文摘

这项工作旨在评估的心血管效应齿栗叶的可能轧机。(CSM)树皮提取特征通过HPLC-DAD-MS分析酚类成分。这项研究是使用新生大鼠心肌细胞的主要文化调查执行CSM树皮提取物的抗氧化和cytoprotective效果和孤立豚鼠左和右心房,左乳头状肌,主动脉来评估其对胆碱能和肾上腺素的反应直接影响。在培养的心肌细胞CSM树皮提取物降低细胞内活性氧的形成和提高细胞生存能力后氧化应激剂量依赖性的方式。此外,提取降低去甲肾上腺素引起的收缩(1μ米)在几内亚猪主动脉条和感应瞬态负变时性的正性肌力作用没有胆碱能的参与或肾上腺素能受体在豚鼠心房。我们的研究结果表明,CSM树皮提取物抗氧化活性和可能产生保护作用。

1。介绍

许多天然化合物具有广泛的生物活性,包括抗氧化剂,chemopreventive,抗炎、神经和心血管效应。

甜栗(齿栗叶的可能机)是一个已知的酚醛来源生物活性化合物,特别是单宁(1]。单宁被分为两组:专业hydrolysable和浓缩单宁2]。Hydrolysable单宁可以再细分为两个子类:鞣花鞣质和鞣花单宁。鞣花鞣质的核心β-penta-O-galloyl-D-glucopyranose,其他几个galloyl酯组尽管时尚有关。鞣花单宁的特点是存在两个C-C-coupled galloyl酯组2,各个/或4,6位⁴C1-glucopyranose [3]。

各种各样的结构是由于许多不同的酯和葡萄糖之间的联系的可能性。鞣花鞣质和鞣花单宁在几个物种的存在壳斗科家庭(4)如橡木和栗(1]。不同的研究表明,鞣花单宁有antiatherogenic,抗血栓,抗炎,抗血管新生的属性(5和抗氧化活性6),而主鞣花单宁代谢物,urolithins,发挥强大的抗氧化活性7]。

浓缩单宁(原花青素)低聚物或聚合物flavan-3-ol和不包含糖残基的1]。Proanthocyanidines、分类在不同的子组,都是食品的重要组成部分,丰富的红酒中,绿茶,和巧克力8]。Proanthocyanidines,尤其是那些来自葡萄种子,已广泛研究了心血管的能力减弱,脑血管和周围血管的风险。Proanthocyanidines和白藜芦醇,最近展示了负责红酒的保护作用[9,10]。心血管效应的proanthocyanidines归功于其强大的抗氧化活性,对作用于内皮依赖性舒张血管放松能力的细胞(11),抑制血管紧张转换酶(12),其抗心律失常的效果能够减少组织损伤引起的缺血/再灌注(13]。

属于甜栗是一棵树壳斗科欧洲的家庭,出现在地中海地区。煎煮的叶子已广泛应用,在民间医药,治疗各种呼吸系统疾病如哮喘,咳嗽,感冒,支气管炎,咯血、支气管的感情。Calliste等人描述CSM叶子作为天然抗氧化剂的来源(14]。最近,自然从CSM的树皮中提取已被证明对止痉挛的行动引起的胆碱能受体的调制和钙通道15]。此外,提取也对不同病毒(抗病毒作用16]。此外,甜栗木提取政府减少氧化应激引起的高n - 3多不饱和脂肪酸(n - 3 PUFA)摄入小猪和PUFA的形成的有毒产品氧化;此外,它阻止血淋巴细胞DNA损伤(17]。

据我们所知,没有数据可用于阐明CSM树皮提取物对心肌细胞的影响,和对他们的心血管效应没有数据在文献中报道。在这项研究中,我们已经完全特征CSM树皮中提取的多酚成分,我们展示了其作为抗氧化剂的能力和在老鼠cytoprotective代理培养心肌细胞。此外,直接CSM树皮提取物对心血管系统的影响已经被研究,评价的变力和变时性影响豚鼠孤立左和右心房和豚鼠乳头状肌及其活动孤立主动脉条。

2。材料和方法

2.1。材料

CSM树皮提取物提供和获得之前报道(15]。甲醇(每年),一水没食子酸(99.1%)和鞣花酸(≥96%),3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT), 2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA),和所有其他的化学物质从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。乙腈(高效液相色谱梯度年级)是从VWR(米兰,意大利),和甲酸(98% - -100%)来自默克(达姆施塔特,德国)。去离子水是获得从一个Elix 10水净化系统微孔(贝德福德,妈,美国)。

2.2。光度法测定总酚含量

单宁提取的总酚(TP)内容是由适应Pirisi等所使用的方法。18]。与甲醇提取后和一个合适的稀释的样本,TP内容由使用Folin-Ciocalteu试剂和测量吸光度在750 nm(日本岛津公司分光光度计紫外可见1204年,日本京都)。TP含量计算利用没食子酸的建设校准曲线,表达结果没食子酸的g / 100克干提取、指定为没食子酸(GAE) / 100 g。

2.3。HPLC-DAD-MS分析

干燥的提取是溶解在甲醇和分析HPLC-DAD-MS(惠普1100系列,安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA,美国)。分析实现了C18柱(Phenomenex托兰斯,CA,美国;5μ米,150毫米4.6毫米id)。流动相是由溶剂:0.5% v / v甲酸HPLC-grade水和溶剂B:乙腈。注射量20μL和0.5毫升/分钟的流量。检测器波长被设定为254海里。所有的分析都是在室温下进行。

ESI接口使用的下列条件:干燥气流,9.0升/分钟;喷雾器的压力,35 psig;气体干燥温度,350°C;毛细管电压3000 V;fragmentor电压60 V。

酚醛和丹宁酸的化合物被确定比较保留时间和紫外光谱检测到山峰的女士与商业标准(高卢和鞣花酸);如果没有可用的参考化合物,初步鉴定是由分析和比较洗脱顺序和光谱和光谱信息与文献数据。每个化合物的量化进行了使用8回归曲线获得使用高卢或鞣花酸。

单宁等酚类化合物被量化为g的鞣花酸没食子酸/ 100 g, g / 100克干提取和表示,分别为鞣花酸当量(运算单元)/ 100 g和没食子酸当量(GAE) / 100 g。

2.4。细胞培养和治疗

新生儿心脏细胞被孤立为之前报道(19]。调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH出版85 - 23,1996年修订)和我们的机构伦理委员会批准。简单地说,细胞,获得2-4-day-old心室的老鼠,生长,直到完全融合。细胞治疗与不同浓度的提取(1 - 500μg / mL) 24 h,并控制细胞治疗等效DMSO溶液的浓度。

2.5。测定细胞生存能力

心肌细胞生存能力的控制和治疗细胞测量使用MTT试验之前报道(20.]。流式细胞术分析细胞与膜联蛋白V共轭double-labelled藻红蛋白(膜联蛋白V-PE)和7-Amino-actinomycin D (7 AAD)和立即分析番石榴EasyCyte流式细胞分析仪(番石榴技术,海沃德,CA)按照制造商的指示在报道21]。可行的细胞的百分比报告对细胞的总数。

2.6。细胞内活性氧的检测

形成的活性氧(ROS)是评估使用荧光探针,DCFH-DA,之前报道(22]。简单、控制和治疗细胞用PBS然后孵化5μ在PBS M DCFH-DA 30分钟。DCFH-DA去除后,细胞与100年孵化μM H₂O₂30分钟。细胞荧光从每个使用微型板块荧光谱仪测定纳米和海里)。细胞内抗氧化活性的百分比表示为抑制细胞内ROS产生的H₂O₂曝光。

2.7。测定Cytoprotective效应

针对H Cytoprotection₂O₂全身的细胞损伤评估使用MTT试验之前报道(20.]。控制和治疗细胞暴露于100年μM H₂O₂在PBS 30分钟之后,细胞被更改为一个新鲜的培养基。24 h后,MTT被添加到媒介的最终浓度为0.5毫克/毫升和孵化1 h在37°C。添加DMSO溶液溶解甲瓒晶体,吸光度测量在595 nm使用标VICTOR3 V Multilabel计数器。数据表示为可行的细胞的比例对控制时间。

2.8。动物

在这项研究中使用的所有动物被安置和治疗根据指令保护动物用于科学目的(指令2010/63 /欧盟的欧洲议会和理事会)和WMA声明动物在生物医学研究中使用。随后的过程和动物保健的指导方针都是大学的伦理委员会批准的博洛尼亚(意大利博洛尼亚)。短暂,豚鼠(男性和女性,300 - 400 g)来自查尔斯河(足球、科莫、意大利)被安置在一个受控环境12:12 h光暗周期22°C和饮食提供食物和水随意。

2.9。豚鼠心房准备和治疗

实验设置如前所述[23]。心房肌准备被用来检查CSM树皮中提取的变力和变时性的活动(0.01 -10毫克/毫升),溶解在生理盐溶液(PSS)。在一代的累积量效曲线,下一个更高浓度的提取是添加后才准备达到一个稳定状态。进行了一些实验用单一提取浓度(1毫克/毫升)。

2.10。毒蕈碱的活动

决定在豚鼠自发跳动的心房。组织稳定后,累积的日志量效曲线受体激动剂氯化氨甲酰胆碱(CCh) (0.01 - 1μ建立了M)。孵化后与对手阿托品(1μ米)或同时阿托品管理局(1μ米)与提取(1毫克/毫升)一个新的量效曲线了。平行实验运行没有对手。一组实验进行了使用单一浓度的提取(1毫克/毫升):特别是负变时性的活动是由一个单剂量诱导的提取。与阿托品后孵化(1μM)为30分钟,一个新的效应与CSM树皮提取物(1毫克/毫升)。

2.11。肾上腺素能活性

决定在豚鼠左心房1 Hz。组织稳定,收缩后甜栗提取(1毫克/毫升)。孵化后与普萘洛尔(10⁻⁶米)为30分钟,一个新的收缩提取(1毫克/毫升)。同时再现性的收缩了第一个第二个试验没有心得安(10⁻⁶M)确认。

2.12。豚鼠乳头状肌准备离开了

实验设置如前所述[24]。乳头状肌准备被用来检查性肌力活动CSM的树皮提取物(0.01 -10毫克/毫升),溶解在PSS。在一代的累积量效曲线,下一个更高浓度的提取是添加后才准备达到一个稳定状态。进行了一些实验用单一提取浓度(1毫克/毫升)。

2.13。几内亚猪主动脉条准备

实验设置如前所述[24]。平衡期之后,天竺鼠主动脉条收缩的洗PSS包含80毫米氯化钾(K的克分子数相等的替换⁺对Na⁺)或1μ去甲肾上腺素(NA)。收缩达到高原时,不同浓度的提取(0.01 -10毫克/毫升)添加了累计允许任何放松获得力量的均衡水平。进行了一些实验用单一提取浓度(1毫克/毫升)。

2.14。统计分析

数据从老鼠新生儿心肌细胞细胞培养获得了美国南达科他州意味着±和分析单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett测试,和值小于0.05被认为是重要的。数据心房、乳头状肌和主动脉条被学生的分析t -测试和作为意味着±S.E.M. [25]。值小于0.05被认为是重要的。药物的效能定义为电子商务₅₀计算从日志量效曲线。拮抗剂活动表示为p计算从席尔德情节26),限制坡度−1.0 [25]。三个不同的对手使用浓度,每个浓度测试至少四次。

3所示。结果

3.1。CSM树皮中提取的特征描述

CSM树皮中提取的TP内容是首先由Folin-Ciocalteu方法(27]。

基于文献数据(28- - - - - -31日)、没食子酸被选为参考标准Folin-Ciocalteu TP含量的分光光度法。TP的内容检查CSM树皮提取物是干重的54.9%提取的GAE (g / 100克)。提取的特征是实现了高效液相色谱法。初步识别的单宁和酚类化合物的基础上保留时间,分子量、光谱性质,和女士碎片特征(ESI -模式)。单宁和酚类化合物的数量表现为CSM树皮提取物,包括鞣花酸、没食子酸和4鞣花单宁(vescalin、castalin vescalagin和castalagin)(图1),据报道在表1。

三个主要组件vescalagin, castalagin和鞣花酸。其他一些小的化合物,在跟踪发现水平,5 -o5-dimethoxy-4-hydroxyphenol -galloylhamamelose, (3) 1 -o- - - - - -β- d - (6′o-galloyl)配糖体异构体,米丹宁酸,kurigalin异构体和chestanin报道在表与其他化合物1。

分离的总量鞣花单宁和酚类,表示为鞣花酸,/ 100 g, g实验性自身免疫性脑脊髓炎时的两倍多(GAE)如果表示为没食子酸(g / 100克)。

3.2。抗氧化和Cytoprotective CSM树皮提取物对培养大鼠心肌细胞的影响

甜栗树皮提取尤其富含单宁;因此,我们调查的能力从氧化应激中提取保护培养的心肌细胞。图2所示,MTT (a)和(b)流式细胞术分析,CSM提取不施加任何毒性作用主要培养心肌细胞对一系列浓度(1 - 100μg / mL)。

显著降低ROS生产,被DCFH-DA试验,观察CSM树皮extract-treated接触后心肌细胞H₂O₂(图3)。提取的能力减少ROS生产已经检测到1μ克/毫升浓度。

车辆控制包含等效的DMSO (0.2% v / v)没有任何明显的差异相比,细胞暴露于H₂O₂。extract-treated细胞ROS水平显著降低后24 h剂量依赖性的方式。

与100年培养的心肌细胞μM H₂O₂30分钟导致细胞生存能力明显降低(图4),如被MTT还原试验。心肌细胞的治疗CSM树皮提取物在50 - 100的浓度μg / mL 24 h之前h₂O₂接触部分免受氧化损伤,如图所示的显著增加细胞生存能力对H₂O₂处理细胞。

3.3。CSM树皮提取物对豚鼠的影响孤立左和右心房和乳头状肌

CSM树皮提取测试在豚鼠左心房和左乳头状肌驱动在1赫兹和自发右心房跳动来评估其变力和/或变时性的影响,分别。一剂(1毫克/毫升)的CSM树皮提取产生正性肌力作用在左心房,相应的心率。提取(1毫克/毫升)透露正性肌力作用也在左边乳头状肌刺激1 Hz(表2)。

所有的报道影响是可逆的30分钟后清洗。评估时间的同时正性肌力和消极的对左和右心房变时性的影响,分别测量单剂量的影响(1毫克/毫升)每5分钟30分钟(图5)。

内在的正性肌力活动30分钟后降低了约50% (从%,%),而负变时性的效应在同一时间(仅略有下降从%,%)。

累积浓度效应曲线获得的数据(数据未显示)表明内在活动不超过50%除了积极inotropy乳头状肌(表3)。

澄清的机制参与观察到负变时性的效果,为了阐明胆碱能系统的影响,自发地击败右心房是对提取的存在和没有1μM阿托品。

阿托品的存在没有修改的影响提取心率或inotropy。此外,p阿托品没有改变的提取(表的存在4),表明变时性的或不是由胆碱能受体介导调制变力的影响。

之前因为它已经表明,天然提取板栗是能够阻止肠道M₃胆碱能受体非竞争性可逆的方式(15),可以假设提取可以区分这两个胆碱能受体亚型。

作为一种正性肌力作用证明了CSM树皮提取物对豚鼠左心房驱动1赫兹,肾上腺素能受体的参与是验证。CSM的正性肌力作用树皮提取物(1毫克/毫升)在左心房也坚持1的存在μ米普萘洛尔(图6)。

3.4。CSM树皮提取物对豚鼠的影响主动脉条

CSM树皮提取物对豚鼠主动脉条测试,在80毫米氯化钾或1μM NA,评估vasorelaxant活动。CSM树皮提取物(1毫克/毫升)解痉的活动对NA约为50%,小于20%氯化钾(图7)。冲刷后的提取氯化钾诱导的收缩和NA是类似于受体激动剂诱导的孤独。

提取对KCl-induced收缩的解痉药活动评价累积剂量反应曲线。氯化钾的曲线收缩的CSM树皮提取物(1毫克/毫升)与控制(图没有明显不同8)。

4所示。讨论

许多研究心脏功能障碍之间的关系描述和启动因素如吸烟、过度饮酒、饮食、肥胖、和压力。在一些情况下,其中一个的影响因素单独或与他人相结合,为动脉粥样硬化和高血压,代表一个不同的心脏的发展障碍的第一步如心绞痛、梗塞、心律失常或心脏衰竭(32,33]。

不同的方法通常应用于降低心血管风险。旁边的早期识别风险因素,生活方式和营养习惯预防或应对心血管疾病中发挥基础性作用。流行病学研究显示之间存在负相关的摄入水果和蔬菜,富含抗氧化植物化学物质,和患心血管疾病的风险34,35]。许多植物化学物质已被证明发挥抗氧化作用,抵消许多oxidative-stress-related的疾病,如心血管疾病(36,37]。

栗子树的树皮和木材是一种单宁的重要来源。不同的齿栗叶组织富含简单酚醛树脂和单宁和栗木比板栗果实含有更高水平的酚醛树脂(38]。提取用于这项研究已经证明含有超过10% (w / w)的酚类化合物,其中单宁vescalagin和castalagin更具代表性。之前它已经证明了许多鞣花单宁,包括castalagin vescalagin,有强大的抗肿瘤,抗氧化,抗菌和抗疟,属性(6,39- - - - - -41]。

单宁,包括原花青素,对许多生物效应(42]。单宁对双动对心血管系统:直接作用于心脏和血管调节心血管参数和间接通过其抗氧化活性。事实上它们能够抑制脂质过氧化反应和脂氧合酶体外清除自由基,如羟基、过氧化物、过氧化氢(43]。而抗氧化浓缩单宁的影响已经被一些研究报告(44),几乎没有信息水溶性单宁的抗氧化活性45,46]。Hydrolysable单宁,高度的羟化芳香功能,显示抗氧化活性高(47]。

在许多国家,碧萝芷,基于做准备松果体maritima树皮中提取,用作心血管食品补充剂(48]。这个产品的主要生物活性化合物是寡聚proanthocyanidines和酚醛树脂单体。

摘录齿栗叶的可能树叶已被证明施加不同的体外和体内的抗氧化作用模型系统和有用的预防光老化和oxidative-stress-mediated皮肤病(14,49]。

最近Frankic和Salobir [17)演示了一个猪的许多生物标记物的氧化应激水平降低美联储栗木提取补充饮食和暴露于n - 3 PUFA-induced氧化应激。此外先前的研究已经证明了板栗的能力(齿栗叶crenata)内壳层提取保护从t-BHP-induced HepG2细胞氧化应激(50]。

本文首次报道了cytoprotective和CSM树皮提取物抗氧化活性的心脏细胞。

CSM树皮提取物在这项研究中没有任何毒性作用在范围广泛的培养心肌细胞浓度(1到100μg / mL),导致一个重要的防止H₂O₂全身的细胞毒性和细胞内活性氧的产量下降。这并不令人惊讶,由于高酚醛和单宁提取的内容。

此外,体外研究已经进行的保护作用更好地阐明CSM树皮提取使用不同的组织准备工作。

在孤立的心房准备,提取同时感应瞬态负变时性的效应和正性肌力作用。乳头状肌,正性肌力作用是持久的和可能是有用的为心室心脏功能的支持和防止血液进入心室[停滞51]。

据我们所知只有很少有研究调查植物提取物的心血管效应。Ojewole et al。52]证明了水叶中提取的Persea美国轧机。施加负性肌力和负变时性的影响豚鼠孤立电动左和自发击败右心房肌准备,分别。此外,Persea美国轧机。叶提取液减少,浓度的方式,正性肌力和变时性反应分离的豚鼠心房肌条由去甲肾上腺素和钙。根据他们的发现,作者得出结论说Persea美国轧机。叶子可以作为一个自然的援助在原发性高血压。

同样Musabayane et al。53]显示浓度负性肌力和变时性影响老鼠孤立电动左和自发击败右心房的准备工作蜡菊谷神星叶子ethanolic提取。作者也证明了蜡菊谷神星叶乙醇提取物诱导vasorelaxant影响主动脉条准备及其这些影响都是由一氧化氮和独立的机制。

在我们的研究中我们已经证明了变时性和变力的影响提取都不是由于心脏功能监管的主要受体机制(即。毒蕈碱的米₂和β肾上腺素能受体)。这些影响是共享的,即使在较小程度上,与著名的数字获得药物紫花洋地黄),展品正性肌力和没有涉及任何毒蕈碱的和负变时性的行动β肾上腺素能受体机制。

此外,CSM树皮中提取并没有显著改变血管收缩引起的80毫米钾或1μ去甲肾上腺素。

在总结数据报告表明,CSM树皮中提取具有重要的抗氧化剂和cytoprotective效果,也能够调节一些重要的心脏功能。尽管限制派生通过使用不同的细胞/组织模型,结果标明CSM树皮中提取的营养价值,可以建议其作为营养补充剂预防心血管疾病。

虽然还需要进一步的研究来确定生物化学和药理机制除了正性肌力和消极变时性的影响施加的CSM树皮提取物,这种天然提取物可以作为膳食补充剂宝贵支持,结合有益的直接作用于心血管功能和较高的抗氧化活性。

确认

作者感谢亚历桑德罗·Casoni动物保健。他们也感谢基金会del Monte e di博洛尼亚拉文纳其金融支持。