文摘

线粒体呼吸链(RC)赤字,导致增强线粒体ROS (mro)一代,星形胶质细胞的病理基础。然而,mtDNA-depleted细胞(ρ⁰)已报告缺乏RC敏感或耐药细胞凋亡。在这项研究中,我们试图确定RC-enhanced线粒体氧化侮辱后压力的影响。使用非侵入式荧光probe-coupled激光扫描成像显微镜的抗氧化应激能力和水平的mro和线粒体钙(mCa形成^{2 +})是两个不同星形胶质细胞细胞株之间相比,控制和ρ⁰星形胶质细胞,随着时间的推移在氧化应激。我们的研究结果表明,细胞质膜就洋溢着YO-PRO-1 RBA-1和染料在150和130分钟ρ⁰星形胶质细胞,分别。在RBA-1相比,30分钟后20毫米H₂O₂曝光,ρ⁰星形胶质细胞形成的等离子体膜气泡,失去了保留Mito-R的能力,显示凝结核。重要的是,H₂O₂全身的ROS和mCa陪同^{2 +}高程控制显示水平高于ρ⁰在早期的时间点但亦然晚时间点。少我们的研究结果强调双阶段RC-defective细胞窝藏线粒体压力由于低RC活动在短期内氧化应激但mROS-mediated mCa增强^{2 +}压力在严重氧化的侮辱。

1。介绍

星形胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型提供支持和营养神经元在中枢神经系统(CNS)。星形胶质细胞和神经元之间的串扰是至关重要的维持中枢神经系统内稳态。许多神经系统疾病是由于扰动产生的星形胶质细胞和神经元之间的相互作用,如脑缺血、神经退化,脑水肿,肝性脑病1]。Astrocyte-mediated神经保护提出了由于能量代谢的维护,调整渗透性的音量调节(2),突触传递和神经与血管的耦合的控制(3- - - - - -7,从excitotoxins神经元死亡的限制,氧化剂如谷氨酸和活性氧(ROS) (8,9]。至关重要的是,星形胶质细胞增强神经元通过释放细胞内高水平的抗氧化剂的抗氧化防御神经元周围的细胞外液(10]。

线粒体呼吸链(RC)对细胞的存活至关重要是因为在ATP生成其主要作用。在生理条件下,线粒体ROS (mro)生成的RC在ATP合成由于电子的泄漏主要来自复杂的我,复杂的三世和最近复杂的二分子氧(O₂)[11- - - - - -13]。然而,增强在RC mro形成明显缺陷(14]。星形胶质细胞的分子发病机制可以发起和增强线粒体氧化应激,这是由于增强mro的一代。线粒体氧化应激不仅导致能源供应的中断也严重损害线粒体组件包括蛋白质,脂类,线粒体DNA (mtDNA)。此外,氧化应激往往伴随着线粒体钙(mCa^{2 +})过载,导致的mro增加(15]。随后,这些应力协同作用增加氧化应激导致的恶性放大激活线粒体通透性转换(MPT)的依赖和/或MPT-independent线粒体释放致命的蛋白质包括细胞色素c的intermitochondrial空间;这些变化达到高潮的“临界点”细胞凋亡(16]。因此,钢筋混凝土损伤可能是削弱astrocyte-mediated神经保护的关键机制。

ρ⁰细胞被定义为那些缺乏线粒体基因组编码2 rrna, 22个图示,形成钢筋混凝土和13个蛋白亚基复合物,III, IV, v .因此,ρ⁰细胞株是一个在体外模型研究RC在中枢神经系统损伤和疾病的作用。争议存在相反的能力ρ⁰细胞产生保护作用:他们很敏感17,18耐]或[19,20.细胞凋亡。由于钢筋混凝土是细胞死亡的一个关键组成部分,它在凋亡中的作用了解监管是必要的。

在最近的研究中,我们试图评估RC-enhanced线粒体应激的影响在星形胶质细胞氧化的侮辱。为了这个目的,我们比较了两种不同的星形胶质细胞之间的抗氧化应激能力的细胞系,正常(控制)和ρ⁰星形胶质细胞,随着时间的推移。我们的结果表明,ρ⁰星形胶质细胞显示适度的mro和mCa^{2 +}杂志在轻微的氧化应激,但增强的mro和mCa的形成^{2 +}在严重氧化的侮辱。

2。材料和方法

2.1。细胞的准备

正常老鼠大脑星形胶质细胞(RBA-1)用于本研究最初是建立在一个连续的通过主要星形胶质细胞分离抱JAR-2, F51老鼠大脑博士周素卿et al。21]。所有细胞都生长在杜尔贝科修改鹰的介质(美国纽约生活技术,大岛屿)补充10% (v / v)胎牛血清。这些细胞被镀在玻璃盖玻片(模型没有。1,VWR科学,旧金山,美国CA)涂上了poly-L-lysine。实验后的细胞增长到80 - 90%(大约2 - 3天)文化融合。mtDNA-free细胞,ρ⁰是来自人类143 b骨肉瘤细胞治疗溴化乙锭(100μg / mL)。ρ⁰细胞被维护在杜尔贝科修改鹰中含10%胎牛血清补充葡萄糖高(4.5 g / mL),丙酮酸(0.11毫克/毫升),尿苷(0.1毫克/毫升)。

2.2。化学和荧光染料研究线粒体的加载函数

所有化学品都来自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)和荧光染料分子探针买来Inc .(尤金,或者美国)。线粒体功能成像研究线粒体形态、mro形成、线粒体膜电位(DeltaPsi (m))变化,mCa^{2 +}监管和MPT的开放使用特定的荧光探针。图像线粒体形态,细胞含有mitochondrial-targeted荧光探针,Mito-Tracker绿色(Mito-G,让绿色荧光)或Mito-Tracker红(Mito-R给红色荧光),在100 nM的浓度。发现DeltaPsi (m)使用200 nM和比率指标5 5′,6′6 -tetra-chloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘(JC-1)或300海里四甲基罗丹明乙酯(TMRM)。细胞内活性氧的形成和mro可视化使用乙酰酯形式的2μMdichlorofluorescein (DCF-DA)和100 nM dihydrorhodamine 123 (d - 123),分别。mCa^{2 +}被发现使用1μM Rhod-2 / AM。荧光探针都装载在室温20 - 30分钟。加载后,细胞与HEPES-buffered盐水冲洗三次(140 mM:氯化钠、5氯化钾、1 MgCl₂2 CaCl₂,10葡萄糖,5玫瑰,pH值7.4)。为所有酯形式的染料包括DCF-DA Rhod-2 / AM,细胞治疗一个额外的40分钟后染料在装货允许乳沟染料其酸酯形成的形式。

2.3。传统债券和多光子荧光成像显微镜

相衬和常规荧光照片都是获得使用蔡司倒置显微镜(Axiovert 200,卡尔蔡司,耶拿,德国)配有水银灯(HBO 103),一个很酷的CCD相机(亚利桑那州图森市CoolSNAP外汇,Roper科学,美国),和蔡司目标(计划NeoFluar 100 NA 1.3石油)。过滤器用于检测DCF没有。10 (Exi: BP 450 - 490海里;Emi: BP 515 - 565 nm)和Mito-R TMRM过滤器没有。15(现有:BP 546/12 nm;电磁干扰:LP 590海里)。收集细胞和线粒体的共焦图像Bio-Rad光辉2100用488海里氩激光照明(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。为了避免single-photon-induced自我分解的DCF / DA,多光子照明应用(如前所述22]。多光子荧光图像收集在一个徕卡SP2议员(Leica-Microsystems,曼海姆,德国)光纤耦合系统配备一个Ti: Sa-Laser系统(模型:几千年/海啸;Spectra-Physics)提供一个脉冲重复率在82 MHz,激光脉冲宽度为1.2秒,1海里的光谱带宽和对象脉冲宽度为1.3秒。平均波长800纳米的激光功率600 mW选择照明。在荧光成像技术,照明光线减少到最低水平,使用适当的中性密度滤光片,以防止由于photosensitizing影响光的相互作用与荧光探针包括漂白和自动氧化作用的荧光探针。所有图片进行了处理和分析使用MetaMorph软件(通用成像Corp .)、西切斯特,PA,美国)。强度水平分析了从原始图像和画使用Microsoft EXCEL软件和Photoshop。伪彩色显示的规模范围从0到255个单位被用来提高荧光变化的对比为每个图像。

2.4。ROS的生成和mCa的量化^{2 +}使用荧光分光荧光计

细胞培养在96 -标准黑色/明确的底板(他一一Bio-One国际AG)、Kremsmunster、奥地利)。ROS检测与DCF(激发和发射波长是490和520海里,职责)。mCa^{2 +}检测与Rhod-2(激发和发射波长是561和长传球575海里,职责)。DCF和mCa的荧光强度^{2 +}被量化Spectramax双子座EM荧光光谱仪(分子器件、桑尼维尔,美国)。结果分析了使用SoftMax Pro 4.7软件(分子设备)和Microsoft Excel软件。

2.5。测量细胞的生存能力

细胞生存能力使用比色检测3 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)试验如前所述23]。活动的线粒体还原酶将可溶性四唑盐转化为不溶性甲瓒沉淀是衡量一个ELISA读者(a - 5082;TECAN Grodig /奥地利萨尔斯堡)。调查RC-defective的保护作用(ρ⁰)星形胶质细胞过氧化氢(H₂O₂-)诱导细胞毒性,控制和ρ⁰星形胶质细胞与不同浓度的治疗H₂O₂不同时期的时间了。MTT试验后进行1小时的H₂O₂曝光。线粒体的活性还原酶是计算MTT染色转换的数量相对于变化中看到sham-treated控制细胞。数据表示为均值±SE至少有三个独立的实验。

2.6。测量细胞耗氧量

细胞(5×10⁵/ 100μL)胰蛋白酶化后立即转移到商会Mitocell配备了克拉克氧电极(782氧计;Strathkelvin仪器,英国格拉斯哥)测量细胞O₂如前所述(消费24]。的速度啊₂消费计算的斜坡和O用%表示₂每分钟消耗5×10⁵细胞。

2.7。统计分析

结果表示为均值±SEM,统计学意义是评估通过单向或多因子的方差分析(方差分析)。的值被认为是显著的。每个实验至少重复三次。

3所示。结果

3.1。慢啊₂消费率ρ⁰RBA1星形胶质细胞

RC活动了₂消费和ATP生产(25,26]。因此,我们进一步检查是否存在差异₂消费之间的控制和ρ⁰(RC-lacking) RBA1星形胶质细胞。结果表明,控制细胞消耗氧气的速度比ρ⁰星形胶质细胞(图1)。然而,阿₂消费在长期氧化应激有明显的妥协ρ⁰星形胶质细胞。这些发现表明RC活动水平相对较低,导致线粒体的压力较小ρ⁰星形胶质细胞,但长时间间隔保护作用将被废除。

3.2。双阶段的ρ⁰RBA1-Astrocytes-Mediated保护

氧化应激的程度取决于毒素浓度和暴露时间27,28]。确定最优浓度和接触时间,控制和ρ⁰RBA1星形胶质细胞与不同浓度的治疗H₂O₂(0、1、10、20、50毫米)在不同时间(30分钟)建立氧化应激模型。H后细胞生存能力₂O₂接触MTT试验测量的两组。H₂O₂(1-50毫米)显著减少细胞生存能力的细胞浓度的方式。两组之间没有显著差异的细胞生存能力在不同浓度为10分钟()(图2(一个))。如图2 (b)高浓度的H₂O₂(50毫米)在细胞生存能力造成重大损失。我们没有使用这个非常高剂量的H₂O₂因为它可能是高浓度会excitotoxic星形胶质细胞。此外,20毫米H₂O₂细胞生存能力的显著损失造成的ρ⁰在30分钟内星形胶质细胞相比,控制细胞。因此,最优H₂O₂20毫米的浓度决定进行进一步的实验。

3.3。在Oxidative-Stress-Induced RC-Defective星形胶质细胞增强线粒体损伤细胞凋亡

比较的能力抵抗长期控制和之间的氧化应激ρ⁰星形胶质细胞中,我们使用延时测量并记录详细的细胞以及线粒体形态的变化在整个凋亡细胞死亡过程引起的20毫米H₂O₂使用传统的相位对比和共聚焦荧光成像显微镜加上无创性mitochondria-targeted荧光探针,YO-PRO-1 Mito-R和荧光标记细胞凋亡。图3显示延时荧光图像显示线粒体动态变化形态(红色标记)和凋亡细胞核(标记为绿色)在H₂O₂压力控制(a, b)和ρ⁰RBA1星形胶质细胞(c, d)。在数字3(一个)和3 (c),每个图像系列的第一映像是控制。双重荧光图像延时Mito-R(形态)和YO-PRO-1(凋亡细胞核标签)同时被10分钟间隔为150分钟。进行分析,同时可视化线粒体形态标记Mito-R和凋亡细胞核贴上YO-PRO-1比较两组之间在6时间点:10、30、60、70、130和150分钟图4。凋亡事件包括线粒体肿胀,浆膜起泡,YO-PRO-1污点,和核凝结29日,30.]两组的总结表1。相比之下,后两组细胞形态20毫米H₂O₂压力显示阶段浓密灰色线粒体在胞质区变得更轻由于线粒体的肿胀。激光扫描共焦成像显微镜下,线粒体开始膨胀之前暴露于H₂O₂在ρ⁰星形胶质细胞比对照组(10分钟和20分钟,resp)。两组之间没有显著差异,质膜起泡。数据3 (b)和3 (d)显示放大400 x 70分钟的延时荧光图像数据3(一个)和3 (c),分别。相比之下,ρ⁰星形胶质细胞形成更为明显比对照组随着时间的推移质膜气泡。此外,时间成为YO-PRO-1-positive早些时候ρ⁰星形胶质细胞比对照组(120分钟和140分钟,resp)。此外,减少核大小比例之前和之后的H₂O₂治疗要高得多ρ⁰星形胶质细胞比对照组(分别为8.9%和7.2%,分别地)。这些结果强烈建议ρ⁰星形胶质细胞缺乏RC施加保护只有轻微的氧化应激而变得更容易受到严重的氧化应激的二次氧化的侮辱。

3.4。利用改变的mro和mROS-Dependent mCa^{2 +}在氧化应激程度上形成ρ⁰星形胶质细胞

接下来,我们调查是否抵抗氧化应激损害是由于线粒体的mro和mROS-dependent mCa的压力的影响^{2 +}压力ρ⁰星形胶质细胞。mro形成和mCa^{2 +}浓度被双重标签同时成像mro探针,DCF和Ca^{2 +}荧光探针,Rhod-2激光扫描共焦显微镜。连续的线粒体ROS和Ca的变化^{2 +}每6分钟后2小时H₂O₂暴露在两组同时分析数据5(一个)和5 (b),分别。这些结果表明,mro迅速增加(在10分钟)后细胞暴露在H₂O₂这是后来伴随着mCa的增加^{2 +}的水平。重要的是,mro形成和mROS-dependent mCa^{2 +}控制细胞浓度高于ρ⁰星形胶质细胞在早期阶段的50和100毫米H₂O₂曝光。然而,线粒体的mro和mROS-dependent mCa的压力^{2 +}压力明显更高ρ⁰星形胶质细胞比控制在长期10、50和100毫米H₂O₂曝光。

3.5。ρ⁰RBA1星形胶质细胞低DeltaPsi比控制细胞(m)

我们之前证明休息的mro水平细胞窝藏大规模删除mtDNA低于细胞保存mtDNA。此外,休息DeltaPsi (m)在前细胞超极化被发现低于后者中发现(29日]。此外,低DeltaPsi (m)可以产生更少的驱动力^{2 +}进入线粒体,从而降低mCa^{2 +}压力(31日]。调查是否ρ⁰星形胶质细胞较低的mro轻微氧化压力下形成低DeltaPsi (m),我们发现DeltaPsi (m)变化使用DeltaPsi (m)敏感的荧光探针,JC-1,通过激光扫描共焦显微镜和评估它们。JC-1测量两个高(报告为j-aggregated红色荧光)和低(报告为单体绿色荧光)DeltaPsi (m)。显示在图6,共焦JC-1成像证明DeltaPsi (m)在控制细胞是异构(数据6(一)- - - - - -6 (c))。高(红色荧光(图)6 (b)(绿色荧光)(图)和低6(一))DeltaPsi (m)被发现。相比之下,ρ⁰星形胶质细胞表明JC-1表达减少红得多(图6 (e))和绿色(图6 (d))荧光。合并图像表示的减少高低DeltaPsi (m)ρ⁰星形胶质细胞(图6 (c)(图)相比,控制细胞6 (f))。综上所述,这些数据提供了插图的保护作用ρ⁰星形胶质细胞通过更少的mro生成,降低DeltaPsi (m),因此mCa低^{2 +}压力。相比之下,ρ⁰星形胶质细胞呈现他们的保护由于增强的mro和mROS-mediated mCa^{2 +}压力下长期线粒体氧化应激。

4所示。讨论

在这项研究中,我们演示了RC的两相的影响defect-augmented mROS-mediated mCa^{2 +}压力在H₂O₂全身的氧化损伤ρ⁰RBA1星形胶质细胞。我们在正常和氧化应激的影响相比RC-defective星形胶质细胞在短期和长期暴露在H₂O₂。我们的研究结果表明,(1)ρ⁰星形胶质细胞对慢啊₂消费比控制细胞,但O₂长期的氧化应激期间消费明显受损;(2)细胞生存能力不是不同群体之间在短期H₂O₂接触;(3)细胞存活率下降ρ⁰星形胶质细胞孵育20毫米H₂O₂在长期的氧化应激;(4)ρ⁰星形胶质细胞线粒体肿胀,形成等离子体膜气泡,早些时候积极YO-PRO-1核染色比控制在H₂O₂治疗;(5)高的mro形成,mROS-dependent mCa^{2 +}水平,DeltaPsi (m)被发现在早期控制细胞氧化应激但亦然在长期氧化的侮辱。这些发现强调双阶段的病理课程RC-defective细胞,这一直是一个重要的研究领域的兴趣和已成为一个潜在的治疗目标治疗神经系统疾病。

同时使用延时双重荧光成像显微镜测量RC defect-enhanced的mro和mCa的生成^{2 +},更改可视化使用贴现和Rhod-2,分别。在当前的研究中,我们发现mro代mCa之前^{2 +}增加控制和ρ⁰星形胶质细胞H后₂O₂治疗。这些发现符合我们之前研究H₂O₂(32和photoirradiation-augmented氧化应激33- - - - - -35]。此外,我们的研究提供了定量成像证据表明抗氧化作用存在于双重效应ρ⁰星形胶质细胞在不同程度的氧化应激。总之,钢筋混凝土缺陷能保护细胞由于更少的mro,少DeltaPsi (m),因此mROS-mediated mCa少^{2 +}压力在短期内氧化的侮辱。然而,这种保护作用了ρ⁰细胞并没有持续很长时间将RC活动表示从O大大受损₂消费,大大增强mROS-enhanced线粒体压力,mROS-dependent mCa^{2 +}在长期的氧化应激压力。

的矛盾性质的mro被描述为一把双刃剑:在基础水平,但也可能损害他们保护过度的水平(36]。同样,mCa温和增长^{2 +}生理相关,但Ca吗^{2 +}过载是有害的线粒体功能。Ca之间的串扰^{2 +}和ROS信号系统维持生理体内平衡是至关重要的。小的mro可以减少mCa形成^{2 +}水平施加保护预处理[37]。相比之下,形成严重的mro能增强大脑中动脉²增加。mCa的综合效应^{2 +}和mro可能促进的MPT孔隙(38]。的MPT毛孔导致DeltaPsi (m)去极化,导致线粒体肿胀。线粒体外膜破裂,线粒体肿胀导致细胞色素c的释放,导致电子传递的抑制和增强更多的活性氧产量(15]。因此,氧化应激导致这样的前馈回路可能是毁灭性的创建细胞损伤远远超出直接Ca^{2 +}全身的伤害。

是否存在争议ρ⁰细胞抗氧化应激。这些RC-defective细胞的影响是不同的,有害的和保护细胞生存已经描述。Cells-harboring mtDNA突变已被证明诱导保护性bcl - 2的表达和Bfl-1 prosurvival蛋白(39]。据报道,DeltaPsi (m)ρ⁰细胞可能明显低于野生型细胞(40]。相比之下,我们先前表明,常见的删除——(CD)诱导RC缺陷导致显著升高的mro和去极化的DeltaPsi (m),可以有效地导致一个增强的凋亡信号(29日]。mro的双重效果,保护还是有害取决于生产的数量。同样,是否ρ⁰细胞施加保护或破坏细胞的生存取决于氧化应激的程度和顺向的mro生产。未来的研究是必要的检查这个假定的机制ρ⁰细胞。

总之,我们证明了双阶段的RC defect-augmented mROS-mediated mCa^{2 +}在氧化压力侮辱的细胞培养模型ρ⁰星形胶质细胞。钢筋混凝土缺陷由于更少的mro和mROS-dependent mCa保护细胞^{2 +}压力轻微氧化的侮辱。RC-defect-mediated保护是由于显著增强的mro和mROS-dependent mCa妥协^{2 +}在长期的氧化应激压力。关键的一点,ρ⁰星形胶质细胞DeltaPsi较低(m)比正常RBA1强调调制的双阶段细胞存活率和细胞死亡。

确认

作者感谢Ching-Hung陈女士,协助实验。不存在竞争的经济利益。这项工作得到了资助CMRPD 180491 - 3和170411 - 3 CMRPD周素卿()和CMRPG 270341 - 2(彭)从长庚医疗研究基金会、台湾,和国家安全委员会101 - 2320 - b - 182 - 031 - my3周素卿()和国家安全委员会99 - 2314 b - 182 a - 063 my3(彭)从美国国家科学委员会,台湾。