文摘

的目标是。检查α硫辛酸的影响,抗氧化剂与线粒体超氧化物抑制特性,在促肾上腺皮质的激素——(ACTH-HT)和dexamethasone-induced高血压(DEX-HT)老鼠如果抗高血压效应是通过线粒体超氧化物抑制介导的。方法。在预防的一项研究中,老鼠收到地面食物或alpha-lipoic-acid-laced(10毫克/鼠/天)15天。生理盐水,促肾上腺皮质的激素(ACTH, 0.2毫克/公斤/天),或地塞米松(敏捷,10μg /鼠/天)皮下注射从每天5 - 11所示。在逆转的一项研究中,老鼠收到alpha-lipoic-acid-laced食品开始后4天盐水或敏捷。Tail-cuff收缩压(SBP)测量第二次每天。肾脏线粒体超氧化物研究使用(MitoSOX)红色(MitoSOX)通过流式细胞术。结果。SBP是增加了ACTH (和敏捷)。α硫辛酸就没有改变SBP。α硫辛酸预处理,SBP增加ACTH (),但不是由敏捷。α-部分阻止ACTH-HT ()和完全阻止DEX-HT (),但未能扭转DEX-HT。ACTH和敏捷没有增加MitoSOX信号。在ACTH-hypertensive老鼠,大剂量α硫辛酸(100毫克/鼠/天)没有进一步减少SBP但提高MitoSOX信号(),这表明prooxidant活动。结论。α硫辛酸通过阻碍激素性高血压大鼠线粒体超氧化物还原以外的机制。

1。介绍

高血压是一个重要的风险因素导致心血管和肾脏并发症。高血压的次要原因之一是由于内源性糖皮质激素过剩或者生产过剩或外源性糖皮质激素1]。确切的机制导致激素性高血压(GC-HT)尚未完全阐明。

有证据暗示氧化应激的发病机制GC-HT [2]。我们曾表明GC-HT老鼠被一些抗氧化剂包括预防和逆转tempol [3,4[],防治作用5,6),和叶酸(7]。在老鼠身上,高血压由于促肾上腺皮质的激素(ACTH)和地塞米松(DEX)是伴随着提高等离子体生物标志物的脂质过氧化,F₂-isoprostane浓度(3,4,7,8]。此外,增加lucigenin-enhanced化学发光也在主动脉ACTH-hypertensive老鼠(4,5]。

虽然有几种途径导致的生产活性氧(ROS),并不是所有这些都是涉及GC-HT的发病机制。NADPH氧化酶(8,9)但不是黄嘌呤氧化酶(8,10),环氧酶(11),或以挪士非耦合的形式(7,12在GC-HT)中起着重要的作用。

线粒体ROS的另一个重要来源,主要是超氧化物自由基,因此其歧化作用的产品,过氧化氢,从而形成高活性羟基自由基。它消耗了大约90%的细胞的氧气和1 - 4%的氧气反应线粒体呼吸链是不完全减少ROS (13,14]。我(NADH脱氢酶复合物)和III(细胞色素复杂)的线粒体电子传递链通常被认为是在线粒体活性氧的主要来源。(15]。线粒体活性氧的作用,另一方面,尚未评估在GC-HT模型中。

α硫辛酸,一种天然的短链脂肪酸,是许多酶复合体的重要辅助因子包括线粒体呼吸酶。体内注射α硫辛酸已被证明是一种有效的抗氧化剂。尿F₂-isprostane浓度和600毫克/天治疗后显著降低α硫辛酸在人类口头2个月(16]。除此之外,α硫辛酸也被证实可以改善线粒体功能。α硫辛酸的单剂量(100毫克/公斤i.p。)导致改善线粒体功能,由线粒体氧消耗和复杂的我,第二,第四和活动,在endotoxemic老鼠17]。线粒体膜电位是线粒体的另一个指标,因为它反映了代谢活性和线粒体膜的完整性18]。α硫辛酸补充(0.5% w / w)提高了平均在年老的大鼠肝细胞线粒体膜电位的年轻大鼠(19]。

除了改善线粒体功能、α硫辛酸治疗预防高血压和由于高血糖大鼠线粒体ROS生产过剩,因此建议线粒体活性氧的作用在这种形式的实验性高血压(20.]。线粒体超氧化物歧化酶不足已被证明是与磁化率与老化和高盐摄入高血压老鼠(21]。线粒体ROS的角色发展的生产过剩GC-HT尚未建立。

在这项研究中,我们评估了α硫辛酸对高血压大鼠的影响,以确定任何抗高血压效应是通过线粒体超氧化物抑制介导的。线粒体超氧化物抑制的潜在作用是研究在大鼠肾脏线粒体。

2。材料和方法

本研究通过动物实验伦理委员会的澳大利亚国立大学(协议号j . HB。20.05)。男性Sprague-Dawley老鼠(体重200 - 300克)分别被安置在通风塑料笼子21°之间的控制温度23°C和12小时光/暗周期。老鼠可以免费获得标准的鼠粮和自来水。在任何实验过程之前,老鼠适应于周围环境,食物和水,处理和tail-cuff血压计。

2.1。治疗方案

α硫辛酸粉(美国圣路易斯σ)是由在地面混合食物和给老鼠过夜(16小时)。生理盐水(0.9%氯化钠0.1 mL /鼠/天),敏捷(10μg /鼠/天)(David牛实验室,Mulgrave,维多利亚,澳大利亚),和促肾上腺皮质的激素(ACTH, Synacthen得宝,0.2毫克/公斤/天)(诺华制药、悉尼、新南威尔士、澳大利亚)进行了12天的天T0 T11控制4天后(C4-C1)。

前缀“P”,“T”和“C”代表预处理、治疗和控制天,分别。实验协议的时间表是总结在图1。

2.2。动物

老鼠被随机分为9组。α硫辛酸预防研究敏捷——和ACTH-HT执行。逆转的研究只是在DEX-HT DEX-HTα硫辛酸完全预防。

2.2.1。对照组

控制老鼠分配每晚30克平原地面食品/老鼠从P0(16小时)。颗粒状食品控制天,白天(大约上午9点至17点)从P0:组1。盐(),组2。ACTH (),组3。敏捷()。

2.2.2。α硫辛酸预防研究

在预防研究中,老鼠进行预处理与α硫辛酸(500毫克/公斤食品)(20.在地面食物过夜(16小时)从P0,盐水开始前4天,敏捷,ACTH注射。这一剂量(500毫克/公斤食品)是有效预防高血压和线粒体ROS生产过剩将在大鼠高血糖症(20.]。在另一组4老鼠,高剂量α硫辛酸(5克/公斤的食物,开始P0)是毕业典礼之前从T0-T11 ACTH注射:组4。α硫辛酸+生理盐水(),5组。α硫辛酸+敏捷(),6组。α硫辛酸+ ACTH (),集团7。α硫辛酸(高剂量)+ ACTH ()。

2.2.3。α硫辛酸逆转研究

逆转的研究,口服alpha-lipoic-acid-laced食品被皮下注射后4天(T4-T11):组8。生理盐水+α硫辛酸(),组9。敏捷+α硫辛酸()。

2.3。收缩压和体重测量

收缩压(SBP)是由相同的侦探更使用tail-cuff血压监视器9:00-11:00之间(美国休斯顿缉查毒品的生物系统公司)是在有意识的老鼠。动物被放置在塑料在加热板(40°C)抑制剂为40分钟。动物们被允许定居的抑制剂10 - 12分钟前SBP读数记录。几个读数得到但4中值读数的平均值,其中的差别不大于10毫米汞柱,被视为SBP。体重测量记录后隔天tail-cuff SBP测量。

2.4。胸腺体重的测量

T11的老鼠被放血牺牲下异氟烷麻醉(4%的感应和2%的维修)(Kurnell雅培大洋洲,澳大利亚)早晨,上午9点至11点之间的时间。湿胸腺重量,表示相对于体重(克胸腺重量每100克体重),被用作糖皮质激素活动的标志。

2.5。血糖测定

血液通过心脏穿刺了。一滴血放在glucometer地带(精密电极加上血糖、雅培、马、美国)和血糖浓度是读一个(MediSense 2、雅培、贝德福德,妈,美国)。

2.6。检测肾脏线粒体超氧化物

河鼠肾切除,修剪,立即冷却,在磷酸缓冲溶液单一化,过滤出单个细胞悬液。细胞和锥虫蓝染色(丙烯酰胺、Seelze、德国)和统计。总细胞计数每个样本所需的流式细胞术分析< 20%死细胞的细胞悬液。

重组的细胞被孵化MitoSOX红色染料(MitoSOX、分子探针、表达载体,美国,2μ米)和1,1′,3,3,3′,3′-hexamethylindodicarbocyanine碘(DiIC₁(5)、分子探针、表达载体,美国10海里)10分钟前37°C流分析。MitoSOX检测活细胞中线粒体超氧化物同时DiIC₁(5)决定了线粒体膜电位。所有样品都准备一式两份。验证这种技术了补充文档1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/517045。

流仪分析使用FACSort BD(美国圣何塞Becton Dickinson)流式细胞分析仪配备488海里氩和633 nm二极管激光器。近似的激发和发射(例/ Em)光谱的峰值为DiIC MitoSOX是510/580₁(5)638/658 nm。激发MitoSOX氧化产品使用波长488纳米的激光,执行和DiIC₁(5)由波长633纳米的激光很兴奋。细胞被封闭的排除细胞碎片同时覆盖大型侧散射确保包含所有从肾细胞系(图2(一个))。几何平均荧光强度(MFI)的样本得到的值减去荧光染色的标本,在该地区获得M2在图2 (c)自发荧光的清白的标本在该地区获得M1在图2 (b)。

2.7。-Isoprostane化验

血液被收集到冷冻管含有1毫克/毫升ethylenediaminetetraacetate和1毫克/毫升减少谷胱甘肽(σ,圣路易斯,美国)。等离子体免受氧化的0.2毫克/毫升丁羟甲苯(美国圣路易斯σ)和样本存储在−70°C。等离子体F₂-isoprostane使用电子捕获负离子浓度测定气相色谱分析-质谱法(如前所述)(22]。

2.8。等离子体硝酸盐或亚硝酸盐测定

等离子体硝酸盐或亚硝酸盐作为活性氮中间体的标志。它是由硝酸盐还原成亚硝酸盐使用修改后的格里斯颜色反应试验(总一氧化氮测定设备,皮尔斯单子叶植物,罗克福德,美国)如前所述[5]。

2.9。数据和统计分析

结果表示为±SEM。结果分析重复测量方差分析与温室盖斯调整multisample非球面性或未配对以及。的Ryan-Holm降压的Bonferroni过程应用于原始值来控制family-wise 1型错误。

3所示。结果

3.1。收缩压

敏捷增加SBP从来毫米汞柱(T0-T10)和ACTH从来毫米汞柱(T0-T10)。虚假的注射用无菌生理盐水没有修改SBP (T0:T10:毫米汞柱,ns)。群体间的比较表明,sbp的团体接受敏捷和ACTH明显高于saline-treated集团(每一个,)。

3.1.1。预防研究

没有重大改变的SBPα硫辛酸+生理盐水组(T0:T10:毫米汞柱,ns)。α硫辛酸预处理,敏捷并没有显著增加SBP (T0:T10:毫米汞柱,ns)。然而,有一个显著增加在SBP ACTH-treated老鼠接收α硫辛酸预处理(T0):T10:毫米汞柱,)。尽管如此,有一个显著降低SBPα硫辛酸+ ACTH集团()与ACTH-only组相比,说明部分预防由α硫辛酸。α硫辛酸增加十倍剂量(100毫克/鼠/天)没有进一步降低SBP。之间没有差异SBPα硫辛酸+ saline-treated组和saline-only组。SBP的α硫辛酸+ DEX-treated组显著低于DEX-only集团()(数据3(一个)和3 (b))。

3.1.2。逆转的研究

SBP的增加由于α硫辛酸不扭转敏捷(10毫克/鼠/天)治疗。收缩压T4天,第一天的α硫辛酸治疗毫米汞柱,在T10毫米汞柱(,ns)DEX-treated组。在预防研究中,α硫辛酸没有改变SBP saline-treated组(T4:毫米汞柱;T10:毫米汞柱,,ns)(图4)。

3.2。体重

saline-treated老鼠的体重稳步增长来g (T0-T10)。DEX-treated老鼠没有获得显著的体重(T0:T10:g, T0-T10,ns)虽然ACTH治疗导致显著的减肥(T0:T10:克,)。在这些研究中,敏捷和ACTH-treated组显示身体重量显著低于saline-treated集团()。

3.2.1之上。预防研究

在预防研究中,老鼠在生理盐水+α硫辛酸T0的稳步上涨的体重:T10:g (,)。α硫辛酸(10毫克/鼠/天)预处理并没有改变体重在盐水,敏捷或显著ACTH-treated老鼠。然而,老鼠高α硫辛酸剂量(100毫克/鼠/天)和ACTH显著降低体重相比之下,那些只靠ACTH ()。

3.2.2。逆转的研究

在逆转的研究中,老鼠在敏捷+α硫辛酸未能体重过程中研究(T4:T10:克,,ns)虽然在生理盐水+α硫辛酸体重逐步g天T4g在T10天(,)。老鼠的体重没有显著区别对待敏捷和老鼠敏捷+α硫辛酸治疗。

3.3。胸腺重量

胸腺湿重与敏捷和ACTH治疗显著降低与生理盐水()不管α硫辛酸治疗的存在()(表1)。

3.4。血糖浓度

敏捷和ACTH改变老鼠的血糖浓度。α硫辛酸增加血糖浓度的盐水,DEX-treated老鼠逆转研究。这种效应并没有观察到DEX-HT(表和ACTH-HT预防研究1)。

3.5。等离子体-Isoprostane浓度

DEX-treated组明显高于血浆F₂-isoprostane浓度与saline-treated集团()。老鼠敏捷之前使用α硫辛酸治疗显著降低血浆F₂单靠敏捷-isoprostane浓度比()。然而,没有观察到显著差异之间的DEX-HT逆转研究敏捷,敏捷+α硫辛酸组。等离子体没有明显差异₂-isoprostane浓度在大鼠ACTH治疗与生理盐水治疗。α硫辛酸(在低和高剂量)没有改变等离子体F₂-isoprostane浓度ACTH-treated老鼠(表1)。

3.6。等离子体硝酸盐和亚硝酸盐浓度

在等离子体没有没有显著差异_x浓度在敏捷和ACTH-treated老鼠而saline-treated老鼠。α硫辛酸也没有改变等离子体_x老鼠的浓度(表1)。

3.7。肾脏MitoSOX荧光

之间没有显著差异在肾脏MitoSOX荧光敏捷- ACTH和saline-treated老鼠。老鼠接受高剂量的α硫辛酸和ACTH明显高于肾MitoSOX荧光与ACTH治疗相比(表1)。

3.8。肾脏DiIC₁(5)荧光

DiIC₁(5)意味着几何荧光明显高于群体中获得α硫辛酸(预防和逆转研究)和生理盐水相比saline-only组。在肾脏DiIC没有显著差别₁(5)之间的荧光敏捷- ACTH(在低和高剂量)和saline-treated老鼠(表1)。

4所示。讨论

在这项研究中,敏捷和ACTH管理局在大鼠血压升高不增加MitoSOX平均荧光强度,表明缺乏敏捷和ACTH对肾脏的影响在肾脏线粒体超氧化物生产。线粒体超氧化物的作用GC-HT进一步测试使用抗氧化剂α硫辛酸已被证明能够抑制线粒体超氧化物生产(20.]。

抗氧化剂α硫辛酸完全阻止DEX-HT ACTH-HT但只有部分预防。这部分影响ACTH-HT并不像一百一十倍的剂量不足导致α硫辛酸剂量增加到5克/公斤的地面完全预防ACTH-HT食品没有结果。α硫辛酸在扭转建立DEX-HT不那么有效。使用相同的预防研究中使用的剂量,α硫辛酸没有反向DEX-HT。α硫辛酸的血压低影响没有直接关联与线粒体超氧化物可用性证明了肾脏MitoSOX化验。

尽管α硫辛酸已被证明是有效地改善线粒体功能和减少线粒体超氧化物在老鼠19,20.),其效果并不完全是特定于线粒体。α硫辛酸的抗氧化作用,这是由原α硫辛酸化合物及其代谢物dihydrolipoic酸,一个更强大的抗氧化剂,通过一系列的行为机制如金属螯合和直接ROS清除(23]。Dihydrolipoic酸可以再生等抗氧化剂谷胱甘肽和维生素C (23]。因此,tail-cuff血压结果需要被与其他生化分析氧化应激。在这项研究中,我们使用血浆F₂-isoprostane浓度、脂质过氧化的产物作为系统性氧化应激的标记,和肾脏MitoSOX荧光信号作为标记的组织线粒体超氧化物的可用性。

等离子体F₂-isoprostane浓度显著增加敏捷——但不是ACTH-hypertensive老鼠。后者发现与先前的调查结果,ACTH-HT与提高血浆F₂-isoprostane浓度,表明权力不足检测不同(24]。汇集F₂-isoprostane浓度从我们实验室的数据显示,ACTH-hypertensive老鼠()有显著较高的等离子体F₂-isoprostane浓度比正常血压saline-treated老鼠()[2]。的存在提高了F₂-isoprostane浓度DEX-treated老鼠再次证实氧化应激在其发病机制中的作用。α硫辛酸成功阻止了预处理增加血浆F₂由于敏捷-isoprostane浓度。然而,α硫辛酸没有影响血浆F₂在建立DEX-HT -isoprostane。

信息对线粒体ROS主要基于研究进行机械或亚线粒体粒子分离线粒体准备。机械隔离的线粒体通过差速离心自然细胞环境会影响电子传递链的生物能学。诺尔等人认为,先前声称线粒体ROS生产副产品的细胞呼吸可能只是反映了生物能量学文物随之而来机械线粒体隔离(25]。一些工人检查完整活细胞线粒体ROS为了避免这种人工制品虽然这仍然是具有挑战性的实验(26- - - - - -28]。虽然这是可能的检测过氧化氢膜渗透稳定,活细胞中线粒体超氧化物的检测变得更加困难,因为它严重影响线粒体超氧化物歧化酶,线粒体内的严格监管超氧化物清道夫。此外,他们的活动随不同的细胞系。越来越多使用的一种技术原位使用新颖的荧光染料,评价线粒体超氧化物MitoSOX。

在这个实验中,MitoSOX探测器中使用流式细胞仪检测活细胞中线粒体超氧化物。流式细胞仪的使用允许大量的细胞快速分析。同时定量测量的参数,如线粒体超氧化物和膜电位或其他标记用这项技术也是可行的。此外,细胞碎片也可以被排除在分析之外。使用这种方法,只检测荧光颗粒,可以使用MitoSOX浓度较低。同时5μM是推荐给其他荧光技术,降低MitoSOX浓度可用于流式细胞术。在我们的验证实验,我们已经表明,MitoSOX浓度超过5μ米可以导致线粒体膜电位降低,降低的吸收和荧光MitoSOX细胞制备。同样重要的是,要做平行评估线粒体膜电位,以确保细胞的治疗,包括MitoSOX染料加载本身,不动摇的线粒体细胞MitoSOX需要穿越内线粒体膜电位膜积累。否则,MitoSOX可以氧化其他细胞和线粒体超氧化物导致错误的积极信号。

在这项研究中,细胞的肾被用于以下几个原因。首先,肾脏是一个高度vascularised器官,阻力血管丰富。其次,肾脏是GC-HT相关。我们先前已经表明,ACTH-HT模型主要由皮质醇,是与肾血管阻力增加有关29日,30.]。此外,SBP的增长将在大鼠ACTH伴随着减少伊诺和肾脏以挪士基因表达31日]。

MitoSOX平均荧光强度对肾脏细胞不被敏捷,ACTH、α硫辛酸(500毫克/公斤地面的食物)。然而,α硫辛酸在5克/公斤的食物导致MitoSOX平均荧光强度显著提高。这不是与线粒体膜电位降低,增加现象导致一个错误MitoSOX信号。α硫辛酸在更高的剂量可能导致氧化应激,最有可能由于增加线粒体超氧化物的一代。α硫辛酸及其活性代谢物的作用,dihydrolipoic酸,正如prooxidants已经在文献中报道的(23,32,33]。在这项研究中,线粒体超氧化物生产的增长不太可能转化为系统性等离子体氧化应激由于缺乏变化₂-isoprostane浓度观察到这个群体,虽然这个组的样本容量非常小,可能不会有相当大的权力,以检测变化。另一个假定是线粒体内过氧化物生成extramitochondrial不是现成的结构。过氧化物,作为一个激进,不容易渗透到线粒体膜进入细胞质(34]。离开线粒体通过压敏电阻器阴离子通道和更常见的,膜间隙membrane-permeable过氧化氢歧化作用后的铜、Zn-superoxide歧化酶(34]。

较低的血压读数观察α硫辛酸+敏捷和α硫辛酸+ ACTH组织预防研究和敏捷+α硫辛酸在逆转的研究没有将敏捷和ACTH剂量不足。同样,降低血浆F₂-isoprostaneα硫辛酸+ DEX-treated组相比DEX-only集团不是敏捷管理不足的反映。证实了敏捷的有效性和ACTH交付所有组的胸腺重量显著降低接受敏捷或者ACTH由于胸腺细胞凋亡和胸腺退化引起糖皮质激素过剩[35,36]。α硫辛酸在GC-induced胸腺退化没有影响。

在这项研究中,血糖浓度是评估因为高血糖症已被证明导致线粒体功能障碍(37),是一种常见的特性在人类暴露于过量的糖皮质激素荷尔蒙。患者空腹血糖明显高于活性比缓解[库兴氏综合征38),和年龄,sex-matched控制(39]。然而,在这项研究中,ACTH和敏捷没有改变老鼠的血糖浓度,与先前的研究一致的大鼠(12]。有趣的是,α硫辛酸显著增加葡萄糖浓度在逆转的研究涉及DEX-HT及其盐的控制。α硫辛酸的敏捷增加血糖浓度,saline-treated老鼠在逆转的研究而不是预防研究表明,α硫辛酸治疗时间可能会扮演一个角色。然而,在文献中没有证据暗示α硫辛酸是高血糖的一个原因。相反,α硫辛酸在glucose-fed相同dose-prevented高血糖大鼠(40]。

我们没有先前表明,等离子体_x减少在DEX-HT [10,24]。这种减少在目前的研究中未发现敏捷ACTH-HT,有或没有α硫辛酸治疗。这可能是受到降低灵敏度的分析检测等离子体没有很低_x水平在所有的群体包括控制和DEX-treated组。在这项研究中,α硫辛酸没有改变等离子体没有_x浓度大鼠生理盐水处理、敏捷或ACTH。α硫辛酸在saline-treated老鼠的影响与其他研究中看到的结果是相一致的,给大鼠口服α硫辛酸(20毫克/公斤体重(41和1 g / L的饮用水42)没有改变等离子体_x在正常控制。在这些研究中,α硫辛酸阻止了在等离子体没有上升_x环孢霉素治疗引起的(41和胆汁性肝硬化42在抑制大鼠的肾伊诺肝总NOS,分别。然而,在目前的研究中,α硫辛酸没有改变等离子体没有_x在敏捷——或者ACTH-treated老鼠。这可能是因为不同于这些研究,敏捷和ACTH抑制以挪士伊诺在老鼠31日,43]。

总之,α硫辛酸完全阻止DEX-HT和部分阻止ACTH-HT不改变肾脏线粒体超氧化物的可用性。这表明GC-HT阻止(DEX-HT,部分逆转)通过α硫辛酸线粒体超氧化物还原以外的一种机制。

敏捷,ACTH-HT之间观察到的差异,再一次,描绘了不同的病理生理机制导致了两个高血压模型。

确认

这项工作是支持的澳大利亚国家健康与医学研究委员会项目资助(418426)。S.L.博士H是一个接受者Jacquot研究条目从澳大拉西亚的皇家医师学院的奖学金,国家澳大利亚研究生奖学金(心脏基金会奖。PB07C 3427), St George医学研究基金会建立格兰特和Ramaciotti建立格兰特(3329/2011)。

补充材料