文摘

背景。对自由基的作用和氧化应激信号在肉芽肿的成熟和决议。我们旨在研究自由基的活性氧化过程的动力学BCG-induced广义小鼠肉芽肿病。方法。慢性肉芽肿性炎症诱导的雄性BALB / c小鼠静脉注射卡介苗,和氧化应激的产生自由基氧化过程(活动)和肺组织学变化,肝脏、腹膜渗出物测定3,感染后30、60、90天。结果。结核性肉芽肿数值密度和直径不断从30天增加到90天,和肉芽肿内的巨噬细胞含量逐渐减少,相应海拔在上皮细胞的数量。的活动在肝脏(即自由基氧化过程。,the intensity of the homogenate chemiluminescence) reached a maximum at postinfection day 60 and subsequently began to decrease. The peak generation of reactive oxygen species by phagocytes in the peritoneal exudate (measured using flow cytometry) was also shifted in time and fell on day 30.结论。H的稳态浓度的上升₂O₂在小鼠的肝脏BCG-induced肉芽肿病与当地H₂O₂生产的吞噬细胞,减少广义炎症的严重程度之前解决局部炎症。

1。介绍

的产生而导致的炎性肉芽肿吞噬细胞的增殖和转换是许多传染性的标志(如肺结核(TB)和兔热病)和非传染性的(例如,矽肺、石棉肺和肉芽肿性肝炎)疾病(超过70疾病实体)1,2]。必要时隔离外国对象,包括微生物、肉芽肿性炎症一般认为出现;这些对象不能被吞噬的正常过程(后续退化)。然而,研究人员面临许多复杂的问题,研究这一现象。例如,特发性肉芽肿的外观的诱导物未知自然是结节病的特色,韦格纳氏病和其他疾病(2,3]。另一个问题是几乎完全缺乏有效的工具和技术来影响肉芽肿流程;现代医学提供的任何东西是必不可少的治疗切除一个诱导物(感染性肉芽肿)或手术切除受影响的器官。另一个问题是高不可预测性在开发和炎性肉芽肿的决议;尽管这些过程取决于诱导因素,尤其是个人。如果我们考虑granulomogenesis一般的问题,至少研究话题的参与活性氧和氮物种(罗恩)作为进化古老的内部机制和细胞间的监管;这个监管协调(通过氧化还原信号)细胞迁移、合作、功能性活动,生命周期,扩散和死亡4]。

感染性肉芽肿病的一个经典例子是结核病,世界上最常见的传染病。其发展的核心表现是持久性的病原体结核分枝杆菌,主要在巨噬细胞细胞的空泡的设备,专门从事抗菌保护,其中90%是由氧依赖性机制(3]。有许多研究,同时考虑自由基抗宿主吞噬细胞保护的机制和方法结核分枝杆菌避免了罗恩攻击(3,5- - - - - -7),以及氧化应激的发展。然而,到目前为止,没有有效的redox-dependent方法治疗结核病或控制结核分枝杆菌感染。结核病的高发病率与NAD (P) H氧化酶基因缺陷(7)和一氧化氮的前景目标交付使用可吸入微粒不含捐助者(8)表明需要更好的理解涉及罗恩在自由基的作用过程结核分枝杆菌坚持在结核肉芽肿病的动力学。

第一阶段研究氧化应激的角色和活性氧(ROS)感受器和监管者的肉芽肿性炎症,我们试图研究自由基的活性氧化过程的变化在慢性BCG-induced动力学广义肉芽肿病相比,老鼠和这种变化的形态学变化。

2。材料和方法

2.1。动物模型

动物保健委员会批准的临床和实验医学研究中心的实验协议。雄性BALB / c小鼠(重量:在18到22岁的g,年龄:2个月)是临床免疫学研究所的某人购买公羊(俄罗斯新西伯利亚)。老鼠被安置在一个环境控制温度和控制光线和分成八组(在每组)如下:四组模型的广义结核性肉芽肿病(3、30、60和90天后一个注入0.5毫升的卡介苗(Microgen、俄罗斯)在1毫升的盐水到尾静脉)和四个对照组(3、30、60和90天后一个注射1毫升的盐水到尾静脉)(1,2]。动物是由颈椎脱位称重和牺牲。腹膜白细胞样本获得的评估这些细胞的氧化代谢。肝脏和肺很快被删除,重,加工的组织学检查和制备肝匀浆。这些器官被选,因为他们是最常受影响的广义结核病和它们还含有最大的隔间单核吞噬细胞系统的细胞,形成肉芽肿的基础。

2.2。组织学检查

肝脏和肺碎片在中性10%福尔马林固定,脱水升酒精的解决方案,并嵌入到石蜡。部分(4 - 5μ米厚)是用苏木精和伊红染色和Van Gieson /弹性蛋白技术,研究使用光学显微镜(AxioImager A1,卡尔蔡司,德国)。Ziehl-Neelsen特定组织化学染色的染色用于可视化牛结核分枝杆菌在组织。使用形态测量学方法(AxioVision软件,rel。4.8),数值颗粒的密度和直径测定;这些参数被用作结核的形态标准活动。这个活动是由化学引诱物梯度引起的,这是由活着的分枝杆菌(免费和持续的巨噬细胞)。颗粒大小显示化学引诱物潜在的价值(1,2]。

2.3。自由基氧化过程的活动

2.3.1。化学发光(CL)

肝脏与生理盐水洗净,切碎的剪刀,和均质在冰上Potter-Elvehjem组织磨床5卷(w / v)的汉克斯平衡盐溶液无酚红(hbs)(200毫克/毫升)。后记录的背景CL测量电池在37°C chemiluminometer(光子,俄罗斯)2分钟,2毫升的肝匀浆放入试管,然后孵化2分钟,之后自发的CL测量2分钟。之后,0.1毫升的100 nM鲁米诺(美国赛瓦,德国)的解决方案是注射,luminol-amplified CL (LACL)测定2分钟,0.1毫升的H₂O₂最终的解决方案是添加(浓度39.5毫米),和H₂O₂全身luminol-amplified CL (H₂O₂-LACL)测量。CL强度在任意单位(1 a.u表示。= 5冲动/ s),每个值代表平均。测量电池的平均背景CL强度从平均的值减去自发和luminol-amplified化学发光。

2.3.2。流式细胞术

腹膜渗出物细胞通过腹膜灌洗冷RPMI 1640介质(Biolot、俄罗斯)补充1% (v / v)胎牛血清(Biolot),直到测量和保存在冰。测量ROS总产量,孤立的细胞被孵化的15分钟1毫升含有10毫米的哈佛商学院2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein(美国σ)或50 mM dihydroethidium溴化(σ)。前者是deacylated细胞迅速氧化,ROS产生高荧光产品2′,7′二氯荧光素(DCF)和氧化的分子,而不是荧光,在细胞超氧化物阴离子自由基导致的形成2-hydroxyethidium (2 oh-e),红色的荧光。

我们研究了自发的ROS和ROS刺激与100 nM佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA,σ)。美国使用FACSCalibur (becton dickinson)流式细胞分析仪,我们测量DCF-dependent荧光的强度(海里,海里),这主要是一个指标的H₂O₂一代细胞,2 oh-e荧光(海里,海里),这主要是敏感的超氧化物阴离子。可行的巨噬细胞和粒细胞的控制是基于光散射(向前和侧散射)属性。细胞荧光强度的结果归一化控制的自发荧光小鼠,为100%。

2.4。统计分析

Kolmogorov-Smirnov测试用于检查是否被正态分布的变量。对于一个正态分布的变量,参数以及用于两个独立样本,数据被表示为均值±SEM。变量没有分布通常是评估使用Mann-Whitney非参数测试,和数据表示为中间值和较低()和上层(四分位数。变量之间的关系进行评估的斯皮尔曼等级相关系数()。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。组织学检查

组织学检查显示,感染小鼠后30天发达播散性结核性炎症,表现形态的BCG肉芽肿形成的内部器官和内脏膜。牛分枝杆菌细菌被发现病灶的肉芽肿性炎症。然而,坏死肉芽肿的变化小鼠的肺和肝脏中没有任何实验组。这个结果是最有可能的毒性减弱造成的牛分枝杆菌BCG(用于接种动物),因此,通过减少趋化现象的能力和分枝杆菌细胞壁的直接影响脂质成分对肉芽肿细胞(1,2]。

在肝脏和肺肉芽肿的数值密度增加了2.7和1.5倍,分别在30 - 90天的感染,同时,肉芽肿直径增加了24.6%在肝脏和肺部的43.1%(表1)。肉芽肿细胞成分的研究表明巨噬细胞,中性粒细胞,和淋巴细胞数量持续下降(肺中性粒细胞计数并没有改变),但是类上皮细胞和成纤维细胞的数量增加。这一发现表明一个稳定的肺结核发展倾向,没有倾向自然治愈。数值在肺部肉芽肿的密度和直径高于肝在观察(表的所有阶段1)。类上皮细胞的数量在肝脏和肺肉芽肿感染后在30天之间没有显著性差异,增加了3.5和2.2倍,分别在90天。同时,海拔肺间质单核细胞浸润是观察;这个体积密度提高2.3倍的第90天(图301)。

这种差异的形态发生结核性肉芽肿性炎症实验动物的肝脏和肺可以与肺泡巨噬细胞的结构特点,含有大量lysosome-like结构在细胞质中,和所有肺泡壁组件的地形相互关系密切,彼此之间和与血液元素(9]。此外,由于肺巨噬细胞功能在有氧环境中与氧张力,增加肺部的主要杀菌机理是自由基9,10]。因此,罗恩代过剩会导致细胞膜和肺组织损伤的不稳定。反过来,降解产物可以吸引新的人群的巨噬细胞和T细胞病变区域。因此,肉芽肿直径增加通过外围区域的扩张,这是由单核细胞(巨噬细胞和淋巴细胞),以及通过扩散渗透性的改变的间质单核牙槽炎(类似9]。

3.2。自由基氧化过程的活动

3.2.1之上。化学发光(CL)

没有肝匀浆CL参数改变后3天BCG政府老鼠(数字2- - - - - -4)。经过30天的感染,自发的CL从控制值之间没有显著性差异,但当鲁米诺被引入一个注册系统,我们观察到的光强度显著增加BCG-injected集团更加明显的CL感应的过氧化氢(数字2- - - - - -4)。LACL值增强感染后60天更加明显,不仅是8.7倍,控制也显著大于LACL强度的小鼠肝匀浆后30天注射卡介苗(图3)。H₂O₂-LACL值在实验和对照组同样的观察期间(图中是相似的4)。经过90天的实验中,控制和实验小鼠不同LACL和H₂O₂-LACL强度(图3和4),后者是矛盾的对照组低。

在分析各种CL参数之间的关系和身体和器官重量、有趣的模式了。例如,动物的体重控制在很大程度上是相关的H₂O₂-LACL和肝脏和肺重量。静脉注射卡介苗管理后,肝脏重量也积极与匀浆LACL和肺重量。此外,肺癌和H之间的负相关₂O₂-LACL,而H之间的反比关系₂O₂-LACL和体重不再是有关(表2)。

3.2.2。流式细胞术

静脉注射卡介苗,三天后腹膜渗出物细胞的荧光强度并没有不同于对照组值(数据5- - - - - -8)。postinfection 30天后,渗出物的自发和PMA-stimulated ROS生成粒细胞增加,显示他们的代谢活化(数字5和7)。此外,在同一时期,激活(自发的DCF荧光强度的增加)和启动(增强佛波醇ester-stimulated DCF荧光)腹膜巨噬细胞被发现(数字6和8)。H的强度₂O₂和一代的吞噬细胞小鼠腹膜腔显著降低后60天静脉注射卡介苗,主要是回到原始值。然而,2 oh-et-dependent粒细胞荧光(自发和PMA诱导呼吸破灭后),如果DCF-dependent巨噬细胞荧光仍有所升高(数字5- - - - - -8)。

4所示。讨论

目前,肉芽肿性炎症的研究着重于细胞因子调节尽管疾病分类学的遗传性慢性肉芽肿性疾病的识别,基于各种缺陷膜NAD (P) H氧化酶复杂,导致吞噬细胞不能产生超氧化物阴离子自由基(11]。解释这一事实表明ROS干扰肉芽肿形成,和后者的成因主要是由于白细胞减少杀菌剂的活动(12]。然而,这个解释似乎肤浅,因为通过中性氧化应激效应器细胞间发生氧化还原调控,主要是一氧化氮(NO^•)和过氧化氢(H₂O₂)。超氧化物阴离子自由基是一氧化氮自由基的最有效的拾荒者;因此细胞与NAD (P) H氧化酶缺陷的特点是更积极的NO-mediated信息交流,这可能导致肉芽肿形成。

没有参与感染性和非感染性肉芽肿的形成在人类和动物早就知道13]。没有激进分子的主要生产国在巨噬细胞和肉芽肿内诱导没有合酶,其表达是由转录因子NF -控制的κB和增加对内毒素的回应,促炎细胞因子和其他因素。的主要来源^•肉芽肿的巨噬细胞和巨Pirogov-Langhans细胞,在较小程度上,上皮细胞(14]。没有激进分子被认为是一个主要因素,杀死在结核分枝杆菌和限制病原体的生长(3]。肿瘤坏死因子α和干扰素γ参与对分枝杆菌宿主防御,也通过增加生产15]。诱导没有BCG-infected牛的肉芽肿合酶含量增加,达到最大值的一天42(第15天)的10倍,然后减少后纤维化发展(16]。一些作者声称没有合成由巨噬细胞决定肉芽肿组织和发展17]。分子作为化学引诱物和调节上皮细胞的分化和激活18]。反过来,由肉芽肿细胞诱导没有合酶的表达是受NRAMP1蛋白(14]。NRAMP1的功能之一是运输二价金属(包括铁^{2 +}吞噬体离子)。在过氧化氢的存在,这个运输导致氢氧自由基的生成,^•哦,这对分枝杆菌是致命的。

过氧化氢参与肉芽肿性炎症的形成和发展研究程度较轻;然而,调查研究不仅是细胞毒性的潜力H₂O₂作为氧化应激中介还监管潜在的分子。H₂O₂/嗜酸性粒细胞过氧化物酶系统已被证明是直接参与的破坏曼氏裂体吸虫鸡蛋都放在一个肉芽肿(19]。此外,杀菌剂的豚鼠肺泡巨噬细胞对不同菌株的活性结核分枝杆菌和牛分枝杆菌不相关的呼吸爆发的强度和H₂O₂一代,虽然吞噬作用的效率不同的菌株与毒力呈负相关(20.]。两种化合物抑制过氧化氢的管理和与特定的抗血清中性粒细胞损耗降低非感染性肉芽肿的形成在剂量依赖性的方式21,22表面),特别是当趋化因子表达内皮细胞(单核细胞趋化蛋白1表达的减少)是抑制22]。

我们的研究表明,BCG在肝脏肉芽肿病不是伴随着自由基脂质过氧化作用的变化活动在整个器官。这个活动的强度测量自发CL在肝脏匀浆,直接取决于稳态浓度的脂质烷氧基的和过氧化氢自由基3,23)(图2)。自由基氧化的活动过程和氧化应激,测量luminol-dependent CL的匀浆,同时增加在感染后的60天峰(图3)。增加,以及出现肝脏重量和强度之间的相关性肝脏匀浆LACL BCG-infected动物(表2左下部分),表明H的稳态浓度的增加₂O₂在受感染动物的肝脏。我们相信这个H₂O₂增加主要发生在肉芽肿,虽然我们不排除相邻肝细胞的贡献。阿卜杜拉希et al。24还透露,成熟曼氏裂体吸虫全身的老鼠的肝脏肉芽肿是伴随着逐渐增加肝脏H₂O₂的一代。此外,稳态之外的过氧化氢的浓度也增加在邻近的肝细胞肉芽肿(尽管在较小程度上)。

的强度H₂O₂全身luminol-dependent化学发光的生物基质直接取决于他们的氧化性能3]。这一事实在60天(与postinfection天30和90)添加外源过氧化氢到肝脏匀浆不导致增加luminol-amplified化学发光控制值(图4)表明,H₂O₂在这个时间点生产达到极大值。

没有腹膜粒细胞激活早期阶段的实验(3天),自发和PMA-induced(数字5和7),符合多形核白细胞不直接捕获数据表明BCG在肝脏(与枯氏细胞和新招募了单核细胞/巨噬细胞)(25]。此外,在此期间,肉芽肿还没有形成和存在作为一个不成熟的小渗透。然而,粒细胞参与肝脏和肺部影响炎症细胞在成熟的肉芽肿(30天)1),这种参与是紧随其后的是激活氧依赖性的新陈代谢。ROS生成的减少腹膜渗出物中性粒细胞和巨噬细胞开始之前(在60天,数字5- - - - - -8)在肝脏自由基氧化活性的下降(图2)。这种时机表明广义炎症的严重程度的缓解之前解决局部炎症。我们考虑炎症的决议进入生产阶段,纤维化的患病率在白细胞迁移在该地区,以及由此产生的oxygen-mediated退化。肉芽肿postinfection后60天,中性粒细胞和巨噬细胞的比例,最活跃的罗恩生产者,也不断减少。这种减少发生尽管连续增强的数量和直径在肝脏和肺肉芽肿和单核肺部浸润的体积密度;这些改进主要是由于上皮细胞数增加(表1和图1)。因此,它是不清楚观察到稳态的过氧化氢浓度增加受感染动物的肝脏,特别是接种卡介苗后60天,是由于直接代H₂O₂吞噬细胞。

5。结论

研究氧化应激增强内源性自由基氧化产生的(过程)和形态变化的卡介苗诱发的慢性炎症使我们得出以下。在小鼠的肺和肝脏postinfection天90,数值顺序肉芽肿的密度和直径的增加主要是由于增强类上皮细胞数量,而吞噬细胞的数量减少。相比之下,自由基的活性氧化过程在肝脏和腹膜渗出物提高30天60和BCG疫苗注射后,分别之后,逐步减少。因此,提高稳态H₂O₂浓度受感染动物的肝脏中被吞噬细胞与当地生产,和广义的严重程度减少炎症之前解决局部炎症。获得的数据的解偶联H₂O₂,祖相关流程的系统性(腹腔吞噬细胞)和地方(肝匀浆)水平的不同阶段BCG-induced肉芽肿病似乎表明过氧化氢的可能角色在组织细胞间的沟通,成熟,肉芽肿的“分离”的动态过程。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的纸。

承认

这部分工作是支持政府的合同编号。16.522.11.7057从联邦补助金计划(访问中心“现代光学系统”)。