研究中,AA代谢活动在胶质神经元和神经胶质文化和文化非常不同,强调信息的参与互动。这项工作的目的是检查PGI的效果₂在神经系统。我们之前的结果表明,过度COX-1和PGIS能够产生大量的PGI₂(18]。AdCOX-1感染细胞过表达可能COX-1一致的高活动(主要是铂族元素₂),如补充图1中所示¹⁴C-labelled类花生酸被广告COX-1-infected神经元和神经胶质的文化生成的反应[1 -¹⁴C] AA治疗。因此,我们使用了Ad-COX-1 / PGIS调查PGI增强的效果₂合成在黑质在活的有机体内。COX-1和cox - 2催化转换PGG AA₂,进一步转换为PGH₂。cox - 2的过度表达可能/ PGIS将生成大量的PGI₂。

我们的数据与adenoviral基因转移在老鼠SN表明重组腺病毒能感染多巴胺神经元和胶质细胞都有效。在SN GFP-expressing细胞中,% TH-positive多巴胺神经元和%小胶质细胞。GFAP的转基因表达不存在,或者nestin-positive细胞,相比之下,在中脑的神经元和神经胶质的文化。图4表明AdGFP优先感染喜欢的《忍者外传2》(+)细胞,ED1(+)和GFAP(+)细胞,虽然没有第三β微管蛋白(+)神经元或TH(+)多巴胺神经元在混合感染神经元和神经胶质的文化。高包容性AdGFP转导在混合胶质细胞也被显示。因为混合胶质神经元和神经胶质的文化被保持为单层的文化,这些文化扩展nonneuronal细胞和夷为平地,允许高的概率AdGFP感染。虽然SN富含DAergic胞体,特别是丰富的小胶质细胞(2,3),针对AdGFP注入SN在活的有机体内可能是被大面积的DA小胶质细胞和树突吗原位。因此,罕见的GFAP / GFP double-labelled细胞能找到。我们之前的研究表明,bicistronic AdCOX1 / PGIS感染神经元产生的文化突出环前列腺素合成(20.]。这也是真正的内皮细胞中过表达PGIS和COX-1与,导致单相过度环前列腺素(21]。我们因此直接注入AdCOX-1 / PGIS鼠SN内皮保证生产。图6显示,过度的COX1 / PGIS减少6-OHDA引起的多巴胺能神经元死亡。我们提供的证据表明,减少TH-positive细胞的数量在4周后6-OHDA病变与旋转对应的行为。6-OHDA-treated老鼠表现出相当数量的旋转。这种效应是显著减毒老鼠转导AdCOX1 / PGIS ()。6-OHDA病变组与AdGFP转导产生相比没有明显的旋转行为的变化与6-OHDA病变。综上所述,nigral Ad-COX-1 / PGIS感染改善6-OHDA-induced多巴胺损失和行为缺陷。

我们使用第一代E1-deleted广告向量在目前的研究。可能引起的神经毒性效应的广告表达应该考虑。虽然我们没有评估免疫反应在这项研究中,没有明显的副作用与广告注入老鼠。此外,AdPGIS AdCOX-1 / PGIS或AdGFP用于这项研究已经由PGK启动子可以开车长时间(天,周)转基因表达。AdPGIS-transduction减少胶质激活的机制或AdCOX1 / PGIS-transduction降低帕金森障碍尚未阐明。在大脑中,至少有两种截然不同的环前列腺素受体,指定为IP1 IP2,已经被证明(42]。IP2受体被发现只有在中枢神经系统,因此命名为铁路公司那样环前列腺素受体(42]。IP1受体主要耦合G-protein-coupled受体。受体的刺激导致营地生产(43]。还有待确定哪些受体亚型(IP1或IP2)是参与这一效应。还需要进一步的研究来阐明所扮演的角色的下游分子抑制细胞增殖和hemiparkinsonism LPS刺激和保护。

总之,这项研究表明,增强环前列腺素合成的adenovirus-mediated基因转移AdPGIS或AdCOX1 / PGIS减少胶质激活hemiparkinsonian老鼠和改善运动功能障碍。我们建议环前列腺素可能有神经保护作用在退化nigra-striatal通路调节炎性反应。

作者的贡献

研究。Shyue和h . Cheng同样这项工作。

确认

这项工作是v101e6赠款支持- 001和ci - 95 - 5在台湾台北荣民总医院,由格兰特NSC 91 - 2320 - 075 - 017 b在台湾从美国国家科学委员会,并通过教育部的资助顶尖大学计划(目标)。

补充材料