文摘
反式戊烯二酸(tGA)是一种不饱和C5-dicarboxylic酸可能发现积累在戊二酸尿I型,其病理生理学仍然是不确定的。在目前的调查工作在体外增加的影响tGA含量在大鼠大脑皮层神经化学和氧化压力参数。我们观察到,Na+K+腺苷三磷酸酶活性降低tGA,但不是肌酸激酶,呼吸链复杂四世和ATP合酶的活动。另一方面,tGA显著增加脂质过氧化(硫代巴比土acid-reactive物种水平和自发的化学发光),以及蛋白质氧化损伤(含巯基的氧化组)。tGA也显著减少非酶的抗氧化防御系统(陷阱和谷胱甘肽水平降低)。我们的数据表明,tGA可能在老鼠大脑神经毒性。
1。介绍
Glutaryl-CoA脱氢酶缺乏症(人类:231670号),也称为戊二酸尿I型,是一种常染色体隐性遗传代谢疾病由于封锁的分解途径氨基酸赖氨酸,羟赖氨酸和色氨酸。第一次发现这种疾病是在古德曼et al。1)和生化特征是组织主要戊二酸和积累,3-hydroxyglutaric和一个较小的程度上反式-戊烯二(tGA)酸(2,3]。临床上,影响患者现在的巨头,进步的肌张力障碍,和运动障碍,症状明显在生命的第一年(4,5]。脑病变性后的尾状核和壳核危机和额颞叶萎缩出生时也在这些患者中常见[6,7]。高达30%的儿童提供剩余glutaryl-CoA脱氢酶活性(低excretors)存在低或检测不到戊二酸的排泄,但神经迹象可能会发现这些人相似,无论数量的戊二酸排泄(8- - - - - -11]。
戊二酸血症的神经系统改变的主要原因我还没有定义类型。已经证明,大脑组织暴露于主要代谢产物积累,戊二,3-hydroxyglutaric酸结果在会12- - - - - -15),氧化应激诱导(16- - - - - -18),和/或破坏的能量体内平衡(12,19- - - - - -24]。此外,它最近表明赖氨酸政府戊二酸尿的基因敲除小鼠模型I型(/ Gcdh−−)导致氧化损伤和能量在这些动物的大脑损伤,以及受损神经发育和认知行为25- - - - - -28]。另一方面,很少的直接毒性而闻名tGA。在这种情况下,它已被证明tGA能够抑制谷氨酸脱羧酶活动的鼠和兔大脑,人类线粒体NAD (P)(+)端依赖苹果酸脱氢酶和多巴胺在纯化beta-monooxygenase活动准备,以及诱导线粒体渗透性转换在鼠肝线粒体的准备工作,在不成熟的少突胶质细胞引发细胞凋亡,减少细胞的可行性主要文化的老鼠大脑皮层神经元(29日- - - - - -34]。
因此,本工作的目的是探讨在体外的影响t遗传算法在各种神经化学参数年轻大鼠的大脑皮层。Na的研究参数的值+K+第四ATP酶、肌酸激酶(CK)、复杂和ATP合酶活动,羰基和巯基含量、硫代巴比土acid-reactive物质(TBA-RS)水平,自发的化学发光,谷胱甘肽(GSH)含量降低,非酶的总抗氧化能力的组织(陷阱)年轻大鼠的大脑皮层。
2。材料和方法
2.1。试剂
所有的化学品都购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。tGA是溶解在一天的孵化实验中用于每个技术,和溶液的pH值调整到7.4。最后的浓度t遗传算法在中范围从0.01到1.0毫米。
进行平行实验总是消极控制(空白)的存在与否tGA也有或没有造成皮层上层清液,以检测工件的有机酸化验。因此,任何的干涉t遗传算法在生化反应用来测量参数确定。
2.2。动物
Thirty-day-old雄性Wistar鼠从中央动物屋Departamento de Bioquimica联邦大学的南里奥格兰德(UFRGS)。老鼠一直在大坝直到断奶的年龄21天。动物有免费的水和一个标准的商业食物和保持在12:12 h光/暗周期有空调恒温(221°C)殖民地的房间。“实验动物保健原则”(NIH出版数量80 - 23日修订1996年)随访所有实验和动物研究的伦理委员会UFRGS,阿雷格里港,巴西、批准实验协议。都是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。
2.3。组织氧化应激和孵化准备参数
当天的实验动物没有麻醉,被斩首,大脑迅速切除培养皿放置在冰。嗅觉灯泡,脑干、髓质、小脑、海马、胼胝体、和纹状体是丢弃,和大脑皮层剥离皮层下结构,称重和均质在10卷(1:10 w / v)的20毫米磷酸钠缓冲区,pH值7.4包含140毫米氯化钾。匀浆在750×g离心10分钟4°C抛弃细胞核和细胞碎片35]。颗粒被丢弃,上层清液,细胞器悬浮混合和保存,包括线粒体、分离和孵化20毫米磷酸钠缓冲区,pH值7.4包含140毫米氯化钾在37°C的一个小时tGA含量的0.01、0.1或1毫米。控制并没有包含这个代谢物在孵化的媒介。孵化后立即,整除被测量的值羰基和巯基含量、TBA-RS水平,自发的化学发光,谷胱甘肽浓度和陷阱。
2.4。从大鼠的大脑皮层突触质膜的制备
大脑皮层是均质在10卷0.32毫米蔗糖溶液包含消息灵通的5.0毫米和1.0毫米EDTA。匀浆preincubated在37°C 1 h没有或存在的0.01,0.1,或1毫米tGA。膜之后准备根据琼斯和Matus的方法(36)使用不连续蔗糖密度梯度组成的连续层为0.3,0.8和1.0毫米。离心后69000×g为2 h, 0.8 - -1.0毫米的分数蔗糖接口被膜酶制剂。
2.5。组织准备测定呼吸链复杂IV和肌酸激酶活动
测定的呼吸链的活动复杂IV,大脑皮层是均质(1:20 w / v)的赛斯缓冲区(250毫米蔗糖,2.0毫米EDTA, 10毫米Trizma基地,和UI·50毫升−1肝素),pH值7.4。匀浆离心机在800×g 10分钟,和上层清液保持在−70°C到用于酶活性测定。总肌酸激酶活性,测定大脑皮层是均质(1:10 w / v)在等渗压的生理盐水37]。
2.6。线粒体的准备工作
线粒体分数据Cassina准备和x射线检验38)被用于ATP合酶活性的测定,TBA-RS水平,和巯基含量。
2.7。钠的测定+K+腺苷三磷酸酶活性
Na+K+腺苷三磷酸酶活性评价根据Tsakiris Deliconstantinos [39]。释放无机磷酸盐(π)是衡量陈的方法等。40]。Enzyme-specific活动表示为nmolπ·分钟发布−1·毫克蛋白−1。
2.8。生物能学参数的测定
呼吸链的活动复杂IV决心根据斯汀et al。41稍微修改,在以前的报告中描述的细节(42]。在线粒体ATP合酶活性测定准备从大脑皮层,据斯汀等。41]。复杂的IV和ATP合酶活动计算纳摩·分钟−1·毫克蛋白−1。
CK活性测定总据休斯(匀浆43用细微的修改,所描述的舒克et al。37]。结果表示为μ肌酸的摩尔·分钟−1·毫克蛋白−1。
2.9。测定蛋白质羰基形成内容
蛋白质羰基含量、蛋白质氧化的一个标志,是衡量spectrophotometrically根据雷茨尼克先生和封隔器(44]。计算结果作为羰基集团·nmol毫克的蛋白质−1的消光系数,使用22000×106 nmol·毫升−1脂肪族腙。
2.10。含巯基的氧化(硫醇)组
这个试验是根据Aksenov和Markesbery[执行45]。的蛋白结合的含巯基的含量呈负相关的蛋白质氧化损伤。结果报告为nmol TNB·毫克的蛋白质−1。
2.11。TBA-RS水平测定
TBA-RS决心根据Esterbauer和Cheeseman[的方法46]。校准曲线进行使用1,1,3,3-tetramethoxypropane,每个曲线点作为上层清液受到同样的待遇。一些实验进行没有或减少谷胱甘肽的存在(谷胱甘肽;100年μ褪黑激素(100米)μ米),一氧化氮合酶抑制剂Nω-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME;500年μtrolox(5米)μ米)或过氧化氢酶的结合(猫;10μ·毫升−1)和超氧化物歧化酶(SOD;10μ·毫升−1)。TBA-RS值被计算成nmol TBA-RS·毫克的蛋白质−1。
2.12。自发的化学发光
样本化验为自发的化学发光的方法在一个黑暗的房间Gonzalez-Flecha et al。47]。结果计算cpm·毫克的蛋白质−1。
2.13。决心的陷阱
陷阱,代表非酶的总抗氧化能力的组织,是由测量引起的鲁米诺化学发光强度的2,2′-azo-bis——(2-amidinopropane) (ABAP)根据Lissi等的方法。48]。陷阱值被表示为nmol trolox·毫克的蛋白质−1。
2.14。谷胱甘肽水平量化
谷胱甘肽水平测量根据布朗和阿姆斯特朗(49]。一些实验研究褪黑素(100的存在与否μL-NAME(500米)μtrolox(5米)μ米),或者猫(10μ·毫升−1)+ SOD(10μ·毫升−1)。校准曲线制备标准谷胱甘肽(0.01 - 1毫米),和浓度计算纳摩·毫克的蛋白质−1。
商业解决方案的氧化谷胱甘肽(200μ米)被揭露这个解决方案还测试了1毫米tGA一小时在大脑中缺乏上层清液。后tGA博览会,7.4毫米o-phthaldialdehyde添加到瓶,混合物在室温下是孵化期间15分钟。
2.15。蛋白质的测定
蛋白质测定方法的洛瑞et al。50)使用牛血清白蛋白作为标准。
2.16。统计分析
结果提出了的意思标准差。化验中进行复制,意味着用于统计分析。数据分析使用单向方差分析(方差分析)其次是事后邓肯多个范围测试的时候是重要的。组被评为显著差异。兼容ibm PC计算机中的所有分析进行了使用社会科学统计软件包(SPSS)软件。
3所示。结果
tGA抑制Na+K+在突触质膜atp酶活性从老鼠大脑皮层。
最初,我们测试的影响t遗传算法在Na+K+从大脑皮层突触质膜atp酶活动的准备。图1显示的孵化tGA与纯化突触膜制剂引起显著抑制Na+K+atp酶活性。
3.1。t遗传算法不影响大脑生物能疗法的重要参数
我们也调查的影响t遗传算法在大脑生物能疗法的重要参数。它是观察表11.0毫米的存在tGA在孵化介质不打扰肌酸激酶,呼吸链复杂的第四,ATP合酶在大鼠大脑皮层的活动。
3.2。蛋白质氧化损伤引起的t遗传算法
然后,我们评估的影响tGA在羰基形成和巯基氧化皮层匀浆为了评估蛋白质氧化损伤。我们发现tGA激起的巯基含量明显降低皮质匀浆(图0.1和1.0毫米2(一个)),尽管它并不影响蛋白质羰基含量。此外,含巯基的内容并没有改变tGA的大脑线粒体准备(表2)。
(一)
(b)
3.3。tGA诱导脂质过氧化反应
的影响tGA的脂质过氧化反应参数TBA-RS水平和自发的化学发光研究。图2 (b)显示,tGA在1毫米水平显著增加TBA-RS皮质匀浆。类似的结果自发的化学发光。
我们还测试了抗氧化剂谷胱甘肽的影响(100μ褪黑激素(100米)μL-NAME(200米)μtrolox(5米)μ米),或者猫的组合加上SOD(10μ毫升−1每个)tGA-elicited增加TBA-RS水平(图3)。这些抗氧化剂coincubated 1.0毫米的有机酸和大脑皮层为60分钟,匀浆后TBA-RS测量的水平。我们发现谷胱甘肽和褪黑激素完全预防tGA-induced脂质过氧化增加,而猫加SOD的结合部分阻止了这种效应。Trolox L-NAME并没有阻止t遗传算法的效果。
它也被观察到tGA并不影响TBA-RS水平脑线粒体的准备工作(表2)。
3.4。非酶的抗氧化防御是下降了t遗传算法
我们评估了在体外的影响tGA在皮质谷胱甘肽水平和陷阱。我们发现这有机酸明显减少谷胱甘肽水平和陷阱在最高浓度(1.0毫米)(图进行测试4)。此外,tGA-induced效果完全阻止自由基拾荒者褪黑激素和trolox猫加SOD的结合,但不是通过L-NAME(图3)。
然后,我们调查是否tGA-induced谷胱甘肽水平降低二次氧化直接攻击。因此,我们暴露出商业解决方案的谷胱甘肽(200μ米)1.0毫米tGA 60分钟没有皮质的上层清液。这是观察到这种有机酸本身没有氧化高纯度谷胱甘肽(表吗2)。
4所示。讨论
tGA,或(E)-pentene-1 5-dioic酸,是一种不饱和C5-dicarboxylic酸,存在于病人受戊二酸尿类型。它的作用在这个有机酸尿发病机理是有争议的,因为有病人受戊二酸尿我没有礼物tGA积累(3]。另一方面,一些tGA毒性已经报道(29日- - - - - -34]。
这里我们提出数据证明Na+K+atp酶活性、关键酶对维持细胞内离子体内平衡和膜电位(51),抑制了tGA含量在0.1和1.0毫米。抑制Na+K+atp酶活性被描述在各种疾病,包括脑缺血(52,53,神经退行性54),和代谢紊乱55,56]。此外,研究表明,Na+K+腺苷三磷酸酶抑制可能导致细胞死亡可能通过激活凋亡级联和神经元损伤由于放大的钾体内平衡障碍(57]。
考虑到这种酶在高浓度存在大脑细胞膜和消耗约40 - 50%的ATP生成(58),我们的下一步是评估的影响tGA在一些重要的生物能学参数以确定ATP赤字可能会导致Na+K+atp酶活性抑制引起的有机酸。这是观察到,tGA不影响呼吸链的活动复杂IV,肌酸激酶和ATP合酶。然而,在这一点上,它应该提到的影响tGA在糖酵解克雷布斯循环酶活动,和其他呼吸链复合物活动不能排除。
这是进一步调查在体外的影响tGA对氧化压力参数,因为Na+K+atp酶活性是高度依赖的重要含巯基的群体出现在其催化部位,呈现这个酶活性极易受到氧化损伤(59,60]。我们表明,t遗传算法在体外诱导氧化损伤蛋白,观察到含巯基的含量减少,脂类,因为它增加了TBA-RS水平和自发的化学发光。有趣的是,羰基含量没有改变的存在tGA在孵化中,这表明特别是含巯基的组织倾向于蛋白质氧化损伤的有机酸。另一方面,在自发的化学发光分析主要来自所发射的光氧化脂质由于活性氧和氮物种的增加生产,和TBA-RS水平反映了丙二醛的形成,膜脂肪酸过氧化反应的最终产品(61年]。在这种情况下,它是诱人的猜测tGA氧化脂质细胞和细胞器膜,这可能导致膜流动性的一个障碍。因此,蛋白质如Na积分+K+腺苷三磷酸酶也可能受到影响,功能受损。
此外,它是发现谷胱甘肽和褪黑激素完全预防tGA-induced脂质过氧化增加,因为这些化合物阻止TBA-RS增加引起的有机酸,而猫加SOD的结合只是部分阻止了这种效应。另一方面,trolox(亲水的维生素E模拟)和L-NAME并没有阻止t遗传算法的效果。这是推测脂质氧化引起的t遗传算法由于增加活性氧发生。
然后我们评估非酶的抗氧化防御系统通过测量谷胱甘肽水平和陷阱,观察到两参数都下降了t遗传算法在体外。由于这些参数合适的评估一个组织的能力来防止和应对氧化损伤(35,61年,62年),很有可能tGA损害大鼠皮质抗氧化防御。此外,tGA-induced对谷胱甘肽水平的影响是完全阻止自由基拾荒者褪黑激素和trolox猫加SOD的结合,但不是通过L-NAME,表明主要过氧化氢、烷氧基的,羟基自由基参与谷胱甘肽水平的减少引起tGA。考虑到tGA无法氧化商业谷胱甘肽的解决方案缺乏大脑孵化的上层清液介质的情况下,这个有机酸是不太可能本身直接氧化剂代理,确凿的想法可能引发脂质和蛋白质氧化损伤通过增加自由基的一代。
自从改变了tGA TBA-RS和巯基含量整体上匀浆,包含整个细胞机械,没有观察到当有机酸是补充线粒体准备,引起的氧化应激是可行的tGA可能是由胞质机制。例如,一些公认的机制可能涉及黄嘌呤氧化酶,胞质NADPH氧化酶,溶酶体,过氧化物酶体等63年]。
氧化应激是一个总组织抗氧化失衡(酶和非酶的)防御和活性物种生成细胞导致有害的细胞状态(61年]。在这项研究中,我们发现证据t遗传算法在大脑皮层诱发氧化应激在体外,因为它增加氧化损伤和减少抗氧化防御。应当强调,大脑是高度活性物种生成增加,容易受到损害,因为它大脑抗氧化防御较低比其他组织(64年]。此外,它还可能猜测的抑制Na+K+腺苷三磷酸酶活动引起的tGA在本研究报告可以辅助增加临界含巯基的氧化组酶的催化部位。
综上所述,我们的研究结果提供证据t遗传算法是有毒的脑细胞在体外导致细胞离子平衡改变,可能神经传递,以及氧化应激在老鼠大脑皮层。我们不能在这一点上建立我们的数据是否有戊二酸尿I型的病理生理意义。tGA积累在尿液排泄(65年,66年),和排泄的酸可能会变得突出,超过3-hydroxyglutaric酸,在集酮症(4,67年]。一些研究表明,诊断的相关性t遗传算法是有限的(68年),因为tGA排泄尿液中可能不一致。然而,应该强调,即使戊二酸,已知的主要积累戊二酸尿我类型,可能会排出离散,甚至正常的浓度(低excretor病人),如上所述。
5。结论
考虑到影响病人的主要症状和体征的神经(3),如果目前的研究证实在活的有机体内在动物实验中积累和组织的患者t遗传算法,它可以推测tGA毒性可能合作的脑损伤特点戊二酸尿I型患者的影响。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突的可能性。
确认
这项工作是支持由CNPq, FAPERGS, PROPESQ / UFRGS。