文摘

目标。氧化应激与动脉粥样硬化斑块的结果。然而,目前,没有数据没有空斑蛋白巯基基团氧化的程度也与斑块易损性的关系。我们调查的实体protein-SH氧化修饰,专注于低分子量硫醇内收,在人类颈动脉斑块与斑块稳定性/提取不稳定。方法。斑块稳定/不稳定是组织学检查评估。protein-SH氧化修饰的程度建立了微分蛋白质组学方法在fluorescein-5-maleimide-labeled斑块提取和相应的等离子体样本48 endarterectomized病人。分析蛋白质thiolation是由毛细管区带电泳。结果。我们观察到一个更高的protein-SH氧化plasma-derived和局部表达蛋白质不稳定斑块,部分原因是更高水平的S-thiolation。相反,在等离子体中,没有调查参数稳定和不稳定斑块的患者之间的歧视。结论。我们的结果表明存在更明显的氧化环境中不稳定的斑块。识别特定的氧化修饰和理解其对蛋白质功能的影响可能会进一步提供洞察氧化应激在动脉粥样硬化的相关性。

1。介绍

斑块破裂和血栓形成是最重要的临床并发症急性冠状动脉综合征的发病机制和周围性血管疾病1]。尽管斑块易损性的机制并不完全清楚,一般认为不稳定斑块的特征是明显的蛋白水解和促炎的环境(2]。在先前的研究中,我们提供的证据碎片的一些载脂蛋白和动脉蛋白聚糖和炎性微环境的不稳定和不稳定动脉内膜切除术颈动脉斑块(3]。最近,运用蛋白质组学研究颈动脉斑块的脆弱,我们确定了一组蛋白质,以不同的方式表达稳定/不稳定的病变,prooxidant和促炎的潜力根据我们目前所了解的动脉粥样硬化过程的分子基础4]。原位氧化事件可能有重要的功能影响蛋白质代谢的命运以及其生物活性和抗原的性质。在这方面,氧化低密度脂蛋白是容易内化巨噬细胞通过所谓的“清道夫受体通路(5]。这些早期的修改可以启动和/或导致动脉粥样化形成,主要是当一个失衡氧化剂和抗氧化剂之间的代理。许多酶(如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、氧化酵素glutathione-S转移酶和还原酶和抗氧化蛋白),以及非酶的蛋白质(转铁蛋白、铁蛋白、白蛋白和aptoglobin),和末端抗氧化剂(抗坏血酸、尿酸和α生育酚)是参与维持动脉壁内的还原环境(6]。连同这些抗氧化剂、蛋白质巯基组(protein-SH组、PSH)和低分子量硫醇(LMW-thiols)参与细胞活性氧的监管水平。许多蛋白质和酶的半胱氨酸残基的侧链,质子和他们的不稳定性使得它们化学热点等多种生化作用的可逆反应年代-thiolation(混合蛋白质中二硫的形成硫醇和LMW-thiols) (7]。S-thiolated蛋白质的形成可能是抗氧化反应的结果,它被认为是一个可能的氧化还原蛋白质功能的监管机制8- - - - - -10]。所以,一些蛋白质的可逆共价改性半胱氨酸残基可能是暂时的,有重要的调制作用。有人建议homocysteinylation可以激活潜伏elastolytic metalloproteinase-2 (pro-MMP-2)通过二硫键形成前肽通过所谓的“半胱氨酸开关”机制(11]。在这方面,也是S-glutathionylation是扮演着一个角色12]。所有这些证据导致有趣的假设直接LMW-thiols-mediated基质金属蛋白酶(MMPs)激活可能参与细胞外基质降解和斑块破裂。

我们先前已经表明,低密度脂蛋白载脂蛋白b - 100能够绑定所有等离子硫醇(13,14)和人类的颈动脉粥样硬化斑块分布有不同的水平和流明瓦硫醇对等离子体(15]。在这方面,intraplaque谷胱甘肽的水平升高可能产生重要影响斑块的命运扰乱生理流明瓦硫醇氧化还原状态。

本工作的目的是研究蛋白质巯基的氧化还原状态组提取病灶稳定动脉粥样硬化斑块的关系。此外,我们评估的水平和分布和总蛋白结合的LMW-thiols评估蛋白质mixed-disulfide修改的程度。

2。方法

2.1。患者人群

蛋白质组学和毛细管区带电泳(CZE)分析进行颈动脉斑块标本和血浆样本48患者接受颈动脉内膜切除手术,参加一项研究通过免疫组织化学方法和筛查斑块稳定性(4]。入学之前获得知情同意。当地伦理委员会批准的这项研究是按照机构米兰大学的指导方针。

2.2。血小板和血浆样本

组织提取从颈动脉内膜切除手术标本,组织学上分为稳定的()或不稳定()斑块,得到如前所述[3,4]。短暂,斑块段在PBS洗,切碎,并受蛋白质提取与缓冲溶液化(8 M尿素,4% w / v皮套裤,45毫米三),与100年补充μmol / L APMSF 2μ50 g / mL KI,μmol / L亮抑酶肽,在室温下连续摇晃1 h。提取被离心法收集产生的悬浮在tl - 100贝克曼65000×g离心机为30分钟20°C。

在手术之前,血液收集包含EDTA真空采血管管。在1000×g离心后在4°C 15分钟,等离子体分离,与上述antiproteolytic代理补充,储存在−80°C到分析。

2.3。蛋白质组学分析

组织提取delipidated和resolubilized如前所述[4]。

PSH resolubilized斑块的提取和血浆样本fluorotagged fluorescein-5-maleimide (F5M)后,在黑暗中制造商的指示(皮尔斯生物技术)。

8μg和50μg (F5 M-labelled蛋白质加载了sds - page 1 d和2 d电泳,分别。进行了二维电泳已经报道(4]。使用70毫米能源论坛,合作进行,固定线性pH值4 - 8梯度带(Nurex srl,萨萨里,意大利)。IPG条水化一夜之间在20°C和50μg (F5 M-labelled蛋白质稀释溶液化缓冲区中含1% w / v v / v Pharmalyte德勤和2% (pH值3.5 -10),随后集中在50岁μ/ IPG带了22套在18°C。能源论坛一旦合作完成,他们将平衡下连续摇晃15分钟在50 mM Tris-HCl缓冲区包含6 M尿素,v / v甘油30%和3% w / v SDS w / v德勤的1%,紧随其后的是一个15分钟的平衡在同一个缓冲区没有德勤,但w / v外加2.5%碘乙酰胺。的然后密封条和低熔点琼脂糖0.5% SDS运行缓冲板的顶部凝胶(8×7×0.1厘米)。sds - page进行10% t, 3% c MiniProtean II细胞中分离聚丙烯酰胺凝胶垂直板凝胶电泳仪(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

荧光蛋白质解决图像,利用凝胶Doc XR系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国),随后,凝胶是沾Coomassie亮蓝色G250 (CBB)。图像分析了使用数量一个4.6.3软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。带荧光数据规范化的CBB染色后相应的强度。蛋白质点识别是由肽质量指纹图谱分析报道其他地方(4]。

2.4。毛细管区带电泳(CZE)分析

道达尔和蛋白结合的LMW-thiols斑块中提取和相应的等离子体样本化验如前所述[15]。

简而言之,总LMW-thiols化验,20μ20 L的提取处理μNAC (6 L的内部标准μ米)和4μL 10%真沸点DMF (v / v) 10分钟。然后,蛋白质被加1毫升的乙腈沉淀(ACN)和上层清液含LMW-thiols在真空下干燥和resolubilized 100μL(30毫米磷酸钠缓冲区包含0.08毫米5-IAF (pH值12.5)。

对蛋白结合的硫醇试验,600年μ克200年resolubilised delipidated蛋白质μL 1毫米的氢氧化钠和2μNAC (1.5 Lμmol / L) 60°C 30分钟。二硫键与20减少孵化μL 10%真沸点DMF 10分钟,通过添加900和蛋白质沉淀μACN的L。然后,上层清液在真空下干燥,LMW-thiols derivatized如前所述。

LMW-thiols测量是由一个CE系统(P / a 5510)配备生活探测器(美国贝克曼,帕洛阿尔托,CA)。

总LMW-thiols计算自由LMW-thiols之和与蛋白结合的LMW-thiols。

2.5。统计分析

稳定和不稳定斑块之间的差异进行评估通过的学生t -测试,对于正态分布数据,或Mann-Whitney等级和测试,非参数的。差异与值0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。PSH氧化(蛋白质组学分析)

微分F5M-labeled PSH组1 d sds - page分析表明深度氧化状态的差异与斑块稳定性(图1),而血浆样品中没有观察到显著差异(数据未显示),只有带对应于白蛋白检测。正常化后,总蛋白荧光信号(图明显不同2 (d)),大约两个低不稳定斑块提取物比稳定()。证明了转铁蛋白(图上存在显著差异2(一个)、联合国/圣= 0.43,)、白蛋白(图2 (b)、联合国/圣= 0.48,),α肌动蛋白(图2 (c)、联合国/圣= 0.56,)。自从被认为是有效的荧光探针用于标签减少蛋白质巯基组形成一个稳定的硫醚键(16),在不稳定斑块提取观察到的荧光强度降低,而稳定的,反映了一种氧化状态protein-SH组的成型机。缺乏相应的等离子体样本子集之间的差异表明,修改PSH氧化主要发生在动脉壁内。

2 de分析允许更好地识别涉及蛋白质,也证实了稳定和不稳定斑块之间的差异在F5M-labeling提取(图3)。总共14 F5M-labeled蛋白质,过滤或局部表达,被MALDI-TOF MS分析(表确定1)。我们之前的蛋白质组学数据的基础上4),没有人,除了热休克蛋白27日显示显著的稳定和不稳定斑块之间的微分表达式提取。总的来说,2 de的结果证实了这一发现更高的protein-SH组氧化不稳定的斑块。

3.2。LMW-Thiols决定(CZE分析)

采用CZE-LIF方法,由于其高灵敏度和选择性,代表一个好的工具的超灵敏分析LMW-thiols组织样本。总代表electropherogram和蛋白结合的LMW-thiols从斑块提取如图4。水平的流明瓦硫醇在动脉粥样硬化组织提取报道在表2。没有差异,总流明瓦硫醇是证明之间的稳定和不稳定斑块提取物。相反,蛋白结合的流明瓦硫醇在稳定斑块不稳定的水平明显高于提取物(与nmol / g prot)。分析等离子体LMW-thiols没有显示总数和蛋白结合的水平差异的两个子组患者(数据未显示)。此外,等离子体硫醇浓度和分布在健康受试者(类似于之前获得14]。有趣的是,LMW-thiols的水平和分布明显不同等离子体和动脉组织提取确认我们之前的结果(15]。

4所示。讨论

大量的证据已经涉及自由基和氧化应激在动脉粥样化形成过程(5,17]。动脉的内源性抗氧化能力相关组织似乎在这个问题上可能发生自氧化低密度脂蛋白在动脉壁的隐藏域,在一个较低的抗氧化潜力和/或高prooxidant活动可以有效(5,17- - - - - -19]。事实上,它已被证明,人类动脉粥样硬化斑块有低水平的glutathione-related抗氧化保护酶(20.),所以确认的假设一个特定的抗氧化剂/ prooxidant失衡,血管壁手术,可能在人类参与粥样硬化过程。在这方面,我们最近证明减少酶超氧化物歧化酶3和还原性谷胱甘肽的水平S-transferase在先进的颈动脉斑块不稳定4]。

试图探讨氧化应激和斑块进展之间的关系,我们研究了一些转译后的氧化修饰蛋白质的动脉粥样硬化斑块的差异蛋白质组学的方法。这个范围内,我们初步研究了蛋白质羰基化合物和HNE加合物作为氧化应激的生物标志,不稳定和不稳定斑块检测重大差异(数据没有显示)。

目前的研究提供了证据表明颈动脉斑块组织学分类的不稳定,在稳定的一定程度上,有一个助氧化剂微环境有利于ROS和RNS-mediated蛋白质的形成硫醇氧化产品,以及蛋白质之间的混合二硫化和流明瓦硫醇。

重大PSH组氧化观察视过滤和局部表达蛋白质。尽管一些特定的蛋白质表现出不同程度的巯基氧化之间的稳定和不稳定斑块提取物、认为白蛋白最明显的差异,α肌动蛋白、转铁蛋白。

白蛋白是一种nonglycosylated,单链多肽紧密折叠成三个结构域定义为17 intra-chain二硫键。白蛋白半胱氨酸³⁴唯一的半胱氨酸残基冷漠链内的二硫键,占大部分的free-SH组在等离子体。它的是异常低的(~ 5)相比,大多数的等离子体LMW-thiols [21]。目前主要是在减少的形式(mercaptalbumin),虽然大约30% -40%可以不定地氧化,要么可逆(non-mercaptalbumin)与LMW-thiols混合二硫化22),S-nitroso半胱氨酸(23),次磺酸或不可逆转,sulfinic或磺酸(24]。此外,它被描述,白蛋白,通过亲核残留物,特别是半胱氨酸³⁴,是主要的等离子体活性羰基的目标物种如4-hydroxy-trans-2-nonenal所以作为一个内生排毒代理这些proatherogenic物种(25]。最近,我们开发了一个新的高度敏感的量化分析方法LMW-thiols绑定到循环和tissue-retained白蛋白(26]。初步结果表明,大约35%的白蛋白进行过滤LMW-thiols显示不同thiolation模式与相应的循环形式。

哺乳动物α肌动蛋白包含五个半胱氨酸残基的简化型(27]。Dalle-Donne et al。27,28表明一个可逆的年代-glutathionylation的半胱氨酸^374年调节肌动蛋白丝形成诱导肌动蛋白分子结构变化。

一个人类血清纯化成熟的转铁蛋白包含19个二硫键,和没有自由巯基组描述29日]。事实上,我们没有证据表明任何荧光信号从等离子体转铁蛋白(数据未显示),进一步证实了这些观察。然而,我们获得的证据清楚地表明,动脉转铁蛋白的组织样本能够结合荧光探针,提出一些减少sh团体的存在在蛋白质结构。半胱氨酸氧化还原状态的稳定性是由二硫键的二面角应变能30.]。众所周知,免费的同型半胱氨酸可能不仅与自由蛋白巯基基团反应,还扰乱关键Cys-Cys二硫键,所以破坏蛋白质结构和影响它的功能31日]。这些反应是可逆的,可以随氧化还原电位的生物系统32]。我们假设一些二硫桥可能被摧毁后,转铁蛋白渗透到皮下的prooxidative微环境空间形成的网站对蛋白质mixed-disulfide修改和探针绑定。

总的来说,我们的蛋白质组学分析提取PSH提出了一个更为明显的氧化修饰氧化环境中不稳定的斑块。

这些结果部分证实了CZE-LIF分析流明瓦硫醇绑定在不稳定斑块提取蛋白质显示更高水平。有趣的是,这样的增加蛋白结合的硫醇含量没有关联到一个类似的增加总流明瓦硫醇的内容。此外,LMW-thiols等离子体水平并未区分稳定和不稳定斑块的患者。

CZE分析结果,与那些通过蛋白质组学相比,表明,在不稳定斑块,更高的protein-SH thiolation账户只是部分的总PSH氧化。在这方面,其他PSH氧化过程,要么可逆或不可逆,可以暗示。虽然intraplaque蛋白质S-thiolation只是protein-thiols氧化的可能机制之一,我们假定更加明显S-thiolation在不稳定斑块可能产生重要的后果。众所周知,一些基质金属蛋白酶的活性受thiolation显示特定的半胱氨酸残基半胱氨酸开关机制(11,12,33,34]。细胞外基质的降解这些酶在正常情况下是一个严格控制的过程。然而,在动脉粥样硬化斑块,可能转向平衡矩阵退化,特别是在rupture-prone肩部区域的纤维帽积累巨噬细胞和平滑肌细胞表型改变分泌大量的蛋白酶,包括基质金属蛋白酶(1,2]。已经提出,这些酶导致斑块破裂,而且,的确,我们之前证明更高的蛋白水解环境不稳定斑块有关飞机观测的碎片,apo (a)、载脂蛋白e,和成员的蛋白多糖(PG)的家庭3]。由于更高程度的蛋白质thiolation观察到不稳定的斑块,我们可以假设这些组织中的蛋白水解活性升高可能至少部分通过基质金属蛋白酶的激活半胱氨酸S-thiolation增加开关。

5。结论

本工作描述的氧化程度的修改影响protein-SH组在动脉粥样硬化斑块与不同的脆弱性和涉及蛋白质的身份。此外,蛋白质mixed-disulfide修改的程度与动脉粥样硬化斑块类型。

蛋白质的机制的说明thiolation斑块环境中值得进一步研究。识别特定的蛋白质氧化的修改和对蛋白质功能的影响的理解可能会进一步提供洞察氧化应激在动脉粥样硬化的相关性。

确认

作者感谢博士马可Maggioni颈动脉斑块的组织学分类。本研究的基金会赠款支持银行di萨丁岛,意大利萨萨里。