文摘
越来越多的证据表明,肥胖是一个风险因素对肾脏结构和功能的改变,导致终末期肾病社区强加一个沉重的经济负担。然而,没有有效的治疗方法,肥胖相关肾脏疾病。在目前的研究中,我们探讨了治疗的潜力木兰提取(BL153)治疗肥胖相关肾脏损害在高脂肪饮食- (HFD)诱导小鼠模型。结果表明,炎症标记(肿瘤坏死因子-α和纤溶酶原激活物inhibitor-1)和氧化应激标志物(3-nitrotyrosine和4-hydroxy-2-nonenal)都显著增加肾脏的HFD-fed老鼠相比,用低脂饮食的老鼠(最晚完成日期)。此外,蛋白尿、肾结构变化HFD-fed老鼠更严重比LFD-fed老鼠。然而,所有这些变化都是减毒BL153治疗,伴随着upregulation的过氧物酶体proliferator-activated受体-γcoactivator-1α(PGC-1α二)和己糖激酶(香港II)表达在肾脏。目前的研究表明,BL153管理可能是一个新颖的方法在肥胖个体renoprotection antiinflammation和氧化压力很可能通过upregulation PGC-1α肾脏和香港第二信号。
1。介绍
国际肥胖工作小组已确定,全球的成人和学龄儿童肥胖2010年6亿年和5000万年,分别。随着全球肥胖的流行率在不断上升,越来越多的注意力已经与肥胖相关的并发症,包括肾脏疾病。肥胖和蛋白尿的关系在1974年首次报道(1]。之后,越来越多的证据支持,肥胖是一个独立的危险因素肾脏结构和功能的改变,导致终末期肾病,给社会带来了沉重的经济负担2,3]。然而,没有有效的药物治疗这种疾病。
胰岛素抵抗和代偿高胰岛素血症是肥胖的特征。几个不同的通路通过胰岛素抵抗和高胰岛素血症导致肾损害报道了压倒性的背景研究,如胰岛素样生长因子1 upregulation [4和肾素-血管紧张素系统激活5]。然而,肥胖代胰岛素抵抗的机制尚未完全了解。最近,出现了炎症和氧化应激参与引发胰岛素抵抗在肥胖相关肾脏损害6,7]。因此,减轻炎症和氧化应激似乎是一个潜在的治疗这种疾病的方法。
植物疗法已经用于人类疾病作为替代或补充几个世纪对抗疗法的药物(8,9]。药用植物是代表之一木兰属,主要分布在亚洲东部和东南部。到目前为止,已经有超过250种成分分离锥,树皮和树叶的木兰属,如自由基清除,和厚朴酚,4-O-methylhonokiol, obovatol [10]。这个物种的药用是归因于不同的药理作用,包括抗炎(11,12和抗氧化应激13,14]。在早期的研究中,门罗等人发现,和厚朴酚政府明显减少ovalbumin-induced过敏性哮喘小鼠气道高反应,伴有促炎细胞因子显著减少(15]。后续的观察表明,洋玉兰l .花提取物对消耗细胞活性氧的抗氧化能力存在剂量依赖的相关性模式(16]。最近,使用高脂肪饮食——美联储(HFD)小鼠模型,金等人发现,长期补充和厚朴酚和自由基清除减脂肪积累,胰岛素抵抗,和脂肪炎症17]。然而,目前尚不清楚在肾的保护作用木兰extract-treated肥胖的老鼠。
因此,当前的研究是进行研究的影响木兰提取(BL153)在肾损伤HFD-induced肥胖小鼠模型。此外,进一步探索可能的机制,一些候选分子参与肾脏炎症,氧化应激、代谢调控也被检测到。
2。结果
2.1。BL153减少Obesity-Induced肾脏功能障碍和结构的变化
评估肾功能、尿蛋白和尿肌酐检测,并在此基础上,尿albumin-to-creatinine比率(ACR)计算。虽然在HFD-fed显著提高小鼠的实验中,ACR后显著降低政府与BL153剂量的5毫克/公斤或六个月(图10毫克/公斤1)。
(一)
(b)
(c)
肾脏重量胫骨长度比例(图2(一))和肾苏木精和伊红染色())的保护作用进行评估BL153 obesity-induced肾脏结构的变化。如图2,肾脏重量和胫骨长度比例增加HFD-fed老鼠相比,低脂饮食——美联储老鼠(最晚完成日期)。此外,肾脏组织病理学改变HFD-fed老鼠温和的实验,如扩大肾小球和肾小管上皮细胞损伤。然而,所有这些结构改变是缓解6个月后BL153治疗剂量的5毫克/公斤或10毫克/公斤(图2)。
2.2。BL153变弱Obesity-Induced肾脏炎症和氧化应激
炎症和氧化应激obesity-induced肾损害中起着重要的作用;因此,我们进行免疫印迹分析肾脏炎性细胞因子的表达,肿瘤坏死因子-α(TNF -,图3(一个))和纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1,图3 (b)),它也被接受为adipocytokines或发病(18]。他们两个都在HFD老鼠与最小的致命剂量的小鼠相比显著增加;然而,这种趋势被BL153治疗(图部分废除3)。
(一)
(b)
此外,我们还研究了在obesity-induced BL153氧化应激的保护作用研究3-nitrotyrosine (3 nt,图4(一))作为nitrosative损伤指数和4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE,图4 (b))作为氧化损伤指数在未来的研究。同样,增加肾3 nt和4-HNE表达式由HFD喂养(图都是由BL153预防治疗4)。
(一)
(b)
2.3。保护作用的BL153 Obesity-Induced肾损害与肾的Upregulation过氧物酶体Proliferator-Activated受体-γCoactivator-1α(PGC-1α),NAD (P) H醌氧化还原酶1 (NQO1)和己糖激酶II(香港II)表达式
接下来的研究旨在探讨可能的机制BL153变弱肾脏炎症和氧化应激在肥胖。如图5、肾PGC-1α略增加HFD老鼠与最小的致命剂量的小鼠相比,六个月后,进一步增加BL153治疗剂量指示(图5(一个))。此外,肾脏NQO1显著减少HFD老鼠老鼠相比最晚完成日期;然而,这是增加了BL153管理局(图5 (b))。
(一)
(b)
另一位候选人分子是香港II。如图6,香港2蛋白表达减少肾脏HFD组小鼠与最小的致命剂量组小鼠;然而,它几乎被BL153回到正常水平管理显示剂量(图6)。
3所示。讨论
在目前的研究中,我们提供了第一个证据木兰提取、BL153变弱肥胖相关肾脏结构和功能的改变一个HFD-induced肥胖小鼠模型。重要的是,BL153减肥胖治疗肾脏炎症和氧化应激引起的,也可能是因为BL153 PGC-1增加的能力α和香港II表达在肾脏。
肥胖被认为是慢性轻度全身炎症和氧化应激状态,相互作用,导致一个恶性循环,促进胰岛素抵抗的发展(19,20.]。这一概念已被大量研究证实。例如,使用人类内脏脂肪细胞,Vazquez-Carballo等人发现,肿瘤坏死因子-α治疗导致胰岛素抵抗对葡萄糖吸收,葡萄糖转运蛋白4易位,胰岛素信号(21]。实验数据和人类的研究表明4-HNE,主要的膜脂质氧化产品,受损的胰岛素信号和干扰在骨骼肌胰岛素的生物活性(22]。符合这些报告,我们目前的研究发现,炎症标记物,如肿瘤坏死因子-αPAI-1,氧化应激标记,如3 nt和4-HNE,在HFD-fed老鼠升高,伴有胰岛素抵抗,因为我们最近报道(太阳et al .,未发表的论文)。
我们的数据首次证明这些改变可以逆转BL153管理。几个以前的研究木兰提取获得了类似的结论。纯化的厚朴,发现了自由基发挥抗炎属性通过抑制lipopolysaccharide-induced toll样受体4表达式,随后的核因子kappa-B (NF -κB)和MAPK信号通路在子宫上皮细胞(23]。此外,在活的有机体内研究表明,和厚朴酚,另一个从木兰草复合隔离,调节炎症反应的细胞因子,如interleukin-1β、白细胞介素- 6、TNF -α通过激活,单核细胞化学引诱物蛋白1 NF -κB (24]。除了抗炎特性,木兰提取也被发现参与改善氧化应激通过不同的途径。例如,4-O-methylhonokiol,小说复合隔绝厚朴,防止阿尔茨海默病的发展和进展通过改善氧化应激通过p38 MAPK-dependent通路(25]。自由基清除的有利影响学习和记忆能力被报道与超氧化物歧化酶(SOD)在scopolamine-induced恢复小鼠模型(26]。然而,如何木兰提取调节肾脏炎症和氧化应激在肥胖状态仍不清楚。
在我们目前的研究中,一项新的发现表明PGC-1αBL153治疗后增加了10倍以上。作为一个著名的胰岛素抵抗调节器,PGC-1α也有报道由多个起到抗炎作用机制(27- - - - - -29日]。例如,过度PGC-1α在培养的血管平滑肌细胞导致减少活性氧生成增加SOD2的表达式的线粒体。PGC-1击倒的α通过特定的小干扰RNA大大减少线粒体抗氧化蛋白表达(29日]。在这项研究中,我们证明了NQO1,但不是SOD2(数据未显示),显著增加了BL153管理局(图5 (b))。综上所述,它是可能的木兰提取(BL153)变弱通过增加PGC-1肾脏炎症和氧化应激α介导的各种抗氧化蛋白的表达在不同条件下。此外,我们的研究结果表明,PGC-1α略升高HFD-fed小鼠的肾脏。类似的海拔还发现2型糖尿病大鼠胰腺胰岛的(30.),而其他观察宣布PGC-1减少α脂肪组织胰岛素抵抗和肥胖的人(31日]。我们认为增加PGC-1α发现HFD-fed老鼠肾脏是由于胰岛素抵抗克服障碍的积极反馈当地的体内平衡,如图7。
在这项研究中另一个重要的观察是肾脏香港II表达低HFD组小鼠比最小的致命剂量组小鼠。这个发现支持了先前的人类研究肥胖和2型糖尿病人32]。然而,与BL153治疗后,香港二世在HFD-fed表达调节小鼠肾脏,伴有肾减轻氧化应激。曾经作为一个关键的中介在糖酵解到催化葡萄糖的磷酸化生成葡萄糖- 6 -磷酸(32第二,香港出现了扮演一个角色在氧化应激(33,34]。基于这些,我们假设增加香港II表达可能是另一个潜在机制renoprotection BL153 obesity-induced肾损伤。另一方面,过度的香港第二参与癌症细胞增殖和迁移35]。我们的数据表明,BL153政府并不影响香港二世在最小的致命剂量组小鼠表达水平;此外,BL153政府HFD组小鼠只会增加香港II表达式回到正常水平,即使在高剂量(10毫克/公斤),表明BL153的安全性,如图7。
在我们的研究中有一个限制。以确保PGC-1的至关重要的作用α和香港II在BL153-associated肾脏预防肥胖,PGC-1α和香港II基因敲除动物应该使用。我们希望进一步的研究证实了我们的假设。
在目前的研究结果相关,但不同于我们之前的研究(36,37),炎症和氧化应激已经发现显著增加在1型糖尿病小鼠的肾。此外,改善炎症和氧化应激通过使用MG132或萝卜硫素显示,糖尿病肾病(有利影响36,37]。MG132肽醛蛋白酶体抑制剂,对其治疗效果降低ubiquitin-conjugated蛋白质的降解,如nuclear-factor-E2-related-factor-2 (Nrf2),一个重要的转录因子调节细胞防御活性氧物种,通过抑制活动β子单元的核心粒子26 s蛋白酶体(38]。萝卜硫素,卷心菜和花椰菜隔绝,是另一个Nrf2激活和调节Nrf2脱离Nrf2从其抑制剂Kelch-like ECH-associated蛋白1和随后促进Nrf2核[39]。然而,张等人发现增加Nrf2活性并没有阻止食源性肥胖和对脂质代谢的影响有限40]。此外,弊大于利的概念Nrf2对肥胖的影响出现了。许等人表明,增强Nrf2活性甚至受损的胰岛素信号,长期高血糖反应葡萄糖挑战,诱导胰岛素抵抗在leptin-deficient肥胖41]。因此,化合物如BL153、治疗效果和不同的机制从MG132和萝卜硫素,治疗肥胖相关肾病的潜力巨大。
总之,我们的研究结果首次证明在治疗obesity-induced BL153肾病的治疗潜力。BL153政府处于肥胖状态变弱肾脏炎症和氧化应激反应,改善肾病理和功能改变。此外,我们的数据表明的可能机制BL153 PGC-1改善肾脏炎症和氧化应激α和香港II upregulation肾脏。综上所述,本研究宣称BL153政府可能renoprotection肥胖人的新方法。
4所示。材料和方法
4.1。木兰提取(BL153)
的树皮厚朴从Kyungdong市场购买,首尔,韩国,分类学的被禁止研黄博士的研究所药物资源,来自韩国忠北国立大学(所、韩国)。凭证标本馆内的标本来自韩国忠北国立大学,来自韩国忠北韩。的树皮m . officinalis是干在树荫下在室温和存储在一个黑暗、寒冷的房间里,直到使用。树皮的风干m . officinalis(3公斤)切成块,与95% (v / v)乙醇提取两次(4倍的重量干植物)在室温下3天。通过400 -网滤布过滤后,滤液又过滤了通过滤纸(绘画纸,不。5)和集中在减压下获得粘性深棕色残渣(360 g, BL153)。的乙醇提取物m . officinalis(BL153)是主要由高效液相色谱分析,以确保它是包含4-O-methylhonokiol的14.8%,和厚朴酚的14.2%,和12.0%的自由基清除,在协议与以前公布的数据42]。
4.2。实验动物和协议
所有实验中老鼠符合美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物,路易斯维尔大学机构批准的动物保健和使用委员会。
男性C57 / BL6 / J小鼠在8周的年龄从杰克逊实验室购买,住在路易斯维尔大学的研究资源中心22°C和12小时光/暗周期。三十小鼠随机分为六组()和美联储最晚完成日期(10%千卡,脂肪;D12450B,研究饮食NJ Inc .)或一个HFD(60%千卡,脂肪;D12492B,研究饮食NJ Inc .)有或没有BL153了六个月。(1)最晚完成日期+ 5毫克/公斤组:老鼠的最晚完成日期,并配以BL153剂量的5毫克/公斤;(2)最小的致命剂量组:老鼠最晚完成日期,并配以0.5%乙醇;(3)HFD组:老鼠HFD,并配以0.5%乙醇;(4)HFD + 2.5毫克/公斤组:老鼠与BL153 HFD和补充2.5毫克/公斤的剂量;(5)HFD + 5毫克/公斤组:老鼠与BL153 HFD和补充剂量的5毫克/公斤;(6)HFD + 10毫克/公斤组:老鼠HFD和补充剂量的BL153 10毫克/公斤。选择5毫克/公斤,10毫克/公斤,目前的研究是基于一项研究[42),治疗BL153这两个剂量水平的一周表现出显著的保护作用。因为这里治疗的时间比,我们还包括一个低剂量的BL153 2.5毫克/公斤。
准备BL153填喂法解决方案,不同剂量的BL153溶解在100%的乙醇,然后与ddH稀释2O到BL153的最终浓度为1.0毫克/毫升(高剂量组),0.5毫克/毫升(中间剂量组),和0.25毫克/毫升(低剂量组)与最终乙醇浓度为0.05%,分别。因此,填喂法体积为1% (mL / g)的老鼠体重(例如,25 g老鼠应该给250μL)。对照组给予相同体积的ddH2用0.05%的乙醇。六个月喂养期间,每月体重测量,填喂法体积根据体重变化是合理的。在实验结束时,收集尿液样本后,所有老鼠牺牲进行进一步分析。
4.3。尿白蛋白测定
收集尿液样本的实验。尿白蛋白(Bethyl实验室、蒙哥马利、TX)和尿肌酐(生物测定系统,海沃德,CA)测量根据制造商的指示。ACR计算尿ACR =尿白蛋白/肌酐(μg /毫克),正如我们先前描述(36]。
4.4。肾脏组织病理学检查
肾组织是在磷酸盐10%福尔马林固定过夜然后在一系列梯度酒精脱水,清除二甲苯,嵌入在石蜡,分段5μ为病理染色米厚度。检查整体形态、石蜡切片脱蜡)染色。意思是肾小球面积也测量评估肾小球肥大。
4.5。免疫印迹分析
肾组织中均质里帕缓冲和总蛋白提取。免疫印迹分析被执行之前报道(37]。短暂,蛋白质在10% sds - page凝胶分离和转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad大力神,CA)。后者以5%的牛奶被封锁,其次是孵化后抗体:TNF -α,PGC-1α(MA) Abcam、剑桥PAI-1 (BD生物科学,圣何塞,CA), 3 nt (Billerica的微孔,MA), 4-HNE(α诊断国际,圣安东尼奥,TX),香港二世,β肌动蛋白和NQO1 (SantaCruz生物技术、圣克鲁斯,CA)。这些膜清洗后Tris-buffered盐水(pH值7.2)包含0.05%渐变20和孵化与适当的二次抗体。蛋白质乐队可视化使用增强化学发光(热科学,罗克福德,IL)。
4.6。统计分析
数据收集从五个动物为每个组和±SD作为手段。我们使用5.2图像定量分析西方墨点法。对比组由单向方差分析,其次是图基的事后考验。统计分析与起源7.5执行实验室数据分析和绘图软件。被认为是统计意义。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
本研究支持,部分来自韩国忠北科技园格兰特Bio-International合作研究,由来自韩国忠北省,韩国,和路易斯维尔大学之间的合作项目和Bioland有限公司”筛查糖尿病和/或肥胖自然提取的化合物,”由Bioland有限公司有限公司(10 - 0826 Bioland)。