文摘
人类血液样本的随机筛选24个人不抽烟的人进行检查淋巴细胞的DNA氧化损伤水平之间的相关性和血清的抗氧化能力或基本切除修复(BER)淋巴细胞的活性。氧化DNA损伤水平与彗星试验测定含台塑/ Endo三世乳沟,和系统活动估计改良彗星试验包括核提取淋巴细胞酶的乳沟。抗氧化能力测定trolox等效抗氧化能力测定。我们发现虽然内生DNA氧化水平不同的个体,每个个体层面似乎稳定至少1个月。我们的研究结果表明,氧化DNA损伤程度与抗氧化能力是无关紧要的或弱相关或系统活动,分别。然而,淋巴细胞的载体幽门螺杆菌(惠普)或乙型肝炎病毒(HBV)倾向于给更高级别的DNA氧化损伤()。虽然血清的这群人没有特定的趋势与抗氧化能力降低,淋巴细胞的活动各自的误码率降低平均()。因此,减少维修活动可能与惠普或乙肝病毒感染的基因毒性效应。
1。介绍
内生的DNA损伤由于氧化应激水平人类外周血淋巴细胞(PBL)已经被广泛用作生物标记物研究与疾病相关的基因毒性影响,微生物感染,老化,或者外生代理1- - - - - -7]。然而,DNA损伤水平提出了先前的研究通常是在一个单点采集时间;目前尚不清楚损害程度的担忧是稳定一段时间,例如,一个星期或一个月或更长时间。在这个报告中,我们表明,内生淋巴细胞的DNA氧化水平从每个个体持续至少1个月(见下面)。我们测量了淋巴细胞的DNA氧化水平与改良彗星试验,其中包括一步酶乳沟的细菌台塑/ Endo三世,分别识别氧化嘌呤和嘧啶(8,9]。我们认为这种损害程度的PBL可以调节血清的抗氧化能力或淋巴细胞的修复活动。像DNA损伤的测量在PBL,血清或血浆中抗氧化能力一直被用作各种生物标志物研究[10]。相比之下,PBL作为生物标志物的修复活动只是开始得到关注(11]。修复活动可以与质粒受损评估特定的代理或合成寡核苷酸特定为特定病变(12,13]。修复DNA损伤(包括切除和填缝活动)表示公司的P32-labled核苷酸。另一方面,特许权DNA氧化损伤的活动可以评估一个修改版的彗星试验,细胞或核提取物用于取代Endo III /台塑。细胞(不是提取物)治疗常数量的H2O2或其他氧化代理嵌入凝胶和作为底物为目的14,15]。
测试如果PBL的稳态水平的氧化DNA损伤是通过控制调节血清的抗氧化能力或PBL的维修活动,24外周血样本获得个人的常规体检都检查了。我们的研究结果表明,氧化DNA损伤的程度在PBL与血清抗氧化能力但弱相关淋巴细胞活动不与误码率。同时,我们发现PBL的载体幽门螺杆菌或乙型肝炎病毒有更高水平的DNA氧化损伤,方方面面的活动而不是血清抗氧化能力可能属性。
2。材料和方法
2.1。病人和样品
24血液样本被随机收集来自个人(男性和女性)20 - 40岁,不吸烟,危险,在相似的生活/工作环境。四个志愿者(男性和女性)在图描述的实验1危险是25 - 35岁,不吸烟,不喝酒,显然健康、生活/工作在类似的环境。台湾的研究机构审查委员会批准(13嗯是189)。
2.2。淋巴细胞的分离
淋巴细胞分离得到血液样本与前面描述的修改程序16]。血液样本离心机(1400每分钟3000转在22°C) 15分钟从血细胞分离血清,和血清的抗氧化能力测定的离心管收集。离心管的底部的细胞在PBS resuspended 1: 1比和悬浮分层在4:3比例的ficoll-paque +(通用电气医疗集团17-1440-02)在另一个离心管。全会众的血细胞离心机在同一实验条件前面描述和淋巴细胞的收集层等离子体和ficoll-paque层之间。这些细胞被洗两次分析之前用PBS。细胞的一部分被用于氧化DNA损伤实验,另一部分细胞用于修复活动的实验。
2.3。检测与台塑化验Comet-EndoIII /氧化DNA损伤
前面描述的方法(17)之后。总之,传统碱性彗星试验程序进行获取类核在琼脂糖凝胶幻灯片。每个幻灯片是孵化2单位EndoIII和台塑(美国马里兰州盖瑟斯堡Trevigen, Inc .,)缓冲区的10毫米Tris-HCl pH值为7.4 1 h在一个密封的37°C,潮湿。EndoIII台塑都是明确识别细菌糖基化酶和氧化嘧啶和嘌呤,分别。类核酶消化后,DNA是碱性变性,然后用电泳分离。类核与propidium碘染色后用荧光显微镜检查;每张幻灯片的图片至少50类核记录与闭路显示CCD相机(蔡司/ Axioskop 2年检+)。从每个细胞的细胞核DNA的迁移测量与计算机程序(http://tritekcorp.com/),表示为% DNA的尾巴。
2.4。Trolox等效抗氧化能力分析(问题)
(描述的标准问题分析18)和(19)已经使用少量修改问题价值的决心。这个试验评估总自由基清除能力基于一种化合物的清除能力稳定abt(西格玛奥德里奇,没有。A9941-5TAB激进(abt)•在6分钟)。蓝绿色的abt•是7毫米abt和2.45毫米之间通过反应过硫酸钾在水里。这个解决方案是存储在黑暗中使用前12 - 16 h在4°C。abt的消光系数•在734纳米是1.5×104摩尔−1l cm−1。集中abt•与磷酸缓冲盐溶液被稀释(PBS), pH值7.4最后的吸光度在734 nm 37°C(即。,一个abt•浓度约为47μ米)。股票解trolox(西格玛奥德里奇,没有。23881 - 3)在乙醇和作为标准曲线。为样本,100μL血清添加到900人μL abt•解决方案和734海里的吸光度测定。相比,这是一个空白,100μL的PBS是添加到900年μL的abt•解决方案。吸光度测定的初始减少3分钟后添加抗氧化剂与常数混合时间(约10秒)。血清的问题是计算有关的降低吸光度的变化trolox浓度作为标准曲线和规范化与蛋白质数量决定BCA试剂盒(皮尔斯化工有限公司,切斯特,英国)。
2.5。制备核提取物(NE)淋巴细胞和Comet-NE试验来确定基本切除淋巴细胞的活动NE 24血液样本
核提取物的准备comet-NE试验(见下文)是描述在我们之前的研究17]。简而言之,这个孤立淋巴细胞第一次接受2.5毫米羟基脲和25μM胞嘧啶-β- - - - - -D-arabinofuranoside 16 h。羟基脲、核苷酸还原酶的抑制剂和胞嘧啶-β- - - - - -D-arabinofuranoside, DNA聚合酶的抑制剂,用于防止comet-NE DNA合成试验。细胞被洗的低渗的缓冲区(20 mM玫瑰,pH值7.5,5毫米氯化钾,0.5毫米MgCl20.2、0.5毫米二硫苏糖醇、蔗糖),并允许在低渗的缓冲区没有膨胀蔗糖10分钟在冰上。然后细胞肿胀破裂10中风的Dounce均质器和匀浆被迫通过22 G针10次。每个混合离心机,享年2000岁5分钟和核丸resuspended缓冲区(20毫米玫瑰,pH值7.5,5毫米氯化钾,0.5毫米MgCl2、0.5毫米二硫苏糖醇、10%蔗糖)和存储在−70°C。原子核在冰上融化,被允许膨胀在100毫米在冰生理盐水1 h。15000年核离心机在破裂20分钟在4°C,和上层清液过滤通过YM-10 Microcon过滤器(微孔,贝德福德,妈,美国)。蛋白质浓度测定用BCA试验设备;牛血清白蛋白作为标准。
Comet-NE化验的程序类似于comet-EndoIII台塑化验/除非酶孵化NE的淋巴细胞,但没有Endo III /台塑进行。常数NE(约0.6μg)在东北缓冲区包含50 mM Hepes-KOH (pH值7.9),70毫米氯化钾,MgCl 5毫米2ATP, EDTA 0.4毫米,2毫米,2.5毫米40毫米磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶是每个幻灯片上添加。同时,确定基本切除活动,amoxicillin-treated (1 h 5毫米)人类AGS细胞被用作comet-NE测定细胞基质。以前,我们报道,阿莫西林氧化引起的DNA损伤(8,20.]。
2.6。细胞培养
AGS人类胃腺癌的细胞用于本研究最初从美国获得类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。AGS细胞生长在1 x RPMI介质(西格玛奥德里奇,不。R6594)。所有细胞培养媒体与10%胎牛血清(补充的边后卫;西格玛奥德里奇,不。19003 C), 0.03%谷氨酰胺和细胞种植在37°C在水饱和的气氛中含有5%的股份有限公司2。
2.7。免疫试验
感染幽门螺杆菌(惠普)或运营商乙型肝炎病毒(HBV)被确定DPC IMMULITE 2000(全球西门子、德国)检测的免疫球蛋白幽门螺旋杆菌或乙型肝炎病毒的表面抗原。
2.8。数据分析
所有的实验都独立进行至少三次。数据表示为±SE。学生的以及用于统计分析。一个值< 0.01被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。淋巴细胞的氧化损伤水平是稳定的
虽然氧化DNA损伤的人类淋巴细胞作为生物标志物水平调查干预的抗氧化剂,经常测量是单一时间点。淋巴细胞的DNA氧化损伤水平是否从一个个体稳定的在一段时间内,例如,月,尚不清楚。因此,我们做了一个实验涉及四个看似健康的志愿者,并使用comet -EndoIII /台塑试验对淋巴细胞DNA损伤水平进行监控一个月。结果表明,个体之间的氧化损伤程度不同;然而,每个水平都相对稳定在一个月内,除非略有下降趋势的损伤水平的个人指出在此期间的时间特别是那些伤害较低水平(图1)。人类AGS细胞治疗与阿莫西林、氧化应激诱导物,实验中使用了积极的控制(巷图1)。
3.2。个体变异的氧化的外周血淋巴细胞的DNA损伤
24的氧化DNA损伤水平血液样本随机收集来自个人对普通体检测量。给出的测试样本标签根据各自的氧化DNA损伤水平从低到高的顺序(见图2),表明变异可以高达10倍。
彗星试验的水平没有EndoIII /台塑,确定10的24个血液样本,,正如所料,非常小的(% DNA尾)。这样的水平相比可以忽略不计,如果水平取决于与EndoIII /台塑彗星试验。
测试样本中,这些患者感染的幽门螺杆菌(惠普)或运营商乙型肝炎病毒(HBV)测量后发现氧化DNA损伤水平。样品从惠普或乙肝病毒携带者显然倾向于在右手边,也就是说,站在高氧化DNA损伤水平。这是通过比较的方法支持氧化DNA损伤级别:%为惠普运营商;%为乙肝病毒和%(非)。因此,淋巴细胞从惠普或乙肝病毒携带者氧化DNA损伤明显高于非携带者。
3.3。个体变异的外周血淋巴细胞DNA氧化损伤的不是与血清的抗氧化能力有关
探索的因素影响淋巴细胞的DNA氧化损伤水平,血清抗氧化能力的测定和各自的测量也显示从低到高的顺序,而样品标签保持之前(图给出的相同3(一个))。以来的抗氧化能力不再是1到24,很容易得出这样的结论:没有相关性(正面或负面)氧化DNA损伤程度与血清的抗氧化能力。此外,血清样本中抗氧化能力的变化是最多6折,不那么戏剧性的DNA氧化损伤。这个结论也是如此,如果氧化DNA损伤水平绘制抗氧化能力如图3 (b)。
(一)
(b)
此外,血清样品的抗氧化能力从惠普或乙肝病毒携带者不显示任何偏好低或高(图3(一个)),这表明血清的抗氧化能力不是大大影响由于惠普或乙肝病毒感染。
3.4。幽门螺杆菌或乙型肝炎航空公司不活动修复DNA氧化损伤较低
探索是否修复能力发挥任何作用在氧化DNA损伤程度的淋巴细胞,修复活动amoxicillin-induced DNA损伤是化验淋巴细胞的核提取血液样本进行测试。阿莫西林由我们已被证明导致氧化应激(8,20.]。修复活性测定结果如图4(一)表明测试样本之间的差异可以超过10倍,戏剧性的变化的氧化DNA损伤水平。修复活动与氧化DNA损伤水平是弱相关的以消极的方式(;参见图4 (b))。
(一)
(b)
测试活动水平较低(图的可能性4(一))可能是核提取制备的工件,各自活动修复UV-induced DNA损伤是化验。结果表明,其中一些NE样本(如样品编码16和7)表现出高尼珥活动(图5(一个)),这表明他们的低误码率活动期间不能归咎于工件不准备。同时,互补的修复活动时可以看到NE和样品检测不到活动是复杂的(图5 (b))。
(一)
(b)
此外,它是指出,惠普维修活动不样本或乙肝病毒携带者低于noncarrier:%与%(意味着±SE;)。
4所示。讨论
4.1。人类淋巴细胞的氧化损伤程度并不与血清抗氧化能力或基本切除修复活动的核提取淋巴细胞
知道人类淋巴细胞的氧化损伤程度与血清抗氧化的能力,我们首先检查如果个人DNA氧化损伤程度的淋巴细胞稳定的在一段时间内,例如,数周或数月。先前的研究关于人类淋巴细胞氧化损伤的主要显示单个时间点的值。我们的研究结果的基础上四个人表明淋巴细胞的DNA氧化损伤水平稳定至少一个月。结果表明,每日三餐,尤其是食品偶尔或药品管理的可能,没有影响淋巴细胞的DNA氧化损伤水平。个人自损害水平不同,慢性疾病的遗传或病理背景似乎是决定性的。另一方面,血清抗氧化能力已被证明是不受采样时间21]。我们的研究结果表明,氧化DNA损伤的程度在PBL与血清抗氧化能力但弱相关的误码率在淋巴细胞不活动;换句话说,淋巴细胞DNA损伤修复活动但不是血清抗氧化能力有一定的作用在决定氧化的稳定状态的淋巴细胞DNA损伤水平。
氧化淋巴细胞的DNA损伤水平可能8-oxo-7的水平来衡量,8-dihydro-2′脱氧鸟苷(8-oxodG)和高效液相色谱法或彗星试验EndoIII /台塑敏感的场所。类似于我们的观察,氧化DNA损伤水平个体之间的差异已经被前面的调查人员指出[22- - - - - -25]。8-oxodG的水平在健康个体差异大约10倍(24]。先前的研究已经表明,PBL的平均水平的氧化DNA损伤随不同的人口24),在这方面支持,遗传背景中扮演的角色。其他的研究也表明,疾病,如癌症、糖尿病患者,cardiopathologic条件提高的均值水平氧化DNA损伤的PBL (26,27]。柯林斯et al。28]表明氧化DNA损伤水平呈正相关,结直肠癌在男性和女性胃癌呈负相关。
的抗氧化能力研究总抗氧化能力(表达的问题),这是由各种血清成分包括蛋白质、脂类和小分子。之前的研究表明,蛋白质和尿酸盐贡献了约52%和38%的总抗氧化能力,分别是(29日]。由于血清蛋白质和尿酸盐的浓度通常是不受短期饮食治疗,总抗氧化能力将受到食品或其他营养补充剂。虽然是更精确的知道单个组件在血清的抗氧化能力,它是技术上更有挑战性的单个组件的分离和鉴定是必要的。实际上,等离子体水平的抗氧化剂之间的关系等α生育酚或β胡萝卜素和抗坏血酸盐和内源性DNA氧化损伤被发现微不足道30.]。另一方面,整体或总抗氧化能力(问题在我们的研究中使用)广泛应用于先前的研究。之前的研究显示,问题是与其他类似的方法比较,表明小变异(< 10%)在健康个体的总抗氧化能力(29日]。因此,问题分析是相关分析我们的目的。
本研究的结论不应该被抗氧化剂的膳食补充剂没有影响PBL的氧化DNA损伤水平。事实上,Duthie et al。30.)报道,氧化DNA损伤水平与血浆水平并不相关α生育酚或β胡萝卜素和抗坏血酸盐的个体正常的健康男性的吸烟者和非吸烟者。这与我们的是一致的结论:没有氧化DNA损伤程度之间的相关性和问题的水平。然而,在他们的研究中,20周的饮食补充维生素C,维生素E,β胡萝卜素减少内生PBL(从氧化DNA损伤来)。应该注意,减少小于2倍,这表明饮食效果并不足以解释野生PBL内生DNA氧化损伤的变化。因此,我们的研究并不违背发现布雷维克et al。31日),有报道称,膳食补充剂和一些植物产品数量增加55%,减少尼珥39%,与猕猴桃尼珥(−38%)和BER(无效)。这两项研究是不同的上下文。
4.2。淋巴细胞的氧化损伤水平和基本切除修复能力幽门螺杆菌(惠普)或乙型肝炎病毒(HBV)航空公司
我们的研究结果表明,个人或乙肝病毒感染HP往往有更高的氧化在淋巴细胞DNA损伤水平。这样的观察是一致的结论之前的报告,HP感染会增加淋巴细胞的DNA损伤(32),与临床观察一致,惠普或乙肝病毒携带者有更高的患癌症的风险苦难(33,34]。我们的研究表明,DNA损伤修复活动但不降低抗氧化能力更相关的高氧化DNA损伤水平。为什么惠普或乙肝病毒的感染损害淋巴细胞的修复能力尚不清楚。HP感染对误码率的影响进行了研究。APE1,人类的核酸内切酶处理基本网站中形成的误码率,可能表达下调或调节根据实验条件(35,36]。作为活性氧物种已经众所周知与HP感染有关,方方面面的作用来防止肿瘤发生由于HP感染已被公认。另一方面,最近的研究表明,HBV X蛋白,在结构上类似于人类DNA胸腺嘧啶糖基化酶(隔离),系统的一个关键酶,抑制TDG-dependent误码率(37]。我们的维修活动初步研究互补显示承诺的研究探索活动分子机制导致低误码率。
5。结论
在这个研究中,我们已经表明,淋巴细胞的DNA氧化水平稳定超过一个月。PBL不是DNA氧化损伤的水平与血清抗氧化能力但弱相关淋巴细胞活动不与误码率。我们的研究表明,淋巴细胞的血液样本的载体幽门螺杆菌和乙型肝炎病毒相比那些非携带者,氧化DNA损伤水平较高和较低的维修活动。