文摘

这个实验室发现albumin-like蛋白质(表示p70)作为一个组件内的复杂大分子组装5′监管区域redox-sensitive基因在血管平滑肌细胞(vSMCs)。在这里,我们表明,p70存在的胞质及核隔间vSMCs和动态响应性的氧化还原状态。强烈的细胞质和细胞核周围的染色,再加上增强核本地化,在vSMCs观察,但不是HepG2细胞,治疗苯并(a)芘(BaP), H₂O₂,或n -乙酰半胱氨酸常代理调节氧化还原状态。3′竞赛表明p70不是生成内源性基因表达的产物,而是从细胞外室。p70察觉时24小时无血清条件下细胞生长,细胞相关,耐酸白蛋白检测添加外源性白蛋白后30分钟。与100年vSMCs孵化在4°Cμg / mL标记BSA和10μg / mL FITC-BSA为60分钟,然后转向37°C到检查热敏标签显示点状的结构在整个细胞吸收符合白蛋白内化在更高的温度。白蛋白被发现影响redox-signaling,调制的cyp1a1 gsta1和Ha-ras基因可诱导性。在一起,这些结果暗示白蛋白和albumin-like蛋白质血管氧化还原信号的关键监管机构。

1。介绍

有氧生物不断受到内源性和外源性压力调节氧化还原内稳态。的适应性反应氧化侮辱,需氧生物进化出了各种各样的蛋白质氧化还原内稳态和传达信号的变化,细胞核调节基因的表达。一个著名的氧化还原传感机制涉及到的激活独联体代理监管元素称为抗氧化反应(是)。是序列存在于基因的5′UTR参与氧化还原内稳态(1,2],[生长调节3,4),和药物代谢5,6]。转录反应介导通过阿瑞斯很复杂,根据细胞类型,不同基因背景下,和化学特异性(7]。阿瑞斯是受多环芳烃,如苯并(a)芘(BaP)、酚类等抗氧化剂叔丁基对苯二酚(特丁基对苯二酚),或直接的氧化剂,如H₂O₂(7]。

氧化还原信号是至关重要的在血管细胞活性氧函数作为信号分子调节血管生理学的重要方面,严格控制氧化代谢的保护是至关重要的结构和功能的完整性。多种信号转导级联包括NF -κB ERK1/2 AP-1,都被定性为监管控制血管壁内的关键元素。vSMCs发挥核心作用的血管氧化还原信号就是明证参与基质金属蛋白酶的规定,旁分泌调节内皮功能,促炎的分子的表达,并有很强的硬化的影响。因此,研究血管氧化还原信号是至关重要的进步对我们理解分子血管细胞生物学和治疗干预方法能够有效地防止动脉粥样化形成。

努力描述分子对血管平滑肌细胞氧化应激反应(vSMCs),我们专注于描述redox-regulated multiprotein复杂组装的基因。几个相互作用的蛋白质在vSMCs已确定,包括帽“n”领(CNC)蛋白质,Nrf1 Nrf2, c-Jun,和芳基碳氢化合物受体(AHR),小加蛋白质,AP3 [8]。具有约束力的蛋白质属于亮氨酸拉链的转录因子家族,与类似或相关蛋白质二聚调解基因激活或镇压。伊藤等。9第一次描述了一个压迫机制涉及Nrf2亲电应力和Kelch-associated蛋白1 (Keap-1)。添加prooxidants克服这种负面互动和激活转录监管。Keap-1的同系物果蝇actin-binding蛋白质Kelch,交互的关系符合Nrf2与肌动蛋白Keap-1框架氧化还原反应压力。

一个p70 albumin-like蛋白质被确认为小说的组成部分的氧化还原传感蛋白机械vSMCs [8]。爆炸分析建立的这种蛋白质同源性包含homeodomains Bach2和多个锌指蛋白。三个领域100%的同源性之间共享albumin-like蛋白质和Bach2,表明这些结构特征可能与氧化还原信号有关。Bach2具有数控和Broad-Complex、Tramtrack和小摆设(BTB)域已知的关键交互序列(10]。BTB图案也参与调节Nrf2交互与其他转录调控蛋白,如N-CoR和聪明11]。Bach2已知与加蛋白质通过数控主题参与转录控制(12]。BTB蛋白质通常包含Kelch域调节与细胞骨架之间的相互作用;符合我们之前的关系发现,肌动蛋白参与信号(8]。Hoshino et al。13)表明,氧化应激Bach2废除核出口,因此,暗示核积累这种蛋白质的氧化还原信号。albumin-like蛋白质的参与转录控制最好的例证的作用的维生素D结合蛋白(菲律宾)固醇绑定和激活vitamin-D-regulated转录(14]。需要特别注意的是发现白蛋白和菲律宾同源二硫桥形成和蛋白质折叠模式(15]。

上述研究结果的基础上,我们假设p70 vSMCs参与氧化还原信号。这里给出证据,p70动态受氧化应激和它的胞内定位是依赖于细胞外蛋白质吸收。易位p70从胞质核间参与氧化还原调控血管基因表达。

2。材料和方法

细胞培养和化学治疗:文化C57 / BL6小鼠主动脉vSMCs种植在199年媒体,HepG2, HEK293细胞在鹰的最低必要的媒介和COS7 RPMI 1640补充10%胎牛血清的边后卫。化学治疗,细胞被挑战与软面包卷或H₂O₂在37°C和5%的公司₂不同时期和浓度。研究,以确定如果白蛋白从细胞外介质,采用无血清细胞培养excel 293中耗尽内生albumin-like蛋白质商店。

蛋白质提取:文化是冲洗两次prewarmed PBS和收获通过刮板缓冲(20毫米HEPES-pH 7.6;1.5毫米MgCl₂;0.2毫米EDTA;10%甘油;德勤约0.5毫米;完成迷你(罗氏)蛋白酶抑制剂的鸡尾酒),放在冰10分钟。细胞被dounce-homogenized离心机,享年14000岁g 20分钟和上层清液(胞质)收集并存储在−80°C。核颗粒重新溶解在缓冲B(20毫米HEPES-pH 7.6;420毫米氯化钠;1.5毫米MgCl₂;0.2毫米EDTA;25%甘油;德勤约0.5毫米;完成迷你(罗氏)蛋白酶抑制剂的鸡尾酒),在冰1小时孵化,上层清液离心后收集在14000年g 20分钟。

Anti-p70多克隆抗体生产:女性兔子从Harlen购买实验室和免疫KLH-conjugated 17-mer肽对应于分子的n端albumin-like蛋白质。序列用于免疫对应albumin-like蛋白质的n端确认之前(8)和扩展基于排序的最初描述12-mer肽。数量足够的免疫球蛋白后由ELISA滴度检测,动物是流血和原油多克隆血清收集。

西方分析和免疫荧光显微镜:对西方分析、胞质及核蛋白质提取物在4 - 12%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(如前所述8]。免疫荧光检测进行了描述(16]。简而言之,vSMCs被播种在43细胞密度/毫米²在10厘米菜含超级霜/ +显微镜载玻片(费舍尔)。文化与N-acetyl-cysteine preincubated 1人力资源挑战前(0.5毫米)0.3或3μM软面包卷或汽车3小时。细胞被固定在冷丙酮/甲醇和p70被免疫荧光可视化。核与Dapi复染色或phalloidin 568(分子探针)。封面都安装使用延长不变色(分子探针)和幻灯片和干燥剂保持钱伯斯在4°C。20照片/幻灯片/抗体捕获从一式三份~ 400细胞实验。图像过滤基于强度和大小量化积极事件使用蔡司Axiovision Rel 4.3图像分析软件处理和分析。

p70克隆:3′竞赛方法用于p70 cDNA克隆。总RNA vSMCs隔绝,鼠标或鼠肝脏或11天的小鼠胚胎使用试剂盒(表达载体)。已经没有dna RNA样本DNAse对待我(细胞装备,Ambion)和0.25μ20 g RNA反转录μL与上标二世(英杰公司)使用一个低聚糖(dT17)固定与特定的益生元GACTCGAGTCGACATCGA (dT17)。逆转录反应(2的产品μL)放大使用3′pcr引物,GACTCGAGTCGACATCGA和具体设计引物对小鼠的伴编码序列(CGCCCATCGGTATAATGAT),鼠(GCCCATCGGTTTAAGGAC),或小鼠和大鼠(GAAGCACACAAGAGTGAG)白蛋白。在互补实验,15退化寡核苷酸是为了放大p70伴编码序列(引物序列可用要求)和退火49-51°C,持续15秒,根据底漆,扩展在68°C (1 kb /分钟),并受可变数量的周期在94°C变性后(15秒)。

白蛋白吸收分析:分析在本质上是作为描述席迪圭et al ., 200417]。短暂,vSMCs种植subconfluence玻璃罩滑6-well文化板块或文化钱伯斯在DMEM 10%的边后卫。试验前,细胞生长24小时在excel 293中白蛋白的饿死。这些细胞被洗冷生长培养基或在某些实验和PBS孵化与excel 293和100μg / mL标记BSA和10μg / mL FITC-BSA 60分钟4°C的绑定。好了,在这个温度白蛋白内化并没有发生。60分钟后板被放置在有限公司₂孵化器在37°C孵化器和在不同的时间点,盘子被移除,放在冰,用冰冷的PBS洗净;100毫米Na-Ac、pH值2.5和150毫米氯化钠(去除细胞表面蛋白);和100毫米Na-phosphate pH值7.4(恢复pH值中性)。甘油5%的不变色剂添加到安装介质,以减少光漂白。荧光的细胞使用FITC监控过滤内化白蛋白形象化。DAPI染色用于染色核和线粒体DNA。图像可视化使用蔡司Axiovert倒置荧光显微镜。

统计分析。发现当时计算的重要性使用学生t以及或非参数Wilcoxon等级测试。

3所示。结果

3.1。划分vSMCs p70

女性免疫兔子KLH-conjugated 17-mer肽分子的n端对应p70生成一个亲和纯化多克隆抗体。70 kda蛋白质检测的胞质提取vSMCs这反应是增强细胞化学氧化剂(数据的挑战1(一)和1 (b))。胞质p70信号下降作为时间的函数在控制和oxidant-stimulated条件下,表明这种蛋白质的稳定性和/或胞内定位在vSMCs受到监管。30 kDa免疫反应性的蛋白质也p70检测到的抗体,但信号强度保持不变作为时间的函数或化学治疗表明这种蛋白质不太可能参与氧化还原信号。的特异性抗体确认的研究表明,孵化anti-p70抗血清,5或10μg p70 17-mer肽完全中和免疫反应性的信号(没有显示)。p70选择性地富集在BaP的核心——或者peroxide-treated vSMCs(数字2(一个)和2 (b)),这表明氧化还原压力调节这种蛋白质的胞内定位。核检测被氧化剂治疗后不久,就是明证标记信号增加早0.5小时,持续1 - 3小时。监管p70划分以来表现出程控特异性胞质或核表达持平HepG2细胞处理软面包卷(没有显示)。为了进一步评估p70的划分,进行了细胞免疫荧光测量挑战与氧化剂存在与否的防治,氧化还原状态的调制器vSMCs [18]。细胞质和细胞核周围的基底条件下观察染色vSMCs(数字3(一)和3(b))。早些时候报道,治疗软面包卷(0.3或3μ米)3人力资源增强核本地化p70(图3(c)),而预处理增强的核本地化p70 0.5毫米的防治作用和选择性中和幽默反应3μM软面包卷。总的来说,这些发现证实,调制细胞氧化剂和抗氧化剂的氧化还原体内平衡调节细胞内划分vSMCs p70和诱发瞬态核本地化。

3.2。p70克隆的努力

p70的氨基端17个氨基酸序列不同于鼠标白蛋白由两个氨基酸,但鼠白蛋白(图一模一样4(一))。因此,实验确定p70抗体识别鼠标和/或鼠白蛋白。总蛋白鼠标vSMCs隔绝,大鼠或小鼠肝脏中提取,对西方分析处理。p70抗体已经相当低亲和力鼠标白蛋白相比,老鼠(图4 (b)),符合不同的氨基酸组成的多肽序列鼠白蛋白和p70之间。令人惊讶的是,信号强度的p70 vSMCs从鼠肝、提取相媲美,这表明p70不同于鼠标白蛋白。这些研究结果的基础上,我们开始确定p70是否表达在活的有机体内或者是有限的在体外培养细胞的增长。3′竞赛方法用于p70 cDNA克隆。考虑到广泛的老鼠和老鼠之间的氨基酸序列同源性白蛋白mrna,两个特定寡核苷酸是为了增强一个地区同源物种。互补是获得总RNA vSMCs隔绝,或老鼠,老鼠肝脏使用益生元(dT)与特定的寡核苷酸固定。在第二轮PCR中,我们使用特定的寡核苷酸和锚寡核苷酸'第二链DNA合成的互补获得rna与聚(A)的尾巴。特定PCR产品是获得RNA分离大鼠肝脏,与鼠白蛋白,由测序(数据没有显示)。然而,没有具体的产品是使用RNA从vSMCs放大。相比之下,我们获得的白蛋白cDNA老鼠和老鼠与寡核苷酸识别mrna。这些控件显示高特异性的rt - pcr检测。没有特定的产品放大使用与两个不同的RNA寡核苷酸从vSMCs准备。 Although any other gene known to be specifically expressed in vSMCs, such as calponin and vSMC肌动蛋白,是放大(数据未显示)。因此,我们推测p70密码子用法可能不同于大鼠和老鼠白蛋白。为了解决这个问题,我们设计了15个不同退化寡核苷酸的编码能力p70 n端和重复PCR。没有特定的产品放大与不同的RNA准备从vSMCs或11天的老鼠胚胎(数据未显示)。我们使用RNA分离小鼠胚胎,因为p70表达式,虽然低,可以检测到西方分析(数据未显示)。因此,我们得出结论,p70不是vSMCs内源基因表达的产物。

3.3。细胞吸收p70

p70匹配裂解蛋白的氨基酸序列表明其氨基酸p70被细胞后适当的信号。以确定vSMCs内化白蛋白出现在生长培养基中,vSMCs生长在没有或293年ExCell血清培养基和西方分析处理。图5(一个)表明p70免疫反应性不是在excel中24 h,发现在不同细胞系(vSMCs Hek 293, COS7),但发现当细胞生长在中补充的边后卫。p70在COS7细胞低水平相比其他细胞类型。它已经证明了白蛋白的肺血管内皮和上皮细胞是由TGF -受体,COS7细胞表达既TGF -β我和TGF -II受体,因此有妥协的外源性白蛋白(17]。COS7细胞低水平的观察p70表明vSMCs和HEK 293细胞内化p70介质,和这个内化可能依赖TGF -β受体。感兴趣的是发现p30的免疫反应性条件下保留在细胞外蛋白从细胞外介质吸收抑制。

接下来,我们试图确定外部白蛋白由vSMCs内化。采用无血清细胞培养24小时excel 293中饿死白蛋白的细胞,然后切换到excel 293中含有2.5毫克/毫升BSA,白蛋白的量存在于细胞生长时的介质是生长在10%的边后卫的存在。图5 (b)不检测表明p70 vSMCs生长在无血清条件下24小时。酸性洗涤去除是非绑定白蛋白后,细胞相关蛋白检测早在30分钟后添加白蛋白的媒介。FITC-labeled白蛋白被用来区分表面束缚和内化白蛋白。图6显示特定的细胞外蛋白在细胞表面协会和FITC白蛋白孵化1小时在4°C。荧光模式转移到细胞的胞内加标点模式在孵化37°C,表明热敏机制参与细胞白蛋白的划分。这些发现表明surface-associated白蛋白由vSMCs积极内化和监管机制存在的跨细胞膜调节白蛋白动员。

检查p70参与氧化还原信号,我们比较cyp1a1的可诱导性BaP vSMCs生长在无血清培养基中添加牛白蛋白前后(图7(一))。Cyp1a1属于大总科的细胞色素P450 (cyp)编码heme-containing单氧酶参与类固醇和外源性物质的羟基化18]。这个本构条件下基因不表达,但明显诱导芳基碳氢化合物的配体受体(AHR),一个基本的helix-loop-helix vSMCs转录因子参与压力信号。气道高反应性相互之间的相互作用和氧化还原信号记录,这样的激活氧化还原机械抑制cyp1a1可诱导性通过氧化改性的半胱氨酸残基redox-regulated transactivation域内的转录监管机构(18,19]。因此,我们的方法使我们能够同时检查气道高反应性的完整性和氧化还原信号的函数白蛋白吸收。vSMCs cyp1a1的表达是由rt - pcr的前后BSA(2.5毫克/毫升),一个代表浓度,取得了10%的边后卫。正如所料,没有检测到cyp1a1表达式没有任何实验条件下诱导物的检查(图7(一))。BaP挑战诱导cyp1a1血清的存在与否,但基因诱导在缺乏白蛋白明显增强。接下来,我们评估的可诱导性概要nqo1、gsta1, h, vSMC基因已知监管通过氧化还原信号的激活/抑制阿瑞斯(3,7,8,18]。没有变化的本构或诱导表达nqo1观察白蛋白的存在与否。形成鲜明对比,白蛋白压抑的组成型表达gsta1和未能支持的可诱导性gsta1基因的3μM软面包卷。Ha-ras,白蛋白抑制本构和诱导表达的基因。这些发现符合白蛋白的参与交互的大分子复合物的组装与阿瑞斯专门监管区域目标基因(8]。在一起,这些发现暗示一个动态系统vSMCs负责清蛋白的细胞内定位的条件下氧化应激,和协会的白蛋白转录因子调节自适应细胞对氧化应激的反应。

4所示。讨论

p70第一次被确定为一个albumin-like蛋白质大分子内复杂的装配在战神redox-regulated基因(8]。p70作为信号传感器的作用是一致的其他albumin-like蛋白质的能力,如菲律宾固醇转达转录信号绑定到核(14]。定位在靠近4号染色体上类似趋化因子和被认为参与redox-regulated炎症信号(20.]。有趣的是,一个70 kDa albumin-like蛋白质被描述在角膜所调制的氧化应激(21]。爆炸Bach2 p70表明同源性分析,包含数控和BTB域的一种蛋白质,参与调节信号(10,14,22]。Cantin et al ., 200023),表明白蛋白调节NF -κB活化和细胞谷胱甘肽的水平。此外,血清白蛋白可以调节vSMC在颈动脉条能量代谢,细胞外蛋白被分解成副产品,刺激耗氧量,增加葡萄糖氧化24]。

更早的报告确定了一个albumin-like黑色素瘤相关抗原蛋白,B700。B700-like分子是由黑色素瘤小鼠的人类,猪,仓鼠来源(25- - - - - -33]。B700的主要结构和生化功能,以及它的在活的有机体内代谢的命运,在很大程度上是未知的。B700可以检测到细胞表面和细胞内各小鼠细胞系(室29日]。尽管哺乳动物血清白蛋白显著的同源性,由八个不同的鼠杂交瘤细胞的单克隆抗体细胞株对melanoma-specific B700交叉反应抗原只有鼠白蛋白(27]。小鼠和人黑色素瘤细胞产生的事实都B700抗原识别的鼠白蛋白抗体表明人类黑色素瘤murine-type白蛋白的存在。令人惊讶的是,爆炸搜索检索一个人类克隆是完全同源鼠白蛋白(加入AX430341)。到目前为止,没有链接p70和B700之间已经建立。我们不能克隆一只老鼠albumin-like蛋白质vSMCs使用3′竞赛表明一个独特的基因产物表达的不是vSMCs或信使rna编码p70缺乏传统聚尾巴。然而,我们的研究结果表明,可能性更大的是,细胞外蛋白以及其他albumin-like蛋白质从细胞外被vSMCs舱和参与细胞内的信号。在这种情况下,先前的研究已经表明,结肠癌、肾、肺上皮细胞和血管内皮细胞吸收白蛋白(34]。人近端肾小管上皮细胞急性接触白蛋白诱导引发基因和蛋白质表达时间和剂量依赖性的方式和刺激引发的分泌34]。这些研究者也展示了易位的NF -κB进入细胞核后接触人体白蛋白,以及增强活性氧的生产。

的核本地化p70后氧化应激的调制耦合redox-sensitive基因表达强烈引起白蛋白vSMCs氧化还原信号的关键参与者。尽管30 kDa蛋白质一直在vSMCs发现,这种蛋白质的定位是不依赖于化学氧化剂处理,表明其参与p70生物氧化还原是不可能的。在细胞培养中白蛋白可作为一种强抗氧化剂(35),被绑定,隔离和稳定各种不稳定的分子36]。这种酸性,可溶性蛋白的高亲和性和二次绑定网站和优化脂肪酸的作用,金属、二硫和其他分子在细胞代谢37- - - - - -40]。血管内皮细胞进行使用TGF -白蛋白内吞作用β受体,激活的受体刺激内吞作用导致TGF -βRII信号导致Smad2磷酸化和Smad4易位细胞核(17]。此外,白蛋白内吞作用诱发p38 MAPK的磷酸化导致激活内皮细胞增殖,减少内皮细胞凋亡41]。

5。结论和临床意义

本研究涉及白蛋白和albumin-like蛋白调节的vSMCs氧化还原信号。这些蛋白质存在于内的复杂大分子组装5′监管区域redox-sensitive似乎基因和动态响应的氧化还原状态变化后内化成vSMCs从细胞外室通过热敏传输机制。未来的研究需要确定白蛋白和albumin-like蛋白的抑制信号只涉及监管的大分子蛋白质组装在transactivation redox-regulated基因,或通过分子氧化还原传感半胱氨酸残基之间的相互作用和化学试剂。总的来说,这些发现提出重要问题的细胞和分子机制负责白蛋白的临床有效性,不仅在胶体渗透压的恢复,而且在管理患者血容量减少,休克、烧伤、手术或创伤,心肺旁路,急性呼吸窘迫综合征,血液透析。目前的研究表明,这些蛋白质的抗氧化机制可能值得进一步调查。

确认

这项工作由ES04849支持部分,ES017274, ES014443 k . s .拉莫斯。马克先生的技术贡献Holderman在项目的早期阶段和香港高博士的帮助下与图像处理。