文摘
阿尔茨海默病(AD)是一个晚发性、进行性退化性疾病,主要影响判断、情绪稳定性和内存域。广告是几个因素之间的复杂的相互作用的结果,还没有完全理解;然而,很明显,氧化应激和炎症通路是这些因素之一。65老年人(42认知的完整和23个可能的阿尔茨海默病)被选为这个研究。我们评估红细胞超氧化物歧化酶的活动、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和等离子体的总谷胱甘肽水平,α生育酚,β胡萝卜素、番茄红素和辅酶Q10。这些抗氧化参数面对原生质的水平的蛋白质和脂质氧化产品。此外,我们测量基底的表达单核细胞HLA-DR CD-11b,以及单核细胞因子摘要意思——的生产α、il - 6和TNF -α。广告病人提出降低血浆的水平α生育酚的控制相比更高的基底,也单核细胞HLA-DR表达式与更高的il - 1α生产在LPS刺激时。这些发现支持广告的炎症性理论,指出这种疾病与更高的循环单核细胞基底激活的结果α生育酚股票损耗。
1。介绍
阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病导致进步的神经元死亡和记忆丧失1]。组织病理学,这种疾病的特点是intraneuronal神经原纤维缠结(非功能性测试)(聚合的过度磷酸化形式microtubule-associated tau蛋白)和细胞外神经炎的斑块由淀粉样蛋白的沉积β(一个β)蛋白质,40-43氨基酸蛋白水解片段来源于淀粉样前体蛋白(2]。
尽管广告被认为是神经退行性疾病,炎症和氧化应激出现早,在其发病机理。一个早期的线索广告作为炎症过程是发现风湿性关节炎患者服用高水平的抗炎药物广告(发病率很低3]。炎症机制明显可能导致疾病进展和长期性,促炎细胞因子(特别是il - 1α和il - 1β)被发现在大脑中与广告当尸检分析(个人1]。许多神经炎症介质包括补充催化剂和抑制剂,趋化因子、细胞因子、活性物种,和炎症酶生成和释放的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元(4]。
然而,神经退化的炎症反应的确切含义尚未阐明。目前的假说认为,一个神经元细胞外侮辱可能引发炎症细胞因子的生产由星形胶质细胞和小胶质细胞。即,细胞因子il - 1β肿瘤坏死因子-αil - 6,可能影响神经细胞的正常行为。因此,功能障碍在这个核心层面可能会导致异常等神经纤维变性广告(5]。
研究的很透彻,有氧化应激在大脑的广告。降低血浆抗氧化水平和改变抗氧化酶活动被报道在轻度认知障碍(MCI)患者和患者在早期阶段,广告暗示活性物种之间的不平衡生产和在AD患者的血浆抗氧化防御系统。这证实了DNA的增加,脂质和蛋白质氧化产品中发现血液和脑脊液(CSF)从广告获得病人相比,对照组(6]。
同时小胶质细胞激活期间著名的广告。小胶质细胞是单核细胞谱系的骨骨髓来源的细胞,如外围组织巨噬细胞吞噬,产生活性氧(3]。然而,小胶质细胞活动的评价在广告的发展在人类患者是不可能由于其定位,从而证明需求模型,使用参数容易访问和反映小胶质细胞的激活状态。然而,研究单核细胞可能导致炎症组件的理解广告,建立,同时,使用微创技术的可能性,如采血。
暴露,广告的一个重要组成部分,包括炎症反应与活性物种释放和抗氧化水平较低有关。因此,本文旨在验证血液氧化标记和单核细胞炎症参数在老年人轻度认知障碍的存在。
2。方法
2.1。主题
病人参与本研究的最后一部分波Epidoso项目接收监控老化的一个多学科小组7]。
65老年人(平均年龄82岁)被选为这个研究。所有患者功能能力和实验室资料评估。这些老年人最初受到临床调查老年医学专家,组成的历史,体检,精神自治和评价,通过认知功能的程度。史的患者心血管疾病,癌症,或慢性炎性疾病以及个人与当前炎症改变,评估红细胞沉降率和血浆c反应蛋白的水平,并不包括在这一研究。
研究协议提交给伦理委员会UNIFESP和批准数的0859/03。所有患者或其监护人签署知情同意。
2.2。评估病人的认知能力
Minimental状态检查用于筛选认知障碍患者(8]。最高分数为30和分数低于24被认为是某种认知功能障碍的象征。
病人在MMSE得分低于24分然后用CDR测试(临床痴呆评定)9,10]。
病人被认为是认知完好无损(INT组;)当CDR < 1,而其他组患者中可能的阿尔茨海默病(AD组;)如果CDR≥1。
2.3。红细胞参数的测量
受试者的血样禁食12小时后获得的。全血是用于流式细胞术的一部分。血浆分离后,红细胞被用来测量总谷胱甘肽含量(TGSH) [11),其余hemolysate评估抗氧化酶的活动(7),Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),所有调整血红蛋白浓度。
2.4。测量等离子体参数
血浆样本存储在−后测定80°Cα生育酚,β胡萝卜素、番茄红素、辅酶Q10和维生素C (7]。提取、20μ与100年L等离子整除涨跌互现μL萃取剂(50%乙醇proanalysis (pa), 50% 1-butanol pa,包含butylhydroxytoluene 5毫克/毫升,和8μ摩尔Tocol / L作为内部标准)中提取维生素和变性血浆蛋白质。样品被漩涡然后混合30年代和000×离心机在21 g 10分钟4°C。上层清液转移到聚丙烯瓶。这种方法使用precolumn和反向阶段与氘灯C18柱和紫外检测器,用流动相组成的乙腈80%,3%甲醇(100毫米醋酸铵,0.1%三乙胺),和15%的二恶烷。流动相是通过系统由流注入1.5毫升/分钟的最大压力为350 Kgf和最低为0。波长建立了每个参数的方法和运行时间是4到6分钟。
等离子体也被用来确定硫代巴比土酸活性物质的浓度(TBARS) [7)和氧化蛋白质水平表达为等离子体金属羰基合物(12]。
2.5。单核细胞活化参数
为了评估基础循环单核细胞的激活,细胞表面HLA-DR和CD-11b水平评估通过流式细胞术,其他地方描述(13]。单核细胞是由单克隆抗体识别anti-CD14-pernidin叶绿素蛋白质(PerCP);中性粒细胞与CD66b-fluorescein排除异硫氰酸酯(FITC)标签。细胞表面分子标记anti-HLA-DR-phycoerythrin (PE)和anti-CD11b-allophycocyanin (APC);控制孵化和anti-HLA-DR-PE CD11b-APC同形像。
细胞内il - 1的生产α、il - 6和TNF -α量化了流式细胞术与LPS刺激单核细胞与莫能菌素和治疗以防止细胞因子释放(13]。单核细胞表面都被单克隆抗体染色(anti-CD66b-FITC和anti-CD14-PerCP)和细胞因子生产使用单克隆抗体anti-IL-1检测αpe、anti-IL-6-PE anti-TNFαapc或各自同形像控制。
数据获得使用FACSCalibur流式细胞分析仪和CellQuest软件(BD Immunocytometry系统)。
2.6。活性氧测定
全血样品第一次沾anti-CD14 PerCP单核细胞识别;样本随后孵化2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA),一个稳定的化合物,nonfluorescent,扩散进入细胞并水解2′,7′二氯荧光素(DCFH)。在细胞与LPS刺激,DCFH被氧化的活性物种,会对DCF大多是H2O2发出高水平的绿色荧光,通过流式细胞仪检测(14)使用FACSCalibur流式细胞分析仪和CellQuest软件(BD Immunocytometry系统)。
2.7。统计分析
正常的数据分布被Shapiro-Wilk测试评估。比较平均的结果使用学生团体进行独立样本进行测试。相关分析数据之间使用斯皮尔曼相关执行测试。所有数据被适当的处理和分析使用17 SPSS软件统计测试。
3所示。结果
没有观察到等离子体活动变化的主要红细胞抗氧化酶SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(表1)。表1还表明,总谷胱甘肽水平相似的认知完好无损(INT)和组患者可能的广告。
脂质过氧化(TBARS)和血浆的蛋白质氧化测量的循环量蛋白质羰基集团INT和广告之间没有显著差异(表2)。
在两组血浆维生素C水平相当,如表中所示2。值的循环α生育酚约低20%患者可能的阿尔茨海默病与认知正常的病人。这种差异在统计学上意义重大。这是观察到两组研究等离子体的水平相似β胡萝卜素、番茄红素和辅酶Q10(表2)。
表3表明,铜、Zn-SOD活动与过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活动的正相关关系,以及总谷胱甘肽含量。过氧化氢酶的活动,反过来,也正相关与红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性和总谷胱甘肽含量。谷胱甘肽过氧化物酶活性和总红细胞谷胱甘肽含量也有显著的正相关。相同的两个参数与血浆脂质过氧化反应产品负相关。
单核细胞的患者可能的阿尔茨海默病表示大约有70%比认知HLA-DR完整的病人。另一方面,没有差异的表达CD11b单核细胞经两组(图1和表4)。
细胞产生il - 1的比例α高出约25%可能的诊断疾病的患者相比,那些认知完好无损(表吗4)。在il - 6和TNF -α,没有在统计上有显著差异的比例细胞产生白细胞介素(图2和表4)。
(一)
(b)
(c)
单核细胞的氧化代谢研究与流式细胞仪技术显示组(表之间没有差异4)。
4所示。讨论
本研究的目的是研究广告之间的相互关系,血液参数的氧化应激,炎症指标在单核细胞活动。它遵循的推理单核细胞是大脑循环细胞类似于小胶质细胞,甚至可能被从血液到大脑组织(15在广告。小胶质细胞被认为是主要的元素的局部炎症活动伴随这种疾病(16]。这将导致局部炎症和增加活性氧的生产,导致氧化应激,这可能反映了通过循环参数(17]。
在这个工作的条件,广告是不与任何系统性氧化应激的证据。虽然红细胞抗氧化酶的活动不显示AD患者的变化,斯皮尔曼等级相关测试揭示了相互之间的正相关活动红细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和红细胞总谷胱甘肽的水平。这些数据证实的有效性假设说,身体的抗氧化系统以集成的方式共同行动。斯皮尔曼测试也发现了脂质过氧化水平之间的负相关产品,血浆谷胱甘肽过氧化物酶活性和总红细胞谷胱甘肽的水平。这一事实表明,脂质过氧化作用是影响抗氧化剂谷胱甘肽的活性peroxidase-glutathione系统实验模型。事实上,glutathione-glutathione过氧化物酶抗氧化保护网络系统是一个重要组成部分细胞(18]。作为与测量红细胞抗氧化活动,循环水平的氧化产品体内大分子的评估。为此,我们分析了水平的血浆蛋白质羰基和血浆脂质过氧化水平的产品。等离子体水平的蛋白质氧化产品不改变广告与认知正常组相比。缺乏变化中发现一些研究[18]。另一方面,一些作者发现广告患者血浆中氧化蛋白质的增加(19,20.]。这种差异可能是由于不同灵敏度的方法研究提到(二维电泳,质谱)与酶免疫分析法方法为这工作和可能的选择差异的医疗质量和喂养每个研究的目标人群。循环脂质过氧化产物浓度相当于在两组,结果同意那些常见文献[18]。一般来说,人口研究似乎享有特权地位与营养人群研究在其他地方相似的研究。除了上述抗氧化剖面,测量等离子体水平的低分子量的非酶的抗氧化剂也执行。
维生素C、值β胡萝卜素,α生育酚,这一研究获得的范围内之前被描述为一个健康的群体在那个年龄7,21]。回顾一些发表论文,由储料器和弗雷22),展示了等离子体浓度的维生素C, populational值α生育酚,β胡萝卜素从30到150μ米,15 - 40μ米,0.3到0.6μM,分别。其他作者报告,预防心血管疾病和癌症,浓度高于30μ米α生育酚结合浓度大于50μ0.4 M的维生素C,μ米β胡萝卜素和0.5μM番茄红素理想(23]。因此,老年病人的两组研究定位自己范围内其他几个研究发现分子等离子体水平的抗氧化剂。这些参数反映身体的抗氧化防御系统的一部分患者,评估组件,可以直接从食物吸收,所以通过上面提到的抗氧化剂防御进一步提升。所有低分子量抗氧化剂研究,只有维生素E组间显著不同。INT组的血浆维生素E水平高于在AD患者。
这个明显的同质性抗氧化剂的水平之间的不同群体相对于其他研究在文献[24- - - - - -27]。这一发现,正如前面提到的,强化了氧化过程过程中触发广告并不总是反映在血液循环中,即使发生,它可能只是一个指示的其他潜在机制。特别感兴趣的是广告,所表达的INT和广告组之间比较在我们的研究中,伴随着的减少循环维生素E,具有抗氧化功能以及公认的抗炎活动由于其行动在吞噬细胞信号转导机制28,29日]。不出意料,研究获得最好的结果在预防或治疗广告近年来使用α生育酚作为代理(30.]。
完成这幅画概述了到目前为止,循环单核细胞,流式细胞仪分析了炎性指标参与广告活动。为此,我们量化HLA-DR表面分子的表达水平,作为循环单核细胞的激活,指标和粘附分子参与CD-11b边缘化和单核细胞迁移的过程。结果表明AD患者循环单核细胞表面表达大量的HLA-DR即使没有外部刺激,表明更高的基底激活这些细胞的状态,确认数据在文献[31日]。增加血液中的单核细胞的激活的标志出现在患者的神经退行性疾病(32]。正如前面提到的,这些循环单核细胞可以穿过血脑屏障和迁移到脑组织,区分为小胶质细胞。自循环单核细胞的AD患者在基线比INT更活跃,可以推测,小胶质细胞来源于这些细胞对炎症刺激反应更强烈,产生更大的大脑损伤。表面蛋白的表达水平CD-11b两组是相同的,表明这些细胞的粘附和迁移潜力并不是在这个病理改变。
也通过流式细胞术,单核细胞il - 1的生产α、il - 6和TNF -α测量。这个测试的目的是评估的能力循环单核细胞刺激炎症过程通过吸引新单核细胞炎症的网站。il - 1的生产α在单核细胞从更高的广告比INT组患者。由于il - 1α是一种重要的促炎细胞因子,它是合理的假设这些单核细胞的迁移和分化产生更积极的小胶质细胞。这增加了il - 1的生产α展示了在体外在人类单核细胞谱系,当刺激Pβ,通过信号转导机制由酪氨酸激酶,它强化了上述假说(33]。
刺激外周单核细胞产生的il - 6水平在两组相似,TNF -α,同意Beloosesky et al。34]。其他作者发现单核细胞il - 6的增加生产的AD患者(35)使用,然而,不同的刺激(植物凝集素),本研究中使用(有限合伙人)。
从数据所示,它是合理的得出这样的结论:广告是伴随着循环单核细胞的激活,降低循环几个研究表明维生素eα生育酚调节炎症活动(28,36]。在我们的研究中,组患者,等离子体α生育酚也减少,显示更多的激活单核细胞响应刺激增加促炎细胞因子il - 1的生产α。这项研究指出,广告与更高的循环单核细胞基底激活的结果α生育酚股票损耗。
缩写
| 广告: | 阿尔茨海默病 |
| APC: | Allophycocyanin |
| CDR: | 临床痴呆评定 |
| FITC: | 异硫氰酸荧光素 |
| INT(警官): | 认知正常组 |
| GMFI: | 几何平均荧光强度 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| 患者: | Minimental状态检查 |
| 体育: | 藻红蛋白 |
| PerCP: | Periidinin叶绿素蛋白质 |
| ROS: | 活性氧 |
| URQ: | 右上象限。 |