文摘
锌或L-NAME管理已被证明是保护代理,减少氧化应激和细胞死亡。然而,锌和L-NAME腹腔内注射治疗尚未研究。我们工作的目的是研究锌的影响和L-NAME管理局nitrosative压力和细胞死亡。雄性Wistar鼠ZnCl处理2(2.5毫克/公斤每24小时,4天)和N -ω-nitro-L-arginine-methyl酯(L-NAME, 10毫克/公斤)第五天(1小时前常见的颈动脉闭塞(存储)。颞顶叶皮层和海马解剖,锌、亚硝酸盐,在不同的时间和lipoperoxidation化验。细胞死亡是由组织病理学化验使用hematoxylin-eosin染色和caspase-3主动免疫染色。锌亚急性管理存储减少锌的水平之前,亚硝酸盐,lipoperoxidation,在后期阶段的缺血细胞死亡。L-NAME政府老鼠用锌治疗显示增加锌含量的早期阶段,提高锌、亚硝酸盐,和lipoperoxidation水平,由坏死细胞死亡,细胞凋亡在后期阶段。这些结果表明,这两种治疗策略的使用增加了存储造成的损伤,与锌的单独管理。
1。介绍
中风导致残疾和死亡。大量研究表明,氧化应激的参与脑缺血损伤的原因。组织纤溶酶原激活物(tPA)的唯一FDA批准的药物治疗缺血性中风,但它的使用受到限制,因为它的不利影响(1]。有证据表明,锌是cytoprotector代理(2- - - - - -4),增加抗氧化能力和减少iron-catalyzed脂质过氧化作用,以及细胞凋亡(5]。
锌具有双重角色在中风的病理过程。锌的积累有细胞毒性性质(6- - - - - -12]。然而,政府锌原卟啉、锌离子,或原卟啉降低局灶性脑缺血(4),防止神经元死亡(2,3]。锌的有益作用是由其抗氧化性能。锌治疗可以防止脂质过氧化,提高谷胱甘肽的可用性在威尔逊氏病(13]。锌降低了通过抑制细胞凋亡的伯灵顿和贝克激活,细胞色素c的释放14]。此外,锌是一个强有力的凋亡蛋白酶抑制剂,caspase-3 [15,16],caspase-8 [17]。
研究表明一氧化氮(NO)参与锌积累,增加裂解caspase-3和lipoperoxidation在大脑的过程分18),通过从突触前释放锌按钮(19]。一氧化氮引起的释放锌金属硫蛋白的破坏zinc-sulphur集群没有伴随形成S-nitrosothiol [20.]。但是,没有发挥了至关重要的作用的保护肝脏氧化应激。机制包括其作为一种抗氧化剂代理的铁,降低大鼠肝细胞的氧化应激(21]或通过Akt-eNOS-NO-HIF在缺血后处理的途径22]。没有保护特性在大脑在急性缺血性中风,但NOS活性的增加导致微脉管系统的完整性和水肿形成的蚀变在脑缺血再灌注损伤大鼠,在不改变动脉血压和血流缺血性地区(23]。有证据表明,N -抑制没有ω-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME)增加锌水平,减少坏死心肌标志物水平检测等离子体的兔子(24]。然而,L-NAME政府减少缺血后细胞死亡(18]。
这些祖先支持这个想法,没有和锌在缺血过程中有双重的作用。然而,共同服用锌和NOS抑制剂的尚未定义。在这个工作我们研究锌的亚急性政府的预防效果(2.5毫克/公斤,每24小时4天)和L-NAME(10毫克/公斤,1小时前常见的颈动脉闭塞(存储)对亚硝酸盐水平,和生产malonyldialdehyde (MDA) + 4-hydroxialkenals(已经)在不同时间预处理和postreperfusion。组织病理学变化进行评估通过免疫反应性对裂解caspase-3 hematoxylin-eosin染色。我们的研究结果支持这样一个观点,没有在早期阶段cytoprotector代理和不作为细胞毒性剂在以后的阶段。锌政府独自cytoprotector对存储造成的损害作用,但共同服用锌的和L-NAME造成更大的伤害而分的过程。
2。材料和方法
2.1。实验动物
雄性Wistar鼠190 g和240 g之间获得CINVESTAV的植物园。动物被保持在足够的动物房间温度控制条件(22±1°C)和一个光暗周期(12 h-12 h明暗;光开始在0700年)。食物和水都是随意提供的。所有程序都按照墨西哥当前的立法,一名动物园- 062 - 1999 (SAGARPA),基于指南的护理和使用实验动物,美国核管理委员会。机构的动物保健和使用委员会(IACUC)批准了我们的动物使用程序的协议号码09 - 102。所有的努力都是尽量减少动物痛苦。
2.2。锌和L-NAME管理
老鼠分组到不同的治疗:(1)控制(没有治疗),(2)CZn96h;控制处理ZnCl2(2.5毫克/公斤每24小时4天),大脑得到的24 h, 48 h, h, 72和96 h postadministration, (3) Zn96h +存储;大鼠治疗亚急性锌和短暂缺血通过颈总动脉闭塞(存储),这是造成10分钟;大脑得到在不同的小时(4 h, 8 h, 12 h, 24小时,36小时,72小时,96 h和168 h postreperfusion), (4) Zn96h + L-NAME控制;老鼠接受了亚急性4天+ L-NAME锌管理(10毫克/公斤),和(5)Zn96h + L-NAME +存储;这些老鼠收到所有治疗,大脑得到了在不同的时间(4 h, 8 h, 12 h, 24小时,36小时,72小时,96 h和168 h postreperfusion)。
2.3。一氧化氮测定
颞顶叶皮质和海马体的研究组织(每组)机械均质磷酸盐溶液中(PBS), pH值7.4,离心机在12500 rpm 30分钟在4°C使用17 tr微型离心机(Hanil科学工业有限公司;Inchun、韩国)。没有生产是由亚硝酸盐的积累(评估)在匀浆上清液,所述其他地方(18,25]。简单地说,100年的亚硝酸盐浓度μL(浮在表面的测量通过比色反应生成的100μL格里斯试剂,由相同数量的0.1%的N - (1-naphthyl)磺胺在60%乙酸乙二胺盐酸盐和1.32%。样品的吸光度测定540 nm SmartSpec 3000分光光度计(Bio-Rad;赫拉克勒斯、钙、美国),使用标准曲线插值的纳米2(1到10μ米)来计算亚硝酸盐含量。
2.4。测量血压
血压测量在所有研究组织(在每组)。收缩期和舒张期血压测量使用tail-cuff方法通过使用XBP1000血压系统从肯特科技公司。收缩期和舒张期血压测量(±SE,毫米汞柱)在所有动物24小时之前和之后的每一个治疗如前所述[26]。
2.5。Lipoperoxidation
Malonyldialdehyde (MDA)和4-hydroxyalkanal(头脑)测定匀浆上清液的颞顶叶皮质和海马体的使用在其他地方描述的方法(18,25]。200年的比色反应μL的上层清液是由随后的0.650毫升的10.3毫米N-methyl-2phenyl-indole稀释混合的乙腈:甲醇(3:1)。反应是150年开始的μ甲基磺酸的L。反应混合物强烈涡流和孵化在45°C 1 h,然后在3000转离心10分钟。上层清液的吸光度是读586 nm SmartSpec 3000分光光度计(Bio-Rad;赫拉克勒斯、钙、美国)。吸光度值比较标准曲线的浓度范围0.5 - 5所示μM 1, 1, 3, 3-tetramethoxypropane股票(10毫米)来计算malonyldialdehyde 4-hydroxyalkanal内容和样品。
2.6。Immunolabeling劈裂Caspase-3
分析了免疫反应性对裂解caspase-3免疫组织化学方法(25]。4%多聚甲醛固定的大脑PBS是保持在PBS含30%蔗糖在4°C。然后,每个大脑被冻结,分为10μ使用徕卡m片在冠状面SM100低温恒温器(徕卡微系统,胡桃胡同,德国)。片被单独收集24-well板包含PBS和用于免疫组织化学裂解caspase-3。片是孵化与PBS-Triton(0.1%)和后来在PBS-Triton 10%马血清(0.1%)在室温下60分钟。一夜之间,片被孵化的兔多克隆抗体对裂解caspase-3(1: 300稀释;细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),然后1:600稀释的二级生物素化的山羊抗体anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)在室温下2小时。冲洗后,切片与streptavidin-horseradish孵化过氧化物酶共轭(美国马里兰州盖瑟斯堡BRL Inc .,)和稀释1:400年,再在室温下30分钟。过氧化物酶反应是由0.02%的沉浸在刚做好的解决方案3,3′-diaminobenzidine(轻拍,σ)。片与甲苯基紫复染色。的caspase-3免疫反应性分析的放大5倍,20 x,和40 x使用徕卡DMIRE2显微镜(徕卡微系统公司位于德国)。图像数字化的徕卡相机DC300F(徕卡微系统、胡桃胡同、德国)和分析与工作站徕卡FW4000中的例子版本(是processing V1.2.1徕卡Microsystems Vertrieb GmbH是一家; Bensheim, Germany).
颞顶叶皮质和海马体的组织病理学研究大脑的每个实验小组在冠状切片分析hematoxylin-eosin染色在24小时和7天postreperfusion (在每组)。3μm石蜡包埋组织切片苏木精和伊红染色和检查的放大目标40 x (Mod BM 1000徕卡,Jenopika相机,位于德国)。数码显微图是由5个随机选择的字段的每个组织切片的每个实验组(进步捕捉pro 2.1,徕卡)。
2.7。统计分析
所有值均值±SE获得至少5独立的实验。分析了差异的意义一个方差分析测试和因果Dunnet测试与对照组比较,一个未配对的学生t以及组间比较。数据分析使用图形垫棱镜软件(版本5.00)。被认为是在一个重要的价值。
3所示。结果
均质上层清液的锌含量确定颞顶叶皮层在不同时间,存储在大鼠治疗前后锌的存在与否L-NAME(图1)。锌的亚急性政府对照组显示增长79%±9%锌水平在颞顶叶皮层第三天,回到基础水平的第四天政府(图1)。老鼠用锌治疗导致的存储增长55%±5%,4 h和43%±14%的6 h postreperfusion,回到基线在24 h postreperfusion,维持这个水平在168 h(图1)。L-NAME政府之前存储在老鼠用锌治疗引起几个锌水平的增加,从时间0 (CZn96h) 112%±3%,减少4 h postreperfusion。第二个增长70%±18%是观察到36 h,三分之一增长103%±41%在72 h postreperfusion观察,观察,然后减少68%±6%在96 h,再次回到基线在168 h,再灌注后(图1)。
亚急性管理锌对照组显示增长58%±15%的亚硝酸盐水平第四剂量的管理(图2)。造成的存储增长45%±8%在治疗大鼠4 h postreperfusion锌、减少8 h,但维持在168 h postreperfusion(图2)。然而,老鼠L-NAME政府处理锌在第一次36 h postreperfusion亚硝酸盐含量下降,但引起了从48 h postreperfusion增长282%±74%,这个水平维持在72 h,然后回到基线168 h postreperfusion(图2)。
大鼠的收缩压是测量之前(P1)和之后(P2)治疗。亚急性锌缺乏L-NAME管理局并没有改变前后的收缩压治疗,而没有治疗控制。然而,在大鼠亚急性政府处理锌的L-NAME显示增加收缩压25 (P1毫米汞柱,P2毫米汞柱)。
评估腹腔内锌和L-NAME管理局是否会引起细胞损伤,几个标记的损害(脂质过氧化和caspase-3)进行了研究,分析了和细胞死亡hematoxylin-eosin染色。
锌引起亚急性管理增加了58%±15% MDA +头脑水平第四剂量,回到基线在上届政府后24小时(时间0;图3)。老鼠的存储处理锌并没有改变MDA +头脑水平超过168 h后再灌注(图3)。然而,L-NAME政府之前存储的老鼠用锌治疗显示增长68%±6%在12 h postreperfusion,最大程度的116%±7%,24 h,回到基线,然后第二个增长70%±5%以168 h postreperfusion(图3)。
定性的组织病理学研究表明,锌管理存储前预防细胞死亡,而导致老鼠用锌治疗L-NAME坏死和凋亡的形态学变化(图4)和更高的裂解caspase-3 IR细胞24小时(数据未显示),增加在第七天postreperfusion(图5)。
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亚急性政府的组织病理学研究表明,锌维持细胞结构的海马CA1, CA3,齿状回,和大脑皮层锥体神经元的24小时postreperfusion但形态学的变化造成的颗粒细胞CA1和CA3在再灌注后第七天,细长的细胞的影响,而齿状回在24小时,7天postreperfusion恢复正常形态。脉络丛的形态变化不显著,但嗜碱细胞中细胞核(图4)。然而,锌和管理L-NAME降低颗粒的细胞核的颜色强度CA1, CA3,和齿状回一天7 postreperfusion,表明海马的细胞坏死和嗜碱性的原子核在齿状回,可能是由于细胞凋亡。脉络丛显示的颜色强度减少核在再灌注后第七天(图4)。
亚急性锌政府造成的数量略有增加免疫反应性(IR)细胞对裂解caspase-3齿状回的颗粒层(dg)和V层(LV)颞顶叶皮层(箭头)第七天postreperfusion控制老鼠(图5)。然而,锌的亚急性政府也显示略有增加的裂解caspase-3 IR在第七天postreperfusion在这两个地区,而L-NAME政府老鼠用锌治疗增加了caspase-3红外齿状回的颗粒细胞层(dg)和五层(LV)在24 h postreperfusion颞顶叶皮层;然而,在第七天postreperfusion更明显。下丘脑的其他地区也受到了影响(数据没有显示)。此外,尼氏小染色(蓝色)显示,颗粒层颜色强度下降,这是更明显的LV的颞顶叶皮质锥体细胞,细胞水肿(箭头所指),这些结果表明细胞坏死的老鼠群Zn96h + L-NAME +存储(图5)。
4所示。讨论
亚急性管理显示锌cytoprotector效应导致lipoperoxidation下降和免疫反应性裂解caspase-3通过防止锌的积累和增加的生产分过程的后期阶段。然而,共同服用锌和L-NAME的(两种抑制剂没有生产)显示细胞毒性效应在老鼠大脑缺氧缺血,增加lipoperoxidation和裂解caspase-3 IR细胞从一个分过程的早期阶段,通过锌积累在早期阶段和增加锌和后期的生产阶段。
预防性管理锌在缺氧缺血有保护作用;类似的结果已报告之前(2,3,5]。其他报告显示神经保护当神经元PC12细胞preincubated锌盐,而不是coincubation [27]或预防锌大鼠亚急性管理(2]。
我们的工作表明,预防性亚急性管理防止锌的增加引起的不存储在后期阶段,保持第一增加没有分过程的早期阶段。没有在早期阶段的有益作用与血管舒张的生产(28和金属硫蛋白合成29日,30.]。此外,没有作为一种抗氧化剂iron-mediated在鼠肝细胞氧化应激,抑制的lipoperoxidation [21]。据报道,没有参与缺血后处理过程不以挪士通路和衰减的增加肝脏的缺血再灌注损伤(22]。cooper-zinc之前的报告表明,抗氧化剂酶超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)减少氧化应激产生的任何来自伊诺糖尿病动物(31日)在母亲的糖尿病和心脏胚胎病(32]。
本构NOS的稳定(cno)锌(33,34)可以解释没有水平的增加在第一小时分过程,这就增加了cNOSs postreperfusion在第一个小时(35]。锌政府阻止第二增加没有存储在24 h,正如前面报道(18]。此外,锌抑制NFκB和进气阀打开蛋白质的合成36),据报道在12 h postreperfusion [35]。
补锌的有益作用是调节nitrosative应力,诱导抗氧化制剂如谷胱甘肽(13,37和金属硫蛋白5通过Cu-Zn-SOD],提高抗氧化能力,储存在细胞内锌室(38,减少过氧化氢酶、谷胱甘肽S-transferase活动(37]。
增加老鼠对锌中锌水平可能导致一个预处理,锌的激活依赖caspase-3可以负责乳沟多adp核糖聚合酶(PARP),造成伤害的减少在随后的毒素暴露(39]。有证据表明,细胞外锌积累可能是保护的预防overactivation NMDA受体。此外,subtoxic积累细胞内锌可能触发预处理效果,减少后续缺血的易感性39]。
锌在亚急性管理存储导致细胞凋亡的减少24 h和再灌注后的第七天,这已经被我们先前报道18)和其他研究人员在糖尿病小鼠的心32]。的减少裂解caspase-3锌可以解释因为锌能够直接抑制caspase-3[的活动15,16)和caspase-8,减少细胞死亡17),因为减少proapoptotic蛋白质(伯灵顿和Bak),或抑制cytocrome c版本(14]。
众所周知,没有参与锌积累和细胞死亡(18,40- - - - - -43),N -单独管理ω-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME)减少了脑梗塞44],NOS活性,水肿[23),和细胞死亡24小时postreperfusion [18]。两种抑制剂没有生产管理(锌+ L-NAME)导致增加收缩压和河鼠大脑皮层的细胞死亡。一些报道发现,没有生产导致高血压的长期抑制45),降低了等离子体水平的锌,造成小范围的心肌凝固坏死(24]。
锌和L-NAME引起亚急性管理增加锌的第一个和最后一个小时,在锌的增加可能导致氧化应激没有没有在第一个小时,没有捕捉自由基,防止lipoperoxidation [46]。阶段末的增加锌生产lipoperoxidation的增加引起的。锌的增加可能会引发活性氧的生成(由线粒体、NADPH-oxidase和其他来源),这可能会导致细胞内锌通过压敏电阻器动员钙通道(47]或ZIP,突触前的过度释放锌(在微摩尔的浓度)48,49),而锌积累在突触后神经元(48)和线粒体(50]。这些机制可以产生损伤神经元(颗粒细胞和锥体神经元)和神经胶质,其他地方的报道(8,51]。因此,过量的锌积累在早期和晚期阶段可能是细胞毒性,增加支持的早期阶段的细胞凋亡和坏死晚期阶段。这些研究结果一致的细胞毒性效应(锌52,53),锌的功能依赖于浓度,空间和时间的受伤的细胞反应。
5。结论
没有生产的两种抑制剂治疗(锌和L-NAME)增加了细胞坏死和细胞凋亡的影响海马体和大脑皮质层V瞬态存储10分钟后通过nitrosative压力的增加,锌积累,和lipoperoxidation。这是相反的,发现的亚急性政府只有锌在存储之前,导致cytoprotector效应,减少nitrosative后期压力和锌积累阶段。
这些结果提供证据考虑两种治疗方法的使用,作用于诺,以减少损害脑缺血过程中表现出短暂的缺血患者和高危患者的中风或脑血管疾病。
利益冲突
作者没有金融、个人或其他关系与他人或组织的5年内开始提交的工作。作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持的j - 34143 (BAL-C)赠款VIEP-BUAP G / Nat / 2012 (BAL-C)。维克多•曼努埃尔•布兰科阿尔瓦雷斯,帕特里夏·洛佩兹莫雷诺和瓜达卢佩Soto-Rodriguez是从CONACYT获得奖学金的。我们感谢CINVESTAV老鼠的生产和维护。我们应感谢博士埃利斯装玻璃的英语文本的编辑。