文摘

背景。心肌缺血再灌注(I / R)损伤与生产过剩的活性氧(ROS)。低频脉冲磁场(LFMFs)已报告在内皮细胞减少ROS生成。LFMFs能否断言在心肌I / R损伤的保护作用通过ROS监管尚不清楚。方法。模拟在活的有机体内心脏I / R损伤,新生大鼠心肌细胞受到缺氧复氧(H / R)有或没有接触LFMFs。细胞活力、细胞凋亡指数,ROS生成(包括和ONOO⁻),没有生产测量控制、H / R,分别和H / R + LFMF组。结果。H / R损伤导致心肌细胞凋亡和细胞生存能力下降,而接触之前或之后LFMFs H / R损伤显著抑制细胞凋亡,改善细胞生存能力)。会抑制ROS(包括LFMFs治疗和ONOO⁻代由H / R损伤,结合降低NADPH氧化酶活性。此外,没有生产和增强/ ONOO LFMFs升高⁻平衡心肌细胞,这种保护作用通过内皮细胞一氧化氮合酶的磷酸化(以挪士)。结论。LFMFs可以保护心肌I / R损伤通过调节活性氧生成和NO / ONOO⁻平衡。LFMFs治疗可能作为一种很有前途的战略心脏I / R损伤。

1。介绍

急性冠脉综合征,包括急性心肌梗死(AMI)是一种发病率和死亡率的主要原因为患者冠状动脉心脏疾病在世界范围内(1]。有效的再灌注治疗经皮冠状动脉介入(PCI)和冠状动脉旁路移植(GABG)可以降低心肌缺血,进而减少心肌梗死面积,改善病人的预后(2]。是必要的,以恢复缺血心肌再灌注策略;然而,他们可能会导致矛盾的心肌细胞功能障碍,加重组织损伤,这一过程称为“再灌注损伤”3]。因此,一个有效的策略来保护心脏免受缺血再灌注(I / R)损伤是必要的成功治疗冠状动脉心脏疾病。

低频磁场(LFMFs)被认为是治疗和一般已经开始被越来越多的应用在医学上。许多研究已经证明,LFMFs能够影响许多生理和病理过程。LFMFs对心脏组织的保护作用对I / R损伤也被广泛研究。据报道,接触低频脉冲电磁场能减轻心肌梗塞引起的急性永久性结扎左冠状动脉前降的大鼠(4]。库里等人也报告说,磁场预处理能提高细胞生存和减少凋亡反应模拟I / R损伤H9C2细胞(5]。这些结果表明,LFMFs可能发挥积极作用在心脏组织对I / R损伤。

根据先前的研究,我们的研究旨在调查LFMFs是否能够保护心脏组织从I / R损伤和找出它的底层机制。模拟在活的有机体内心脏I / R损伤,一个在体外心肌细胞hypoxia-reoxygenation (H / R)模型建立和应用。

2。方法

2.1。心肌细胞分离、培养和鉴定(CMs)

心肌细胞的主要文化是从1-3-day-old新生儿准备Sprague-Dawley老鼠的心脏(从第四军医大学动物中心购买)。简而言之,心被从新生大鼠切除(1 - 3天)和冲洗1 - 3毫米²碎片和磷酸缓冲盐(PBS)。然后,心都碎在PBS和消化0.1%胶原酶(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在37°C 5分钟。上层清液收集与8毫升15毫升离心管中。这个过程被重复,直到组织完全溶解。悬浮液是汇集和离心机在1000 rpm 8分钟。细胞被resuspended并受微分附件在37°C 1.5 h去除成纤维细胞。CMs在高葡萄糖DMEM培养基培养(美国Hyclone)补充15% (v / v)胎牛血清(FCS)和1%的青霉素和链霉素。培养基是补充每3天。心肌细胞的主要文化被验明正身cTnI(美国Abcam)染色。通道1细胞用于进一步的研究。

2.2。缺氧/复氧条件

心肌细胞培养6天被用于治疗缺氧/复氧。缺氧,培养基取而代之的是修改后的缺氧的解决方案(氯化钠98.5更易/ L,氯化钾10更易/ L,不₂阿宝₄0.9更易/ L, NaHCO₃6.0更易/ L, CaCl₂1.8更易/ L, MgSO₄1.2更易/ L乳酸钠40更易/ L,消息灵通的20更易/ L, pH值6.8),源源不断的被水浸透的5%股份₂-95% N₂保持在3小时的文化。复氧,营养解决方案是改变高glocose DMEM培养基补充15%胎牛血清在水饱和大气5%的股份有限公司₂-95%的空气3 h。

2.3。应用低频磁场

之前或之后H / R治疗,心肌细胞暴露在低频脉冲磁场由MCY-1低频脉冲磁场治疗仪(西安世纪测控技术研究所,西安,陕西、中国)。我们生成的磁场与不同振幅的1.5公吨6.0公吨和不同正弦电流的15赫兹或20 Hz。八个不同参数的磁场应用于这个实验:1.5吨/ 15赫兹,1.5吨/ 20赫兹,3.0吨/ 15赫兹,3.0吨/ 20赫兹,4.5吨/ 15赫兹,4.5吨/ 20赫兹,6.0吨/ 15赫兹,分别和6.0吨/ 20 Hz。LFMFs治疗的时机和持续时间1 h, 3 h, h和5 h / R治疗之前或之后。在实验中,以盲目的方式执行,磁场强度监测通过一个内置的电流传感器。

2.4。评价不同LFMFs条件

确定LFMFs的最佳条件,LFMFs不同的参数应用于CMs H / R之前或之后处理如上所述。我们测量CMs的可行性评估不同LFMFs条件下的保护作用。CMs的可行性被MTT试验评估,基于转换的肝癌和四唑盐活性线粒体不溶性盐甲瓒。细胞被镀在96 -孔板的密度细胞/毫升。麻省理工是添加到每个最终浓度为0.5 mg / mL,和盘子孵化为另一个4 h 37°C。通过分光光度计甲瓒量化光谱方法在490海里。

2.5。评估凋亡的CMs

细胞凋亡指数CMs的检测是通过末端TUNEL分析使用一个商业细胞死亡检测设备(罗氏,潘茨堡,德国)根据制造商的指示。细胞凋亡指数被表示为TUNEL-positive CMs的比例总CMs。

2.6。测定氧化应激在CMs

不,ONOO⁻,测量表明氧化应激程度的CMs。没有,过氧亚硝基(ONOO⁻在CMs探测到一个商业没有和ONOO⁻美国检测设备(R&D)根据制造商的指示。进一步证明以挪士没有生产的增加,我们使用非选择性抑制剂以挪士,L-NAME(1更易/ L, Beyotime生物技术研究所,南京,中国),可以抑制生产通过以挪士才会安静下来;然后我们测试了没有,ONOO⁻生成和NO / ONOO⁻平衡有或没有L-NAME H / R条件下。

两种不同的方法被用来测量在CMs。在第一种方法中,活性氧检测设备(GenMed科学Inc .)、美国)用于量化根据指令。第二种方法是dihydroethidine(她)染色下适应先前描述的方法(6]。短暂,hydroethidine染色是用来检测原位形成的过氧化物氧化荧光微貌。心肌细胞收获和孵化与她(她1:1000稀释,Beyotime生物技术研究所,南京,中国)在37°C 30分钟。心肌细胞没有任何治疗被认为是消极的控制。在阳性对照组,心肌细胞与100年孵化μM H₂O₂30分钟诱导细胞内活性氧生成。共焦显微镜下她染色是可视化(奥林巴斯、日本)。然后,细胞图像分析与Image-Pro +软件6.0版。每个细胞的平均荧光强度和总细胞发射信号/字段计算数据分析。

2.7。NADPH氧化酶活动的量化

NADPH氧化酶活性测定用NADPH氧化酶lucigenin-enhanced化学发光工具包(GenMed科学Inc .)、美国)根据制造商的指示。

2.8。免疫印迹分析

免疫印迹进行如下。CMs从每组培养和收获在适当的时间。细胞被洗PBS和刮用裂解缓冲。总蛋白质被加载到一个sds - page凝胶和electrophoretically转移到硝化纤维素膜(美国微孔,Billerica的)。阻止5%脱脂牛奶之后,当时杂化膜在4°C一夜之间主要的抗体,anti-eNOS (1: 2000;Abcam)、anti-eNOS(磷S1177, 1: 2000;Abcam), anti-iNOS (1: 3000;Abcam)和反β肌动蛋白(1:2000;细胞信号)。膜是PBS-Tween清洗和进一步孵化二级抗体,辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术、钙、美国),在37°C为60分钟。墨迹是使用化学发光试剂开发工具包(微孔)和可视化UVP能系统。吸干密度分析视觉作品LS收购和数量分析软件之一。

2.9。数据分析

所有数据被表示为±SD和使用单向方差分析其次是图基的多重比较分析试验后测试。的值被认为是具有统计学意义。所有统计测试进行使用GraphPad棱镜软件5.0版本(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。CMs的分离、培养和鉴定

显示的细胞自发收缩跳动率为120 - 150次/分钟72 h后隔离。光学显微镜显示,自发的跳动区域主要是由相对较大的单核细胞,大约50μ米直径,梭形或多边形形态(图1(一))。CMs的进一步证实,免疫荧光染色肌钙蛋白I (cTnI)。图1 (b)显示了anti-cTnI积极彩色CMs。正如所料,绿色fluorescence-labeled cTnI和蓝色fluorescence-labeled核观察,表明成功的隔离和CMs的培养。

3.2。LFMFs增加H / R损伤后心肌细胞生存能力

MTT测定显示,CMs的生存和增殖率H / R治疗后显著下降(数字1(一)和1 (b))。接触LFMFs不同的参数和时间减毒这H / R-induced细胞抑制和细胞死亡在不同的水平。值得注意的是,LFMFs接触4.5吨/ 15赫兹,3 h之前或之后h / R治疗显著CMs对h / R损伤(数据保护1(一)和1 (b))。

3.3。LFMFs降低H / R-Induced细胞凋亡在CMs

调查的角色LFMFs H / R-induced细胞凋亡在CMs, TUNEL分析。H / R治疗显著增加的百分比TUNEL-positive细胞。与细胞治疗H / R相比,LFMFs-treated组显示凋亡细胞呈明显的下降趋势,尤其是条件下4.5吨/ 15赫兹和3 H H / R治疗(之前或之后的数字1 (e)和1 (f))。这些结果表明,LFMFs可能产生凋亡影响H / R-treated CMs。

3.4。LFMFs曝光降低H / R-Induced ROS生产

ROS是扮演着一个重要的角色在H / R损伤。在我们的研究中,被认为是ROS的关键标志。确定LFMFs暴露可能减弱H / CMs R-induced ROS生产,生产测量。肯定让真正的过氧化物生成的细胞,正面和负面的控制她染色图像中提供数据2(一个)和2 (b)。在数据显示2(一个)和2 (b),生产显著增加H / R-treated CMs与阴性对照组相比μmol / L和μmol / L,)。LFMFs + H / R组,4.5吨/ 15赫兹,3 H之前或之后H / R治疗,显著抑制生产(μmol / L和μmol / L,分别地。)与H / R组(数字2(一个)和2 (b))。

3.5。LFMFs曝光降低H / R-Induced心脏损伤通过调节生产和NO / ONOO ROS⁻平衡

没有生产显著降低H / R-treated CMs与对照组相比μmol / L和μmol / L,)。LFMFs + H / R组和H / R + LFMFs集团强劲增长没有生产(μmol / L和μmol / L)与H / R组()(图3(一个))。然而,LFMFs没有生产的影响消除L-NAME(非选择性抑制剂以挪士)。作为显示在图3(一个)与H / R + LFMF组相比,没有生产H / R + LFMF + L-NAME明显减少(μmol / L和μmol / L,)。然而,ONOO⁻生产表现出一种相反的趋势。显示在图3 (b),ONOO⁻产量显著增加与对照组相比,H / R-treated CMs (μmol / L和μmol / L,)。LFMF + H / R组和H / R + LFMF组显著抑制ONOO⁻生产(μmol / L和μmol / L,分别地。与H / R组相比)。没有比ONOO⁻在H / R组与对照组相比明显减少,而这个比例在LFMF增加+ H / R组和H / R + LFMF组相比,在H / R组。同样,LFMFs”效应增加的比率没有ONOO⁻被L-NAME逆转()。

3.6。LFMFs曝光降低H / R-Induced NADPH氧化酶活性

进一步研究LFMFs”对H / R损伤的保护作用在抗氧化压力,NADPH氧化酶活性测定。与对照组相比,NADPH氧化酶活性显著增加在H / R组(RLU与RLU。)。然而,NADPH氧化酶活性衰减下LFMFs治疗(RLU和RLU、职责。)与H / R组(图4(一))。

3.7。LFMFs CMs对H / R损伤的保护通过没有生产的增加以挪士的磷酸化而不是诱导一氧化氮合酶(间接宾语)

因为以挪士和进气阀打开都是生产所必需的抗氧化反应,我们假设以挪士发挥了重要作用调解LFMFs CMs的H / R损伤防护。确认伊诺是否与LFMFs相关的保护作用,我们测试了伊诺蛋白质在每组。免疫印迹结果显示对照组之间没有显著差异,H / R组和H / R + LFMF组(图4 (b))。免疫印迹结果表明(图4 (c)),以挪士的磷酸化(磷S1177)拒绝在H / R组与对照组相比,和LFMFs治疗增加了磷酸化以挪士()。然而,L-LAME并不影响phophorylation以挪士。量化分析,免疫印迹结果进一步证实了该假说(图4 (c))。

4所示。讨论

LFMFs已报告抑制细胞凋亡,增强细胞的生存。在目前的研究中,我们证实LFMFs能够保护心肌细胞从I / R损伤通过调节生产和NO / ONOO ROS⁻平衡。

是公认的活性氧产量是由I / R损伤和ROS升高对I / R损伤[起到至关重要的作用7,8]。ROS,包括超氧化物自由基()、氢氧自由基(哦⁻)、过氧化氢(H₂O₂)和过氧亚硝基(ONOO⁻),能够导致心肌细胞的氧化应激。氧化应激可以调解I / R损伤导致心肌细胞的功能障碍和细胞凋亡8]。的证据表明氧化应激参与了心肌损伤(9)和抗氧化制剂能减少心肌损伤(10]。我们的研究揭示了同样的结果。与对照组相比,ROS的生成在H / R组显著增加受损LFMFs-treated组。这个结果是按照NADPH氧化酶活性的变化趋势。NADPH氧化酶的活性在H / R组与对照组相比显著增加,和LFMFs接触抑制NADPH氧化酶活动在某种程度上。这个建议的数量是正相关的NADPH氧化酶的活性。

LFMFs抑制ROS的产生,从而施加在心肌细胞对H / R损伤的保护作用。然而,确切的机制LFMFs减少ROS的生成是未知的。许多研究人员认为线粒体中发挥核心作用的增加活性氧生成在I / R (11]。墨菲和Steenbergen认为线粒体电子传递活性氧的主要来源之一,在I / R损伤(7]。人工等人报道,LFMFs广场波形5吨的振幅和频率为50 Hz可能增加能源发电通过调节线粒体氧化磷酸化12]。是逻辑假设LFMFs抑制心肌细胞通过调节线粒体ROS水平功能。

除活性氧产量变化,LFMFs通过移植对心肌细胞产生保护作用以挪士的磷酸化,没有生成和调节/ ONOO⁻平衡。伊诺和以挪士对生产很重要。在心脏,以挪士是既定的酶在心肌细胞,而伊诺缺席在健康的心脏,但它的表达式是由促炎介质(13]。有必要找出负责生产的增加下LFMFs治疗。我们的数据表明,进气阀打开蛋白质的表达并没有改变在H / R或LFMFs条件。这体现伊诺激活并没有增加的来源没有生产LFMFs H / R损伤后治疗。伊诺目前被认为是作为晚期毒性的主要来源没有生产后心肌I / R损伤。Wildhirt等人报道,显著增加伊诺活动中观察到心肌区域后48 h I / R损伤(14]。在我们的实验中,心肌细胞蛋白质H / R或LFMFs治疗后立即收获。这也许可以解释为什么伊诺表达式不是高架在我们的研究中。作为我们的研究结果证明,以挪士的磷酸化和没有生产最低H / R组和LFMFs曝光恢复磷酸化以挪士,没有代在某种程度上。没有可以由以挪士和报道施加有益的影响心脏损伤(15,16),而ONOO⁻ROS的,作为一个组成部分,对心肌细胞生存能力有不利影响。没有/ ONOO的平衡⁻扮演着一个重要的角色在细胞功能和生存能力。Heeba报道,污渍可以通过调节NO / ONOO恢复内皮功能⁻平衡在体外(17]。以挪士高等人报道,磷酸化和后续增加的产量在很大程度上造成了凋亡胰岛素对大鼠心肌缺血-再灌注Sprague-Dawley[的影响18]。我们的结果是按照上面提到的研究。就像显示在我们的研究中,LFMFs p-eNOS诱导激活,导致没有一代,ONOO下降⁻生产,改变了没有/ ONOO⁻对不平衡。我们还发现L-NAME(非选择性抑制剂以挪士)可以废除的影响没有生产,也没有/ ONOO LFMFs⁻平衡。这些证实以挪士调制/ ONOO⁻平衡,介导LFMFs在心肌细胞的保护作用。然而,伊诺是没有参与LFMFs有利影响。先前的研究已经报道LFMFs的有利影响在活的有机体内和在体外。例如,Yen-Patton等人证明了脉冲电磁场可能会刺激增长的内皮细胞和血管生成在体外(19]。然而,LFMFs对生物体和细胞的影响仍然是有争议的。接触LFMFs的不利影响也被广泛报道。Goraca老鼠等人报道,接触世代(40 Hz, 7吨,60分钟/天2周)导致活性氧产量的增加心脏组织的抗氧化能力,降低等离子体而暴露于世代40 Hz, 7吨,30分钟/天2周没有改变组织活性氧含量,表明世代对ROS的生成和抗氧化能力的影响取决于其工作时间(20.]。埃姆雷等人应用脉冲方波磁场强度为1.5公吨成人Wistar鼠,观察增加氧化应激指标的水平和细胞凋亡在肝脏样本(21]。此外,LFMFs(50赫兹,1 mT)也报道损害细胞Ca⁺在精子体内平衡22]。这些观察到的差异冲突LFMFs效应可以解释为不同的曝光条件,如强度、持续时间和频率的磁场。在我们的研究中,LFMFs曝光之前或之后,既提高了心肌细胞H / R损伤的可行性,但经济复苏的程度取决于不同的LFMFs参数。

我们的研究证实LFMFs在心肌细胞的保护作用与H / R损伤,然而;LFMFs没有保护作用的线性相关系数与LFMFs曝光的强度和持续时间。在我们目前的研究中,有限的参数LFMFs被应用。之间可能会有对应的特定参数LFMFs暴露及其保护作用。进一步探索LFMFs的最优条件,特别是在临床实践中,还需要进一步的研究。

总之,我们目前的研究提供了在体外证据支持,LFMFs能够防止心肌I / R损伤通过调节生产和NO / ONOO ROS⁻平衡。这表明LFMFs可以作为一种很有前途的治疗心脏I / R损伤的策略。

利益冲突

作者声明不存在竞争的经济利益。

作者的贡献

傅赛马、东梁Zhengxun张,Yabin王院长,和人民币元进行研究和分析数据。赛,富怡,Yabin王写的论文。富怡和冯曹提供了最初的讨论,监督项目。冯赛马、王Yabin和曹编辑和审查。赛,Zhengxun张,和富易造成同样的工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81270168号,81090274,81090270,81227901,81000686),(FCao BWS12J037),由中国教育部创新团队发展格兰特(2010 cxtd01 IRT1053)和中国国家基础研究计划(2012 cb518101)。