文摘
目的。研究抗氧化活性的酶和氧化应激的产品在老年性白内障患者和与健康对照组比较结果。方法。六十老年性白内障患者和60年龄和性别匹配的健康对照组纳入本研究。血清样本检测获得的抗氧化的酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)和氧化降解产物丙二醛(MDA), 4-hydroxynonenal (4-HNE)、共轭二烯(CD)、高级氧化蛋白质产物(AOPP),蛋白质羰基(PC)和8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)。结果。血清SOD、氧化酶和猫活动在白内障组比对照组明显减少()。MDA的水平、4-HNE和CD在白内障患者显著高于对照组(,)。白内障患者更高水平的8-OHdG AOPP,和PC对正常人的比较组()。也没有统计学意义在抗氧化的酶的浓度和氧化应激产品不同亚型患者白内障。结论。氧化应激是一个重要的风险因素在老年性白内障的发展和增强抗氧化防御系统的可能的,以防止或延缓cataractogenesis受益。
1。介绍
老年性白内障是一种不断增长的视觉问题,占全球约50%的失明1]。流行病学研究表明,一半的普通人群65岁以上有白内障2]。在发展中国家,50 - 90%的失明是由于白内障(3]。在美国每年超过二百万镜头的抽取,执行与随之而来的重大医疗费用,消费医疗预算的12%,和一个稳定的增长预计[4,5]。全球超过5000万人患有白内障和数量将增加作为个体在当前代的成长(6,7]。目前,还没有有效的治疗白内障手术除外。由于这些原因,有很多兴趣,预防白内障替代手术。老年性白内障是一个缓慢的过程;白内障的确切机制尚未明确定义(3]。多种机制已经与白内障的发展如过度组织山梨糖醇浓度,晶状体蛋白质糖基化异常,增加眼内自由基生产地区。他们可能会导致越来越湿润的镜头,直到整个镜头失去正常的透明度和变成白色和不透明的8]。有越来越多的证据表明,氧化应激与老年性白内障的发展。生化证据表明,晶状体蛋白质的氧化损伤参与老年性白内障的起源。特别是,晶状体蛋白质受到广泛的氧化修改(9- - - - - -14]。
白内障的发病机制是受许多因素,包括氧化应激的影响。氧化应激是生产各种活性物种之间的不平衡和机体的自然保护机制的能力来应对这些活性化合物,防止负面影响。活性氧(ROS),这主要是由分子如超氧化物阴离子()、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基解毒的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)。活性氧的抗氧化系统和保存在一个特定的体内平衡的状态。当外源性或内源性因素增加氧化应激,稳态扰动,ROS变性许多基本的细胞内分子核酸,蛋白质,脂类。氧化应激被普遍认为是一个主要的启动因素在年龄相关性白内障的发展9- - - - - -14]。
考虑到这些研究,本研究旨在评估抗氧化的酶和氧化应激的水平产品在老年性白内障患者和研究氧化应激之间的关系和年龄相关性白内障。
2。材料和方法
2.1。主题
60新诊断老年性nonpathologic白内障患者招募实验小组,其中25例皮质性白内障,21个核白内障患者,和14后囊下的白内障患者。所有患者白内障严重的视觉障碍,和他们的矫正视力≤0.3和老年性白内障在至少一只眼睛;他们也没有其他眼部异常,可以解释视力丧失。这些患者来自哈尔滨医科大学第一附属医院和黑龙江省的眼科医院。我们排除了继发性白内障患者由于糖尿病,创伤,类固醇管理和其他原因。两组属于同一民族。六十健康、年龄和sex-matched受试者还包括控制。控制受试者招募受试者来到同一家医院的年度屈光检查。对照组健康状况良好,确定病史问卷,体检,和正常的临床实验室测试的结果,如葡萄糖、胆固醇、甘油三酯和血压。所有的研究对象有心血管、肝脏、胃肠,或肾功能障碍; none were alcoholic, smokers; and none used exogenous hormones. Subjects were not permitted to take any supplemental vitamin or carotenoid for more than 6-week before the start of the study and were limited to drinking less than two cups of tea per day during this 6-week period.
所有受试者接受一个完整的眼科评估,包括病史、裂隙灯活组织镜检查,Goldmann扁平张力测定法,和眼底镜检查。哈尔滨医科大学的伦理委员会已经批准了研究方案。书面知情同意从每项研究课题,和所有受试者同意给予血液样本。
2.2。血液采样
静脉(10毫升)外周血样本收集12 h隔夜空腹后从每个主题。样本放置在冰和离心机一小时在3500 rpm, 15分钟4°C,和上层清液储存在−80°C,和决心的样品发生在3个月。每个病人的样本都运行在相同的试验。
3所示。实验室分析
3.1。测定抗氧化的酶的活性
SOD活性测定使用太阳的方法等。15]。谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)活性测定方法的屋和情人节16]。过氧化氢酶(CAT)活性化验过程的基础上Aebi [17]。
3.2。测定脂质过氧化作用的产品
定量评估产品的脂质过氧化作用包括化验共轭二烯烃(CD)和丙二醛(MDA)。CD从血浆中提取使用2:1(卷/期)氯仿和甲醇的混合物。4毫升chloroform-methanol混合物,预热到45°C,添加到0.1毫升的血清。混合物被大力混合(涡旋机)为2分钟,然后用2.0毫升蒸馏水混合与0.1盐酸酸化,pH值为2.5。使用涡流仪器后搅拌,物料受到离心5分钟(2000克),和1.5毫升的底层是吸气,转移到试管中,氮气流干。1.0毫升的残留物是重组庚烷和测量spectrophotometrically 233海里。
MDA测定thiobarbituric-acid-reacting物质(TBARS)以以下的方式生产。0.1毫升的样本添加到1:1:1(卷/卷/期)三氯乙酸溶液(15%,wt /卷),硫代巴比土酸(0.375%,wt /卷),和盐酸(0.25米)。混合物在100°C加热30分钟。混合物立即冷却,然后离心5分钟(3500克)删除未溶解的材料。然后吸光度在532 nm的决心。TBARS的数量计算从比较正宗的丙二醛。
3.3。测量的蛋白质损伤产品
产品的蛋白质损伤包括高级氧化蛋白质(AOPP)和蛋白质羰基含量的产品。AOPP被Witko-Sarsat量化描述等。18]。我们把200μL血清稀释1:5在96 -磷酸盐进入每个microtitre板和添加20μL醋酸的好。的标准,我们添加了10μL 1.16碘化钾(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)到200年μchloramine-T解决方案的L(0到100μmol / L)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在井里,然后添加20μL醋酸。反应混合物的吸光度立即被阅读340 nm 200组成的一个空白μL的磷酸盐,10μL 1.16碘化钾,20μL醋酸。表示为AOPP浓度μmol / L的chloramine-T等价物。
蛋白质羰基(PC)浓度测量等离子体的光谱光度测量的试验被雷茨尼克先生和封隔器19]。简单地说,到200年μL等离子体,4毫升10更易与2,4-dinitrophenylhydrazine盐酸(DNPH) / L 2摩尔/ L是补充道。在另一个管,4毫升的2摩尔盐酸/ L是添加到200年μL等离子体(相同的病人)。管在黑暗中剩下的1 h在室温和混合了涡每15分钟。5毫升的20%三氯乙酸溶液被添加到两个管10分钟孵化在冰上,离心管的后(3000×g 5分钟4°C)。上清液被丢弃的,另一个是由洗使用4毫升10%三氯乙酸。蛋白质颗粒破碎机械和洗3次免费DNPH和脂质与醋酸ethanol-ethyl去除污染物。最终沉淀溶解在2毫升的6摩尔盐酸胍/ L和紫外吸光度纳米测量spectrophotometrically。羰基含量(nmol /毫升)计算使用。
3.4。测量血清8-OHdG 4-Hydroxynonenal
血清8-OHdG和4-HNE测定和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法按照制造商的指示。量化的8-OHdG和4-HNE是通过比较每个样本的光学密度的一个内部标准已知8-OHdG和4-HNE在不同浓度。
上述试验方差的方法< 10%。
4所示。其他生化参数
血糖、甘油三酯和胆固醇测定使用常规临床化学分析。
统计分析。数据是平均数±标准差。本研究中所有实验数据统计分析与SAS 9.13。统计学意义是使用未配对学生的评估t以及。结果被认为是重要的。
5。结果
5.1。基线特征
老年性白内障患者的临床特点和控制对象如表所示1。年龄和性别的患者没有显著不同的控制。最初的临床实验室测试值,如葡萄糖、胆固醇、甘油三酯和血压,两组之间也没有明显不同。此外,测试值都在正常范围内。
5.2。血清中抗氧化酵素的活动的结果
如表所示2,我们发现血清中抗氧化酵素的抑郁症患者。与对照组相比,SOD的活动,氧化酶,猫在白内障组低于对照组,。
5.3。结果血清中脂质过氧化的产物
如表所示3,有一个在白内障患者的血清MDA显著增加(nmol /毫升)与正常人相比nmol /毫升,。白内障患者的血清共轭二烯烃比控制(也显著增加与,)。和4-HNE的浓度显著增加患者血清中与正常人相比与,)。
5.4。结果在血清蛋白质的氧化损伤产品
如表所示4AOPP水平的增加,以及蛋白质羰基在白内障患者也被观察到。白内障患者AOPP的浓度比对照组显著增加(与;)。白内障患者明显高于蛋白质羰基与健康受试者相比与)。
5.5。结果在血清DNA损伤产品
有一个显著增加血清8-OHdG白内障患者()与正常人相比,(ng / mL,)。
5.6。抗氧化的酶亚型白内障患者的结果
我们将60老年性白内障患者分成3组,根据类型的白内障。抗氧化的结果酶亚型白内障患者表所示5。没有统计上显著的差异不同亚型的老年性白内障患者。
5.7。氧化应激的产品子类型白内障患者的结果
我们将60老年性白内障患者分成3组,根据类型的白内障。如表所示6,氧化应激的结果产品子类型白内障病人三组之间无显著差异。
6。讨论
白内障是全世界盲症和视力损害的主要原因。根据镜头内的解剖位置,白内障可以分为三个亚型:皮质性白内障,核白内障,后囊下的白内障。三个主要类型的年龄相关性白内障的患病率在世界不同地区和不同种族不同。在大多数热带地区,核白内障是最常见的。在中国北方,皮质性白内障更为普遍。后囊下的白内障的发生率低于核和皮质性白内障20.,21]。基因的差异,这些差异是否相关环境,饮食,或其他因素很难分辨;氧化损伤已被牵连为老年性白内障的发病机制的主要因素。
大量科学调查证实氧化应激在眼部疾病的存在,和ROS可能发挥重要作用的病理生理学白内障。ROS有生理功能对细胞有害在低水平,但在高水平。防止有毒活性氧的影响和调节生理效应ROS,细胞已经开发了抗氧化防御系统。系统是非常复杂的,是由抗氧化的酶(SOD、氧化酶等,和猫)和抗氧化化合物(维生素A、C、E,等等)。SOD分解过氧化氢过氧化物。猫降低H2O2水。氧化酶减少所有有机脂质过氧化物。他们保护细胞免受活性氧产生在正常代谢和氧化后的侮辱。氧化应激被定义为一个扰动之间的平衡的生产活性氧和抗氧化防御系统22]。ROS主要是线粒体内产生在晶状体上皮细胞和表面的纤维细胞、高活性和可以在活细胞损伤大分子,如脂质,蛋白质,核酸,导致诱变和细胞死亡23- - - - - -25]。
晶状体上皮细胞(LEC)是在镜头代谢活动的中心,和氧化损伤LEC扮演了一个重要的角色在许多形式的白内障的发病机制14,25]。在正常情况下,lec使用多种策略来维持活性氧在低水平保护脂质,蛋白质和核酸。这些策略包括活性氧清除剂的活化酶SOD、CAT、氧化酶和DNA修复酶。这些抗氧化的酶存在于所有部分的镜头,从氧化应激和维护保护镜头镜头清晰(26,27]。然而,有一个减少这些活性氧清除酶和DNA修复能力下降,将晶状体氧化损伤和白内障的风险(28]。它已经表明,抗氧化酶水平改变的白内障。一些报道表明,SOD的活性,氧化酶,猫减少白内障(29日,30.),但有其他报道相互矛盾的结果(31日]。在目前的研究中,我们发现在SOD的活性明显降低,氧化酶,在白内障患者的血清和猫,而与正常控制。但在子类型白内障没有显著差异。这个结果让我们认为氧化应激是白内障发展的一个重要机制。
氧化剂是高活性化合物半衰期只有秒。因此,他们的体内测定通常是不可行的。相反,脂肪、蛋白质、碳水化合物和DNA,修改后的精子,在有生之年从数小时,长至数周,可以测量与生化分析,这使得他们理想的氧化应激的标记。已研制出许多生物标志物来评估氧化应激。这些标记包括脂质过氧化反应产品(如丙烯醛、MDA、CD和4-hydroxynonenal),蛋白质氧化产物(AOPP等PC),和DNA氧化产品8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG)。氧化蛋白质,脂类,DNA被观察到在大雨的镜头32- - - - - -34]。
脂质氧化已被广泛研究,有更多的生物标志物用于评估氧化底物比蛋白质和DNA的总和。脂质过氧化是膜脂质自由基发起攻击,生成大量的活性产品,已强烈参与cataractogenesis机制(35- - - - - -37]。MDA、4-HNE和CD三种标记的脂质过氧化作用,广泛应用于大型研究。MDA是一个产品主要是不饱和脂肪酸的分解成基本链通过氧化机制。4-HNE来源于ω6多不饱和脂肪酸如亚油酸和花生四烯酸的共轭双键的物种很容易成为目标可以提取一个氢原子或添加到一个双键。CD是初始形成的脂质过氧化。一些研究显示脂质过氧化增加产品在人类的洪流的镜头。Micelli-Ferrari et al。36)报道,MDA水平上升的洪流的镜头观察白内障患者与控制。Babizhayev [37)报道,CD在大雨的镜头的白内障患者明显积累与控制。在这项研究中,我们已经表明,脂质过氧化作用的产品,MDA, 4-HNE,和CD,显著增加白内障患者的血清比较与控制。即使某些机制负责脂质peroxidation-mediated cataractogenesis并不清楚,防御机制的脂质过氧化作用可以被视为一个主要的威慑的白内障引起的氧化应激。
生物标志物的蛋白质氧化通常应用在电池的氧化应激状态的标志进行了研究。一些蛋白质的修改可能会导致氧化应激,导致形成的高分子量不溶性聚合物在大雨的常见镜头(38]。生物标志物,通常被用来估计蛋白质氧化是蛋白质羰基(PC)、金属催化氧化过程中来自氨基酸蛋白质在体外和体内,代表的直接测量这些分子的氧化损伤39]。电脑的浓度稳定,产生了量化的结果,似乎反映疾病端点在生物学上重要的方式。高级氧化蛋白质产物(AOPP),一个新的标记的蛋白质氧化,已经开始吸引各种调查人员(18,40,41]。他们中形成氧化应激通过氯化氧化剂的作用,主要是次氯酸和氯胺(由髓过氧物酶激活中性粒细胞)。他们是高架在肾功能不全患者和糖尿病42,43]。在我们之前的研究中,我们发现在糖尿病性视网膜病变(AOPP升高44]。高架标记的蛋白质氧化也与cataractogenesis有关,(45]。在目前的研究中,我们也决定AOPP的水平和蛋白质羰基,两种产品的蛋白质氧化,增加,表明有蛋白质氧化损伤白内障。我们所知,没有研究已经确定了AOPP和白内障之间的关系。我们的结果表明,AOPP是一个生物标志物用于评估氧化应激在老年性白内障。
DNA碱基非常容易受到活性氧氧化;最常用的生物标志物来评估氧化DNA损伤是8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG)。DNA氧化可产生许多氧化产品;然而,氧化8的鸟嘌呤是最常见的一种氧化事件和结果产生的诱变病变主要G-to-T颠换突变。8-OHdG被发现在一个正常的人类LEC增加文化后诱导氧化应激(46]。机台et al。47]证实白细胞8-OHdG的更高水平比对照组患者白内障患者。一些研究显示,协会的DNA损伤与人类白内障(25,48]。一个重要的研究表明DNA损伤与人类白内障协会(33]。在另一项研究中,分拣器等。49)发现有重要的DNA损伤lec老年性白内障患者。此外,DNA损伤皮质性白内障相比有显著的核或后囊下的白内障,但核之间的DNA损伤和后囊下的白内障不显著。在我们的研究中,我们发现整个海拔血清8-OHdG白内障患者,但没有统计上显著的差异在不同类型的老年性白内障患者。这些数据表明,8-OHdG水平是一个潜在的有用的白内障患者的DNA氧化损伤的标志。
7所示。结论
在目前的研究中,我们发现有一个重要的不均衡状态在老年性白内障患者血清抗氧化系统。与对照组相比,SOD的活动,氧化酶,和猫在白内障组低于对照组和氧化应激产物MDA, 4-HNE, CD, AOPP, PC, 8-OHdG显著增加在白内障患者的血清。但是没有统计上的显著差异在不同亚型的老年性白内障患者。我们的结果证实,氧化应激,呈现在所有三种类型的白内障或启动因素,参与白内障的发展,和增强的抗氧化防御系统可能有助于预防或延迟cataractogenesis。
作者的贡献
张董Chang和贵院的贡献同样这项工作。
确认
这项工作是支持的从黑龙江省卫生局(没有格兰特。2009 - 221)。从每个参与者获得知情同意。