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安东尼奥·j·Lepedda Gabriele Nieddu,伊丽莎白·Zinellu Pierina De Muro佛朗哥Piredda,安娜Guarino,丽塔Spirito,弗朗哥的法令,Francesco Turrini人Formato, ”蛋白质组学分析Plasma-Purified VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数从动脉粥样硬化患者接受颈动脉内膜切除手术:血清淀粉样蛋白作为一个潜在的标记的识别”,氧化医学和细胞寿命, 卷。2013年, 文章的ID385214年, 11 页面, 2013年。 https://doi.org/10.1155/2013/385214
蛋白质组学分析Plasma-Purified VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数从动脉粥样硬化患者接受颈动脉内膜切除手术:血清淀粉样蛋白作为一个潜在的标记的识别
安东尼奥·j·Lepedda,1 Gabriele Nieddu
,1
伊丽莎白Zinellu,1
Pierina De Muro,1
佛朗哥Piredda,2
安娜Guarino,3
丽塔Spirito,3
弗朗哥的法令,4
弗朗西斯科·Turrini,5
和
人Formato1
1萨萨里大学Dipartimento愿望Biomediche通过Muroni 25日07100萨萨里,意大利
2Servizio di Chirurgia Vascolare,我们共同Chirurgica兴业银行,萨萨里大学Viale Pietro 43 / B, 07100萨萨里,意大利
3Centro Cardiologico“F。Monzino " IRCCS,米兰大学通过卡洛Parea 4, 20138年米兰,意大利
4Nurex开发。,Via Predda Niedda Strada 3, 07100 Sassari, Italy
5Dipartimento di遗传Biologia Biochimica,都灵大学通过Santena 19日,10126年意大利都灵
文摘
载脂蛋白是非常异构蛋白质家族,与血浆脂蛋白结构稳定、脂质代谢、炎症或免疫。获取详细信息载脂蛋白成分和结构可能有助于阐明脂蛋白与动脉粥样硬化的发生角色发展新的治疗策略治疗lipoprotein-associated紊乱。本研究旨在开发一个全面的描述血浆VLDL的载脂蛋白成分的方法,低密度脂蛋白,和HDL分数从接受颈动脉内膜切除手术的患者,通过二维电泳(2 de)加上质谱分析,用于识别潜在的标记斑块的存在和脆弱性。采用方法允许获得可再生的二维的地图可交换的载脂蛋白VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。23蛋白亚型被肽质量指纹识别分析。差异蛋白质组学分析允许识别水平的提高急性期血清淀粉样蛋白(SAA)脂蛋白分数,尤其是低密度脂蛋白在动脉粥样硬化的病人。通过免疫印迹分析结果已确认在每个脂蛋白部分使用apo AI水平数据规范化。更高水平的美联社SAA患者中显示低密度脂蛋白的作用美联社SAA载体进入动脉壁的皮下空间,美联社SAA积累和可能产生有害的影响。
1。介绍
心血管疾病死亡的主要原因和疾病在发达国家,动脉粥样硬化是最重要的因素。动脉粥样硬化是一种慢性炎症状态,可以变成一种急性临床事件导致斑块破裂和血栓形成1]。事实上,不仅血管炎症在动脉粥样硬化的发展中起着重要作用,但也导致血栓性并发症的急性发作2]。的选择性保留循环载脂蛋白B100含有脂蛋白在皮下空间中,通过特定的蛋白多糖与动脉壁的相互作用,目前被认为是动脉粥样化形成的主要事件(3,4]。
脂蛋白是超分子复合物,交付不溶性组织的脂质合成代谢或存储的地方。它们由疏水分子(核心),尤其是三酰甘油和胆甾醇酯,由两亲化合物层稳定,即磷脂,unesterified胆固醇,蛋白质,后者称为载脂蛋白(apo) [5]。载脂蛋白是一个非常异构蛋白质家族与脂蛋白稳定,脂质代谢、炎症或免疫(6]。除了apo B100,主要结构载脂蛋白VLDL和低密度脂蛋白,他们可能会交换循环脂蛋白类之间在他们的生理代谢或病理条件。很长一段时间现在,脂蛋白引起了广泛的兴趣,因为他们在动脉粥样化形成的影响。尽管众所周知,高ldl胆固醇和低脂蛋白胆固醇水平增加患心血管疾病的发展,临床研究表明,apo B100和apo AI水平可能是更好的预测(7]。因为这些粒子的蛋白质成分主要是负责执行各种功能,载脂蛋白成分和结构的详细信息与动脉粥样硬化的发生可能导致暴露他们的角色发展新的治疗策略治疗lipoprotein-associated紊乱。应用蛋白质组学研究的脂蛋白,包括凝胶或gel-free技术,可以大大有助于实现这一目标。的确,最近的蛋白质组学研究表明,脂蛋白携带蛋白质之前意想不到的数组(8]。
据我们所知,大约三十VLDL蛋白质组学研究,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白有发表到目前为止,虽然没有乳糜微粒蛋白质组研究发表在文献[8]。最近,蛋白质组脂蛋白(a)也被调查的9]。这些研究大多数集中在描述不同的载脂蛋白货物脂蛋白健康受试者的分数。相反,只有少数研究处理微分载脂蛋白表达与心血管疾病的关系。在这方面,高密度脂蛋白分数被研究最多的,与冠状动脉疾病(CAD) (10- - - - - -13)、高心血管风险和急性心肌梗塞14),高脂血症(15),或低水平的高密度脂蛋白胆固醇(16,17]。一项研究在低密度脂蛋白分数从代谢综合征和糖尿病患者动脉粥样硬化18),一个在VLDL从hyperlipidemic科目分数19)进行。数载脂蛋白亚型参与脂类代谢、炎症或免疫检测差异表达。遗憾的是,这些研究只是集中在一个脂蛋白类和样本大小是基于低。
最近,通过应用蛋白质组学研究颈动脉斑块的脆弱,我们确定了一组蛋白质差异表达/氧化稳定和不稳定损伤(20.,21]。在本研究,我们建立了一个描述方法可交换的血浆VLDL的载脂蛋白组成部分,低密度脂蛋白,和HDL分数从接受颈动脉内膜切除手术的患者,用于识别差异表达蛋白质对健康normolipidemic科目。通过二维电泳(2 de)和MALDI-TOF女士分析,我们确定了急性期血清淀粉样蛋白(SAA)过表达的三个从患者脂蛋白类。结果验证是由免疫印迹分析。在我们所知,这是第一个研究提供信息交换载脂蛋白VLDL概要文件,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白分数从动脉粥样硬化患者接受颈动脉内膜切除手术。
2。材料和方法
2.1。样品收集
分析4日汇集血浆样本57健康normolipidemic志愿者和4池获得79名患者接受颈动脉内膜切除手术。颈动脉粥样硬化是由超声评估使用Mylab 70 X愿景echocolor多普勒配有LA332 AppleProbe取得MHz (Esaote)。所有患者选择手术高档狭窄(> 70%)或一个中等等级的溃烂病变基于echo-Doppler分析。所有患者高血压、血脂异常、糖尿病和/或在药物治疗。病人的主要临床参数和控制表进行了总结1。报名之前获得知情同意。机构审查委员会批准。这项研究是按照道德原则进行当前的赫尔辛基宣言。
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空腹血样收集到真空采血管管包含EDTA和立即离心机在2000 g×10分钟4°C。等离子体与100年了μM APMSF (4-amidinophenylmethane-sulfonylfluoride), 2μg / mL激肽释放酶抑制剂(cyclohexylacetyl-Phe-Arg-Ser-Val-Gln酰胺),和50μ米亮抑酶肽(Acetyl-Leu-Leu-Arg-Hydrochloride)和存储在−80°C到分析。脂蛋白净化之前,等量的血浆样本随机组合收益率4均匀混合VLDL、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白分数从病人和控制。
2.2。脂蛋白净化
脂蛋白被孤立的等密度线超速离心法根据Himber描述的方法等。22和麦克道尔et al。23用细微的修改。短暂,3.9毫升的添加与NaBr汇集血浆样品NaBr克/毫升(472.2毫克/毫升血浆)在离心管(贝克曼库尔特薄壁更加清晰,14毫升,14×95毫米),覆盖8.1毫升的0.6%氯化钠溶液(g / mL),离心机在285000 g×48小时在4°C的最适条件L90系列离心器配有SW40 Ti转子(贝克曼库尔特)。后来,VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数被第二个离心收集并进一步纯化步骤,在285000 g×24小时在盐溶液密度1.006,1.063,和1.21 g / mL。脂蛋白分数被收集,脱盐(最后的盐浓度< 5毫米),集中使用Amicon超- 0.5毫升离心过滤单元(10 KDa MWCO,微孔)。蛋白质浓度测定用直流分析工具包(Bio-Rad),根据制造商的指示,使用牛血清白蛋白作为标准。500年整除μg(如蛋白质)的低密度脂蛋白和300μg(蛋白质)的VLDL delipidated通过添加冰冷的tri-n-butylphosphate:丙酮:甲醇(1:12:1)据获取和大厅24]。Delipidated分数与反复沸腾和声波降解法resolubilized段落10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液含有4% (w / v)的家伙们德勤和1% (w / v)。冷却到室温后,样本稀释解决方案包含8 M尿素,4%的皮套裤,德勤1%,0.4%的载体两性电解质和受到进一步声波降解法段落2 de紧随其后。50μg(蛋白质)的本地HDL分数为2 de可溶性分析如上报道低密度脂蛋白VLDL和delipidated分数。
2.3。二维分析
如前所述(执行2 de20.]。简而言之,样本应用于70毫米IPG条(pH值4 - 7,Bio-Rad),通过隔夜补液加载在20°C,随后集中在50岁μ/ IPG地带了22套20°C。聚焦之后,蛋白质凝固态降低孵化IPG条50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液含有6 M尿素,甘油30% (v / v), 3% SDS德勤(w / v)和1% (w / v),其次是凝固态烷基化,使用相同的解决方案包含碘乙酰胺2.5% (w / v)德勤。每一步执行保持连续摇晃下条15分钟。IPG条是密封的,低熔点琼脂糖为0.5% (w / v)在SDS运行缓冲,顶部的二维凝胶(8厘米×7厘米×0.1厘米)。进行sds - page 15% T / C 3%聚丙烯酰胺凝胶在50 V 15分钟,随后在150年约90分钟。然后,凝胶固定在30%乙醇(v / v)、2%磷酸(v / v) 1 h,洗两次2%磷酸(v / v)解决方案10分钟,平衡在18%乙醇(v / v)和2%磷酸(v / v)和15%硫酸铵(w / v)解决方案30分钟,染在同一个解决方案添加了0.02%考马斯亮蓝g - 250 (w / v) 48 h。凝胶图像获得通过gs - 800校准密度计(Bio-Rad)为36.3μm分辨率。图像分析使用PD-Quest二维分析软件V 8.0.1 (Bio-Rad)。每个地方都分配一个相对价值对应的单点体积相比体积在凝胶点,背景减法和凝胶之间的关系正常化。特别是,采用归一化法,生成员中的每一个点胶量除以总数量的点胶已经包含在主。
2.4。为胶液消化和MALDI-TOF MS分析
感兴趣的景点与无菌吸管切除技巧,使退色包含2.5毫米NH解决方案4HCO3和50%的乙腈(v / v),在室温下与乙腈100%脱水,干蛋白水解治疗前。胰蛋白酶的消化是由孵化在5毫米NH干点4HCO3包含10 ng /缓冲μL胰蛋白酶在一夜之间在37°C。由此产生的肽与同等体积的混合α-cyano-4-hydroxycinnamic酸饱和溶液(40%三氟乙酸乙腈(v / v)和0.1% (v / v)),微晶薄膜应用在不锈钢96 -现货MALDI目标。质量分析利用MALDI micro-MX-mass-spectrometer(水域),根据制造商建议的优化过程。峰列表生成使用蛋白质猞猁全球服务器v.2.2.5(水域)和针对Swiss-Prot人类数据库搜索使用吉祥物(57.4版)(http://www.matrixscience.com)。研究参数包括分类单元(智人),胰蛋白酶消化,单一同位素的肽质量,碘乙酰胺修改,一个错过了乳沟胰蛋白酶,50 ppm的质量偏差。只有蛋白质识别重要的吉祥物的评分()考虑在内。
2.5。免疫印迹分析
蛋白质免疫印迹分析解决进行了sds - page如前所述[20.]。简而言之,解决蛋白质被electroblotted到Hybond-P PVDF膜(通用电气医疗集团)为1.5小时250毫安。之后,膜被孵化与屏蔽解决方案(PBS, 0.1% Tween-20,脱脂奶粉3%)在室温下1 h紧随其后的是隔夜孵化在4°C单克隆抗体(Abcam Ab81483) anti-SAA稀释1:1000或多克隆抗体anti-apo AI(微孔,AB740)稀释1:8000年,阻塞的解决方案。然后,30分钟后洗(Tween-20 PBS, 0.1%),膜与HRP-conjugated孵化二级抗体溶液在室温下1 h。进一步的膜清洗后,蛋白质被增强化学发光显示使用ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad)。光密度分析使用数量执行一个4.6.3软件(Bio-Rad)。
2.6。统计分析
学生的以及对未配对样本进行比较可交换的载脂蛋白表达式在每个净化脂蛋白分数在动脉粥样硬化患者和健康对照组,使用软件包西格玛统计3 (Systat软件)。意义是。
3所示。结果
3.1。映射的可交换的载脂蛋白VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数
2 de结合质谱应用于识别VLDL、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白载脂蛋白从接受颈动脉内膜切除手术的患者和健康normolipidemic科目。根据echo-Doppler分析,患者选择手术高档颈动脉狭窄(> 70%)或一个溃烂的病变。自从apo B100是最丰富的低密度脂蛋白和载脂蛋白VLDL、代表蛋白质高达95%的一半,大量低密度脂蛋白VLDL和处理以允许更少的探测和识别也丰富的载脂蛋白。此外,由于高脂蛋白类脂质蛋白比,delipidation一步是强制性的。
可再生的二维的地图可交换的载脂蛋白VLDL、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白(图也获得了分数1)。采用分馏过程,其中包括一个等密度的梯度超速离心法紧随其后的是一个额外的清洗步骤,允许高净化收益率的脂蛋白分数。事实上,没有可检测白蛋白或额外的血浆蛋白在二维凝胶考马斯亮蓝g - 250染色法。此外,免疫印迹分析高密度脂蛋白分数没有透露任何载脂蛋白b - 100污染(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
几乎所有的解决蛋白质斑点被肽质量指纹(表2)。在更多的细节中,我们发现2亚型apo J, 2亚型AIV朊,5亚型apo E, 6亚型apo AI, 3亚型apo D, 2亚型急性期血清淀粉样蛋白,apo CII的1对碘氧基苯甲醚和2亚型apo CIII,低密度脂蛋白VLDL和分数。由于其分子质量高(约500 kDa)和疏水性,apo B100中没有检测到任何VLDL或低密度脂蛋白2 de地图。对于高密度脂蛋白3亚型的E, 6的AI, 3 D朊,美联社的第2 SAA, apo CII的第1和2 apo CIII被确定。
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观察女士高峰值分析;b肽分子量预期;c分子量计算;d独特的肽在现场确认;e吉祥物分数;f蛋白质的比例覆盖。 |
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3.2。载脂蛋白差异表达分析
微分表达式分析VLDL、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白分数从4汇集血浆样本79名患者有严重的动脉粥样硬化和4汇集血浆样品的57个健康志愿者暴露没有差异的相对丰度确定载脂蛋白(图2)除了更丰富的美联社SAA(2.3, 14.0和1.5倍VLDL、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白分数,resp)。在患者(,,,VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数,resp)(图3)。证实了微分美联社SAA表达蛋白免疫印迹分析每个脂蛋白分数使用apo AI水平数据归一化(,,,VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数,resp)(图4)。进一步证实了这些初步意见,同样的免疫印迹试验进行每组随机选择样本(图4)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
通过二维电泳(2 de)加上质谱(MS)分析plasma-purified VLDL、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白分数我们能够识别急性期血清淀粉样蛋白(SAA)作为一个潜在的先进的颈动脉粥样硬化的标志。
一半的蛋白质不同的脂蛋白物种主要是负责他们的功能,参与一些代谢活动,如识别特定的细胞表面受体或监管活动的各种酶(6]。获取详细信息载脂蛋白成分可能有助于揭示动脉粥样化形成的作用。到目前为止,只有少数研究处理lipoproteomics与动脉粥样硬化或atherosclerosis-related疾病,高密度脂蛋白上执行的看法。他们中的大多数冠心病(CAD)患者(10- - - - - -13]。
这是第一个报告关注微分表达载脂蛋白在动脉粥样硬化患者比健康对照组颈动脉内膜切除手术。采用方法是劳动密集型产业,我们决定设置它在随机结合汇集血浆样品。在我们看来,这是这项研究的主要限制,因为每个数据报告代表了从15到20样品平均价值和衡量多少变异或从平均分散存在缺失。另一方面,这种方法允许在每个脂蛋白分数比较交换载脂蛋白的水平从一个引人注目的患者数量和控制(79名患者和57控制)。事实上,差异蛋白表达的初步结果进一步分析可能代表一个有用的起点,进行更具体的分析,可以分别在每个样本(例如,ELISA对血浆样品和斑块提取物,和免疫组织化学在动脉内膜切除术标本)。
的载脂蛋白VLDL、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数,从晚期动脉粥样硬化患者进行分析,确定23个不同亚型的蛋白肽质量指纹图谱。此外,我们比较了档案与健康志愿者。
采用净化过程提供高纯度脂蛋白分数所证实的血浆蛋白的缺失以及apo b - 100的高密度脂蛋白(由西方墨点法评估)。此外,由于大量的解决蛋白亚型和低检测极限,2 de已被证明有高分辨率和灵敏度。
图像分析允许识别美联社SAA差异表达在动脉粥样硬化的病人。在所有脂蛋白水平更高的分数,增加在动脉粥样硬化患者低密度脂蛋白fourteenfold分数。这样的证据证实了免疫印迹分析每个脂蛋白纯化分数。
血清淀粉样蛋白属于一个家庭的急性期蛋白,主要在肝脏合成,流通主要相关的高密度脂蛋白。在急性期反应,据美联社SAA等离子体浓度可能会增加到1000倍由于upregulation合成的炎性细胞因子或肽激素信号(25]。除了一些证据在促进胆固醇流出antiatherogenic作用的细胞(26- - - - - -30.),大量的研究表明proatherogenic SAA的影响,如促进单核细胞和中性粒细胞趋化作用[31日- - - - - -33],巨噬细胞泡沫细胞的形成[34),刺激monocytes-macrophages和淋巴细胞的促炎细胞因子的分泌33,35,36),诱导内皮功能障碍(33,37,38]。此外,通过诱导组织因子表达SAA会增强凝血事件(39]。SAA的角色脂蛋白皮下保留已经假定,因为众所周知,它可以刺激血管蛋白聚糖的合成增加LDL-binding亲和力(40)和蛋白聚糖绑定域carboxy-terminal地区已被确定(41]。此外,一项研究在活的有机体内小鼠模型表明,SAA沉积在动脉粥样硬化地区在病变发展的所有阶段和高度相关,病变区,apo人工智能领域,飞机观测- 100区,perlecan区域(42]。然而,这两个蛋白定位(43)和mRNA表达(44在人类动脉粥样硬化斑块被证明。SAA患者也增加动脉粥样硬化的冠状动脉和周围动脉(45- - - - - -50]。有趣的是,小笠原群岛等人证明,LDL-associated SAA代表一个标记CAD患者的血管内炎症的稳定,比c反应蛋白更敏感,或免费SAA (51]。最后,一个强大的独立SAA和未来心血管事件之间的关系证明(52,53]。所有这些证据不仅突显了这种蛋白质的潜力作为先进的血管疾病的标记还SAA的机制在动脉粥样硬化发展起着直接的作用。
我们的研究结果进一步支持发现proatherogenic美联社SAA的影响和建议的低密度脂蛋白的作用美联社SAA航母进入动脉壁,可以发挥其有害影响。
5。结论
我们的目的是评估载脂蛋白VLDL的表达谱,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白分数从接受颈动脉内膜切除手术的患者和健康normolipidemic受试者通过二维耦合的质谱分析。通过这种方法,第一次,美联社SAA被确认为差异表达。在所有脂蛋白水平更高的分数,上升到14倍从动脉粥样硬化患者的低密度脂蛋白,表明潜在的美联社SAA之间的联系和先进的颈动脉病变的存在。虽然初步的,我们的研究结果是符合的在体外和在活的有机体内证据来源动脉粥样化形成分摊这种蛋白质的作用。采用的方法论的方法被证明是一个识别lipoprotein-associated标记在心血管研究的有力工具。进行进一步的研究来评估潜在的LDL-associated美联社SAA颈动脉粥样硬化的标志以及增加的影响诱导斑块炎症机制发展和进展/弱点。
确认
作者感谢博士Giustina Casu Finlayson英语修订。本研究支持的自治Regione德拉萨丁岛(P.O.R.萨丁岛F.S.E. 2007/2013,美国卫生工程师协会(Asse) IV Umano把握住Obiettivo Competitivita Regionale e Occupazione,美国卫生工程师协会(Asse) IV Umano把握住线di Attivita l.3.1)和基金会银行di萨丁岛(萨萨里,意大利)。
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