文摘
生物因素,tocotrienol-rich分数(基金会),和生育酚抗衰老的属性。然而,合并后的这些化合物对皮肤老化的影响有待研究。本研究旨在阐明生物因素引起的皮肤老化的影响,扶轮基金会,生育酚在应激过早衰老(sip)模型的人类二倍体成纤维细胞(HDFs)通过确定胶原蛋白和基质金属蛋白酶的表达在基因和蛋白质水平。主要HDFs治疗与生物因素、扶轮基金会和过氧化氢(H之前生育酚2O2)接触。的表达COL1A1、COL3A1 MMP1、MMP2 MMP3,和MMP9基因是由存在决定的。I型和III型胶原蛋白被西方墨点法测量时基质金属蛋白酶的活动是由荧光Sensolyte MMP的量化工具。我们的研究结果表明,生物因素、扶轮基金会和生育酚调节胶原蛋白基因和表达下调MMP的基因()。I型胶原和III型胶原蛋白含量显著增加,以应对生物因素,扶轮基金会和生育酚治疗(),减少金属蛋白酶- 1、MMP-2 MMP-3, MMP-9活动()。这些发现表明,生物因素、扶轮基金会和生育酚有效增强胶原蛋白的合成,抑制胶原降解,因此可以保护你的皮肤衰老。
1。介绍
人的皮肤由表皮、真皮和皮下组织提供了一个屏蔽层对内部器官。在时间衰老,皱纹增加,下垂,色素沉着,脆弱,缺乏水分+弹性普遍观察到的表现在皮肤上。皮肤老化可以是内在的,这是由基因决定的,外在的,这是由于紫外线等环境暴露。氧化应激是导致皮肤衰老的因素之一(1,2]。
成纤维细胞是至关重要的collagen-producing细胞提供平外观和皮肤的弹性与胶原蛋白的合作。然而,成纤维细胞有倒塌的外观与小岁时细胞质(3,4]。因此评估胶原蛋白的损失,降低合成或降解增加,最重要的是分析可能导致皮肤老化的因素(5]。基质金属蛋白酶(MMPs)起着重要的作用在调节胶原蛋白的营业额。在皮肤老化,高水平增加皮肤的胶原蛋白退化和恶化引起的基质金属蛋白酶结构(6]。以前的研究使用压力诱导人类二倍体成纤维细胞过早衰老(sip)模型表明基质金属蛋白酶的作用在调节胶原降解[7,8]。
胶原纤维占大约75%的干重的真皮9]。总胶原蛋白在皮肤会随着年龄增长而减少。先前的研究表明,胶原蛋白标记如I型c端前肽(PICP)没有任何可以增加在青春期,但减少对成年后青春期的年龄而交联浓度c端端肽的I型胶原蛋白(ICTP)及胶原类型III n端前肽(p3NP)增加pubertal-aged孩子之前减少对成人浓度(10]。岁个人已报告在皮肤胶原蛋白水平较低比年轻的人在弹性材料的数量和相关fibro-hexis或纤维分解可以很大,可能是负责皱纹形成的photoaged皮肤(2,8,11,12]。
基质金属蛋白酶是一个家庭的锌含蛋白酶与不同的底物特异性,细胞来源,和诱导物(4]。他们降低了稳定的组件在胶原等细胞外基质(ECM),明胶、弹性蛋白、层粘连蛋白、基底膜。随着年龄的增长皮肤基质金属蛋白酶含量增加(6]。有人建议,破坏胶原蛋白的存在可能会以某种方式行动表达下调胶原蛋白合成。研究表明,I型胶原在三维损伤在体外文化后金属蛋白酶- 1治疗相似的超微结构出现损伤在活的有机体内在年龄的皮肤13]。
发展与氧化应激相关的老化是假定在老化的自由基理论(14]。自由基等活性氧(ROS),这可以通过正常的代谢过程产生本质上或从外生代理、攻击细胞结构像DNA和蛋白质导致连续积累细胞损伤。在体外氧化应激条件下可以操纵为了研究衰老过程。例如,研究表明,暴露在紫外线或过氧化氢(H2O2)能够提高活性氧含量和诱导过早衰老在年轻的成纤维细胞15,16]。H2O2是氧化剂物种,可以引起人类成纤维细胞氧化损伤和产生相似的特征作为衰老细胞(17]。
由于氧化应激在老化是至关重要的,化合物具有抗氧化特性的生化在预防衰老可能是有益的。在这项研究中,我们评估了生物因素的综合影响,tocotrienol-rich分数(基金会),和生育酚在促进皮肤再生之前暴露于氧化应激。扶轮基金会是由各种形式的tocotrienols和α生育酚。生育酚和tocotrienol同分异构体的维生素e .它们的化学结构的差异导致了不同的功效和潜在的抗氧化剂(18]。生物因素是来源于一个活跃的化合物酿酒酵母。最近的研究表明,它作为一种抗衰老的化合物由于其胶原合成促进作用。当结合其他活性物质,它可能协同工作19]。
在这项研究中,我们旨在阐明生物因素的分子机制,tocotrienol-rich分数,和生育酚预防皮肤老化。我们想确定是否给了激动人心的结果或单一治疗相结合的协同效应的化合物提供更好的影响在预防皮肤老化在HDFs通过确定胶原蛋白生物合成和降解。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和治疗协议
这项研究已经被马来西亚Kebangsaan大学伦理委员会批准(批准项目代码:ff - 328 - 2009)。主要人类二倍体成纤维细胞(HDFs)来自三个年轻的男性受试者的包皮环切包皮,9岁和12岁。书面通知同意了父母的所有科目。样本无菌收集和洗几次以75%酒精和磷酸缓冲盐(PBS)含1% antibiotic-antimycotic解决方案(PAA、奥地利)。去除表皮后,纯真皮被切成小块并转移到猎鹰管含有0.03%胶原酶I型解决方案(卫氏生化公司,美国)。纯真皮消化在孵化器在37°C瓶6到12 h。PBS,派生HDFs被清洗和维护在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)(PAA、奥地利)和1% antibiotic-antimycotic解决方案在37°C公司5%2湿润孵化器。5或6天后,HDFs使胰蛋白酶化,进一步扩大与扩张程度的1:4到一个新的T25培养瓶(Nunc、丹麦)。当细胞confluency达到90%至80,连续使执行直到通道4。人口倍增(PDs)监控整个实验。为后续实验中,HDFs被受到生物因素,扶轮基金会,或生育酚和生物因素的组合,扶轮基金会,生育酚(它)通道4。之后,这些细胞暴露在20μM H2O2两周(延长暴露在低浓度的H2O26)通道。后两周的H2O2曝光,这些细胞被收获进行进一步分析。
生物因素扶轮基金会(美国拱化学品公司。新泽西),tocotrienol-rich分数(基金会)(Sdn森达美种植园。有限公司、马来西亚)和Copherol F 1300 C(科宁护理化学品)用于治疗前HDFs H2O2暴露浓度为1% (v / v), 500年μ克/毫升和100μg / mL,分别单独或组合。
2.2。总RNA提取
HDFs的总RNA提取不同群体使用三试剂(分子研究中心、美国),根据制造商的指示。Polyacrylcarrier(分子研究中心、美国)添加在每个沉淀提取总RNA。提取总RNA小球然后用75%的乙醇清洗,晾干后溶解在核糖核酸酶DNase免费蒸馏水(美国Gibco)。总RNA提取后立即存放在−80°C。提取的总RNA的产量和纯度测定用Nanodrop nd - 1000(美国热费希尔科学)。
2.3。引物设计和存在
设计的引物都是使用引物3软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3),参考基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库。引物对的目标放大的特点是爆炸(基本局部比对搜索工具;http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)。表1在这项研究中显示了目标基因的引物序列。特异性的引物是由使用iScript一步法rt - pcr试剂盒SYBR绿色(美国Biorad)。PCR产物的大小然后检查运行在1.8%琼脂糖凝胶prestained与溴化乙锭以及100个基点DNA阶梯(美国Promega)。优化中存在的程序建立了执行标准曲线。四个使用串行总RNA的稀释:0、2、4、8和16。通过使用Bio-Rad iCycler和程序协议,每一对引物进行优化和确定目标基因的表达。放大协议如下:在50°C 30分钟互补脱氧核糖核酸的合成,iScript逆转录酶失活在94°C 2分钟,其次是38放大周期在94°C的变性30秒和60°C(引物退火和延伸)30秒。最后一个周期结束后,融化在95°C曲线生成1分钟,1分钟55°C, 60°C 10秒(70年周期,增加设定点温度循环后2×0.5°C)。甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)被用来作为参考基因作为内部参考规范化mRNA表达(20.]。
2.4。西方墨点法
确定数量的I型胶原和III型胶原蛋白,细胞溶解产物通过裂解缓冲由混合准备完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏公司、德国)和缓冲区里帕(美国Sigma-Aldrich)。大约30μg细胞溶解产物在70°C加热10分钟的样品缓冲。样本然后分开4 - 12% bis-tris凝胶凝胶电泳(美国表达载体)。之后,蛋白质转移到硝酸纤维素和初级抗体进行孵化。anti-mouse单克隆的两个主要的抗体被用于I型胶原(美国圣克鲁斯)1:500稀释和III型胶原(美国圣克鲁斯)1:200稀释。孵化后的二次抗体,蛋白表达检测凝胶文档和分析多重图象光内阁504551(αInnotech,美国)。乐队强度测量通过使用图像主总实验室软件(Amersham生物科学,白金汉郡,英国)。
2.5。测定金属蛋白酶- 1、MMP-2 MMP-3, MMP-9活动
的活性金属蛋白酶- 1、2、3、9被使用荧光SensoLyte 520 MMP的量化分析工具(美国Anaspec)根据制造商的指示。简单地说,细胞治疗24 h。条件培养基的上层清液收集和离心机15分钟在4°C, 10000克。样本包含MMP然后孵化与4-aminophenylmercuric醋酸(APMA)激活pro-MMP随后启动酶反应。MMP的活动是由荧光检测标仪(美国Bio-Tek仪器)激发/发射波长360 nm / 460海里。
2.6。统计分析
实验进行了一式三份和数据分析了单向方差分析(方差分析)使用SPSS统计软件。意义是接受。
3所示。结果
3.1。生物因素的影响,Tocotrienol-Rich分数,和生育酚合成胶原蛋白
生物因素,扶轮基金会、生育酚和生物因素相结合,扶轮基金会,生育酚(它)的表达明显增加COL1A1基因与sip在5.07倍,2.92倍,3.10倍和2.13倍,分别(图1(一))()。然而,重要的海拔只有发现在HDFs接受扶轮基金会,生育酚,它()但不是在biodynes-treated细胞水平的I型胶原蛋白进行了分析(图1 (b))。
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为COL3A1表情,一个重要的观察upregulation 9.63和1.22折口分别在细胞受到生物因素和扶轮基金会(图2(一个))()。III型胶原的表达显著增加在所有治疗细胞相比口(图2 (b))()。
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3.2。生物因素的影响,Tocotrienol-Rich分数,生育酚在胶原蛋白降解
治疗与扶轮基金会,生育酚,它显著监管MMP1基因与sip在0.10倍,0.23倍和0.03倍(图3(一个))()。分析MMP的活动显示,只有它显著降低金属蛋白酶- 1(图的活动3 (b))。为MMP2基因的表达,结果是类似的表达明尼苏达扶轮基金会,生育酚,它大大降低MMP2基因表达的0.09倍、0.12和0.10,分别,但不是在biodynes-treated细胞(图4(一))。然而,所有治疗组显示显著减少MMP-2活动(图4 (b))()。
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(b)
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类似的研究结果中观察到的表达MMP3基因和MMP-3活动(数据5(一个)和5 (b)),即生物因素,扶轮基金会、生育酚和井下电视显示的差别明显对这些MMP3基因在0.05倍、0.15倍、0.09倍和0.08倍,分别为()。生物因素,扶轮基金会,生育酚,它也显著下调MMP9基因与sip在0.71倍,0.35倍,0.14倍和0.12倍,分别(图6(一))。虽然生物因素、生育酚和它引起显著减少MMP-9活动相比,小口,TRF-treated集团高级MMP-9活动相比,生物因素(图6 (b))()。
(一)
(b)
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(b)
4所示。讨论
本研究评估生物因素的影响,tocotrienol-rich分数,和生育酚调节胶原蛋白合成和降解,为了阐明它们的底层机制预防皮肤老化。HDFs被暴露于长期低剂量的H2O2诱导过早衰老。H2O2被用于各种研究衰老感应代理,可能会产生类似的特征时间对诱导细胞衰老(15,17,21]。
逐步丧失皮肤组织由于恶化的细胞和细胞外基质组成部分真皮皮肤老化是至关重要的。皮肤的真皮层主要是由胶原纤维组成,组成的几种类型的胶原蛋白等类型,III和V (5]。胶原蛋白的营业额是至关重要的维持皮肤的结构和功能受损的生产会导致皮肤变薄,增加皮肤脆弱。因此,胶原蛋白合成和降解是我们研究的重点。我们的研究结果显示,长期低剂量接触的过氧化氢表达下调COL1A1和COL3A1基因的减少为I型胶原和III型胶原合成。这些发现支持报告从先前的研究表明,I型胶原蛋白的主要组成部分,真皮老化期间减少或光老化22,23]。
除了减少胶原蛋白生产、增加胶原蛋白降解可能导致崩溃成纤维细胞在衰老,导致年龄皮肤外观的改变13]。在这项研究中,MMP1,MMP2、MMP3和MMP9基因调节和金属蛋白酶- 1、MMP-2 MMP-3活动增加氧化压力诱导成纤维细胞。氧化应激引起的紫外线辐射、臭氧、H2O2,自由基可能导致激活AP-1,相应地增加基质金属蛋白酶表达和胶原蛋白降解[7]。此外,氧化应激和金属蛋白酶- 1的水平是协会报道费舍尔et al。8这是符合我们的发现。对基质金属蛋白酶的表达在老化中所观察到的结果到皮肤中胶原蛋白流失已报道突出,提出了衰老细胞的标志指定基质降解表型(23- - - - - -25]。
在这项研究中,我们专注于生物因素相结合的分子机制,扶轮基金会,生育酚预防皮肤老化。这项研究的结果表明,这些化合物调节胶原合成与降解培养HDFs的移植胶原合成和在基因和蛋白表达下调基质金属蛋白酶表达的水平。这些影响可以归因于这些化合物的性质。生物因素是胶原蛋白生产促进成纤维细胞复合,提高整合素的合成,防止或减少皱纹形成26]。它还能刺激胶原蛋白合成增加摄氧量在人类成纤维细胞(19),显示协同效应当结合其他活性化合物,提高产品效益(19]。
维生素E,一种强有力的抗氧化剂,进行清除ROS,被用于各种研究在过去几十年。在先前的研究中,维生素E已经被报告为一个有效的抗老化剂由于其抗氧化性质。它对其他有利影响,如在调制信号转导途径27- - - - - -29日]。大多数研究使用α生育酚作为维生素E(代表30.,31日]。然而,知名度较低的形式的维生素E, tocotrienols,被认为是更大的选择相比,生育酚(32]。tocotrienols都略高于天然维生素e的抗氧化活性,具有神经保护属性和展览抗癌和胆固醇降低属性通常不表现出的天然维生素e (13]。
我们的数据表明,生物因素、扶轮基金会和生育酚调节胶原蛋白基因和原骨胶原的合成增加。有趣的是,化合物相结合给一个更好的效果比单一治疗刺激胶原蛋白合成化合物。因此,生物因素的组合,扶轮基金会,生育酚是有效的将每个活性化合物的贡献。维生素E的有效性,采用结合生物因素可以假设,因为它们的抗氧化特性。然而分子机制还不是很清楚,尽管它可能与这些活性化合物的抗氧化性能和/或调节基因表达和信号通路的影响。
几项研究表明,对启动胶原蛋白的降解基质金属蛋白酶是至关重要的。胶原酶分泌到细胞外空间作为酶原和激活。它已经表明,MMP-2 stromelysin从结缔组织细胞分泌胶原酶一起在文化、被认为扮演一个角色作为胶原酶的激活剂。stromelysin的存在对完整的胶原酶的表达很重要活动(33]。这项研究的结果表明,生物因素,扶轮基金会,生育酚减少基质金属蛋白酶基因表达和降低基质金属蛋白酶的酶的活性。综合治疗与生物因素、扶轮基金会和生育酚产生更好的抑制胶原蛋白降解的影响比单一治疗。这种效应可以解释为防衰老的报告从最近的发现tocotrienol [34]。此外,生物因素已报告刺激人类成纤维细胞胶原合成增加摄氧量(19]。这项研究的结果表明,生物因素,扶轮基金会,生育酚协同作用在调节胶原合成与降解,产生更好的效果。
5。结论
生物因素、扶轮基金会和生育酚有效增强胶原蛋白的合成,抑制胶原降解所示upregulation胶原蛋白基因,I型和III型胶原合成和基质金属蛋白酶基因的调控,减少基质金属蛋白酶活性。这些属性可能表明他们的潜在保护皮肤老化。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究是由森达美Sdn有限公司,马来西亚批准号jj - 001 - 2008和马来西亚Kebangsaan大学批准号ukm - dlp - 2011 - 042。