文摘

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,其特征是被一个不平衡的氧化还原状态,增加了细胞凋亡。热带传染病,尤其是疟疾,可能对系统性红斑狼疮提供保护。氧化应激是系统性红斑狼疮的一个特点。我们有测量一氧化氮(NO)水平的变化,过氧化氢(H₂O₂)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的降低肾和肝组织的女性BWF1狼疮小鼠,系统性红斑狼疮的实验模型,在感染后生活或gamma-irradiated疟疾。我们观察到没有下降,H₂O₂,在感染后肾组织MDA水平狼疮小鼠活疟疾。同样,没有和H的水平₂O₂降低在狼疮小鼠的肝脏组织感染疟疾。相反,谷胱甘肽水平明显增加肾脏和肝脏组织的狼疮小鼠感染后生活或gamma-irradiated疟疾。肝脏和肾脏功能显著改变狼疮小鼠感染后生活疟疾。我们进一步研究了超微结构的变化,检测到凋亡细胞的数量在肾脏和肝脏组织中由电子显微镜和TUNEL原位检测。我们的数据显示,狼疮小鼠感染疟疾带来防止狼疮肾炎。

1。介绍

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多因子的自身免疫性疾病,特点是自身抗体的出现,特别是针对核部件(1]。因为它的多因子的病因,包括遗传、荷尔蒙、和环境触发器,这种疾病的分子机制在很大程度上仍未知。Free-radical-mediated反应最近引起了极大关注的潜在机制的系统性红斑狼疮的发病机制(2]。过度生成活性氧(ROS)有可能启动损伤脂质,蛋白质和DNA (3]。ROS代表的一部分对微生物体内的防御机制。此外,增加活性氧生成报道促进炎症、坏死和凋亡在慢性肾脏疾病(4]。此外,先前的研究已经报道氧化应激之间的关联和自身免疫autoimmune-prone推广+ / +小鼠模型(5]。事实上,在系统性红斑狼疮细胞凋亡起着重要的作用,和更高的细胞凋亡率导致自身抗体的产生,随后引发疾病活动(6]。凋亡细胞的比例在系统性红斑狼疮患者外周血显著高于正常健康的病人,和人类狼疮肾炎的发展成正比的增加细胞凋亡率(7]。提供细胞凋亡被认为是导致系统性红斑狼疮的发展(8]。延迟引起的凋亡细胞的清除活性氧的生产可能会延长细胞之间的相互作用,生成neoepitopes随后导致广谱自身抗体形成,导致组织损伤在系统性红斑狼疮9]。

系统性红斑狼疮患者的各种细胞因子水平升高,因此被认为是疾病的发病机理的基本要素。il - 10是一个重要的免疫调节细胞因子抑制t细胞功能,抑制促炎细胞因子的表达(10]。此外,连续anti-IL-10抗体在狼疮小鼠模型管理延迟自身免疫的发生,提高了生存率从10 - 80%11]。肿瘤坏死因子-α是一种细胞因子,是很出名的,在炎症和细胞凋亡的规定,两个进程参与系统性红斑狼疮的发病机制。肿瘤坏死因子-α系统性红斑狼疮和与疾病活动的增加(12),它提出了有助于SLE的免疫发病机理(13]。相反,先前的调查结果显示,减少生产的TNF -αBWF1老鼠与严重疾病症状的发展,如肾炎(14]。

热带传染病,尤其是疟疾,可能对系统性红斑狼疮(提供保护15]。此外,流行病学研究表明,系统性红斑狼疮很少观察到在非洲和亚洲的热带地区农村,在感染疟疾流行的(16,17]。因此,它被假定SLE-susceptibility基因是有益的在控制重症疟疾但促进炎症没有疟疾(18,19]。在这方面,格林伍德等人描述了一个更高的存活率年轻lupus-prone老鼠感染鼠yoelii(20.]。另一项研究显示,旧BWF1老鼠,当感染p . chabaudi红斑,随后出现临床症状的治疗氯喹、发达的暂时缓解症状。此外,注射免疫球蛋白分离p . chabaudi来华的BALB / c小鼠产生类似的保护作用与感染本身在BWF1老鼠21]。很少有研究调查系统性红斑狼疮疟疾感染的效果。因此,本研究旨在探讨疟疾感染的可能作用在氧化应激、细胞凋亡、细胞因子水平引起的系统性红斑狼疮小鼠狼疮模型。

2。材料和方法

2.1。动物

共有30名女BWF1 29-week-old老鼠从杰克逊实验室(美国巴尔港)购买和维护,监控,在一个特定的无菌环境。所有动物程序依法进行标准制定的指导方针的实验动物保健和使用委员会控制和监督的目的动物实验(CPCSEA)。这项协议是在沙特国王大学动物伦理委员会批准。所有的动物都被允许适应塑料笼子(5每笼动物)在通风良好的房间前1周的实验。动物们保持在标准实验室条件下(温度23°C, 60 - 70%的相对湿度,和一个12小时的光/暗周期),美联储的标准商业丸,鉴于水随意。

2.2。疟疾感染

血液舞台形式的疟原虫chabaudi寄生虫是存储在液态氮在三月大的BALB / c小鼠体内通过后根据先前描述的协议(22]。女性BWF1老鼠(30周)被腹腔注射感染10⁶寄生红细胞从受感染的老鼠获得相同的应变如前所述[21]。寄生虫血症是由Giemsa-stained监控薄血涂片。实验动物被分配到3组(10只老鼠/组)如下:组(I)红斑狼疮组(狼疮未感染);组(2)生活感染疟疾的组(狼疮+生活疟疾感染);和组(3)辐照感染疟疾的集团(狼疮+辐照疟疾感染)。第三组被感染与10个ip⁶γ辐照红细胞(iRBCs)感染p . chabaudi。注入之前,血液细胞暴露在200 Gy伽马辐射剂量的射线细胞200辐照器(加拿大原子能,渥太华,加拿大)使用⁶⁰有限公司源位于大学的科学研究中心,沙特国王大学,沙特阿拉伯。这种辐射剂量是根据实验应用Ferreira-da-Cruz et al。23)提供的证据表明,200 gy辐照剂量可以废除的原始复制帕洛阿尔托的红血球的形式恶性疟原虫应变,最有可能通过灭活传染性。根据他们的数据,100年或150年Gy辐照剂量不能灭活寄生虫,尽管减少寄生虫血症。所有的动物都牺牲在感染后14天。

2.3。样品收集

收集的血液从心脏肝素化管血液参数的确定和获得等离子体生化研究。等离子体是储存在−80°C到使用。肝脏和肾脏被移除和无菌生理盐水的切成小块。件固定在戊二醛对透射电子显微镜或4%多聚甲醛TUNEL检测或悬浮在生化研究三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

2.4。电子显微镜

小块的肝脏和肾脏组织固定在2.5%戊二醛24 h。小块是用磷酸缓冲(0.1米,pH值7.4)。Postfixation执行1%锇酸缓冲pH值7.4和0.1 M磷酸盐缓冲剂在4°C 1 - 2 h,然后再洗在磷酸缓冲去除多余的固定剂。样品在提升等级的乙醇脱水清算在氧化丙烯紧随其后。标本被嵌入在环氧树脂。聚合是通过孵化胶囊60°C。超薄部分(100海里)与超微切片机,准备裸铜网格。后双染色法与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,部分检查和拍照使用JEOL 100 Cx透射电子显微镜(日本)。

2.5。TUNEL分析

肝脏和肾脏组织在4%多聚甲醛固定4 h在4°C,水洗的磷酸盐(PBS)和嵌入在石蜡块。部分7μ米被削减和脱水染色前20分钟。终端dUTP缺口末端标记(TUNEL)使用商业TUNEL细胞凋亡检测装备FITC-labeled POD(美国创脚本)是根据制造商的指示执行。凋亡细胞形态识别的标准(细胞收缩和染色质凝结和着边)。凋亡细胞核染色深棕色,检查,在光学显微镜下计算。

2.6。细胞全血细胞计数(CBC)

全血样品进行了分析与自动兽医abc动物血液计数器(Horiba ABX,法国蒙彼利埃)使用仪器的血液学包指定(Horiba ABX、法国)根据制造商的指示。

2.7。肾脏和肝脏功能测试

血浆样本进行了分析使用商业套装(bioMerieux、玛西我'Etoile、法国),丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸酐(创造)根据制造商的指示。吸光度测量Ultrospec 2000 U / V分光光度计(Amersham淀粉微球的生物技术,英国剑桥大学)。

2.8。在肝和肾组织氧化应激评估

在肝脏和肾脏氧化应激标志物测定匀浆而部分肝脏和肾脏重和均质立即给50% (w / v)在冰冷的匀浆介质含有Tris-HCl 50毫米和300毫米的蔗糖(24]。匀浆离心机在500 g 10分钟4°C。上层清液(10%)被用于确定不,H₂O₂使用商业套装、MDA、谷胱甘肽(Biodiagnostic, Dokki,吉萨金字塔,埃及)。

亚硝酸盐/硝酸盐化验根据Berkels技术等。25]。总之,在酸性介质中,形成亚硝酸亚硝酸盐的存在,形成酸使重氮化对氨基苯磺酰胺,这是加上N -乙二胺(1-naphthyl),以及由此产生的偶氮染料在540纳米测量。

脂质过氧化是由Ohkawa等的方法。26]。匀浆悬浮在1毫升10%三氯乙酸和1毫升0.67%的硫代巴比土酸煮30分钟的水浴。硫代巴比土酸活性物质以535海里,表示为丙二醛(MDA)等价物。

过氧化氢(H₂O₂)根据Aebi化验27]。在辣根过氧化物酶(合),H₂O₂在组织匀浆与3,反应5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic (DHBS)酸和4-aminophenazone (AAP)形成一个发色团,可以量化为240 nm。

谷胱甘肽(GSH)是衡量Ellman试剂(28]。这种试剂是减少生产黄色色原,这是成正比的谷胱甘肽浓度测量在405海里。

2.9。测量肿瘤坏死因子-α和il - 10

血浆TNF水平α测量和il - 10在重复使用纯化生物素化的抗体ELISA集根据供应商提供的协议(Abcam,剑桥,英国)。ELISA板和一个微型板块读者阅读(Multiskan提升ThermoH)。

2.10。统计分析

数据测试正常使用Anderson-Darling测试和同质性差异前进一步的统计分析。数据是正态分布和表达为平均值±标准平均误差(SEM)。团体之间的显著差异分析的一个——或者双向方差分析其次是Bonferroni测试多个比较使用棱镜统计软件(GraphPad软件)。也重新分析的数据,或双向方差分析其次是图基的期末测验使用SPSS软件,版本17。被认为具有统计显著性差异。

3所示。结果

3.1。住疟疾感染降低系统性红斑狼疮引起的氧化应激标志物在肾和肝组织

疟疾感染的影响在系统性红斑狼疮的氧化应激标记实验模型测量通过确定的水平不,H₂O₂,肾脏和肝脏MDA的三个实验样本组女性BWF1老鼠,而谷胱甘肽是唯一在这些组织抗氧化参数测量。我们观察到的水平没有显著下降,H₂O₂和MDA(数字1(一),1 (b),1 (c))在肾和肝组织生活疟疾感染与狼疮小鼠相比),而谷胱甘肽浓度增加后生活或gamma-irradiated疟疾感染(图1 (d))。然而,gamma-irradiated疟疾感染导致减少水平的不,H₂O₂,并与狼疮小鼠相比,肾组织MDA ()。相比之下,在肝组织,gamma-irradiated疟疾感染有不同的结果,不,水平较高的H₂O₂、MDA、谷胱甘肽比观察到狼疮小鼠。

3.2。改变BWF1疟疾感染小鼠后血细胞数量

BWF1小鼠感染疟疾(生活或gamma-irradiated)对血细胞数量有明显影响。红细胞计数显著降低感染过疟疾后()与狼疮小鼠相比(表1)。然而,总白细胞计数在生活和高度增加gamma-irradiated疟疾感染组,与更大的生活增加感染组(比gamma-irradiated集团())。有一个明显的肝脏感染相关性影响权重。我们观察到在肝脏重量显著增加生活感染疟疾的集团(),而肝脏重量gamma-irradiated感染疟疾的组没有明显变化。肾脏重量略减少生活感染疟疾的组。脾脏重量不太明显受到感染的影响生活或gamma-irradiated疟疾比肝重量(数据未显示)。

3.3。疟疾感染没有改善效果在BWF1小鼠肾脏或肝脏功能

评估肾功能BWF1老鼠,估计狼疮小鼠的血浆肌酐水平样本,受损;然而,生活疟疾感染没有影响这个障碍(图2(一个))。相比之下,肝功能,以ALT(图2 (b))和AST(图2 (c))在等离子体浓度的三组样品,严重受损的生活感染疟疾的组与狼疮或gamma-irradiated感染疟疾的组。

3.4。住疟疾感染减轻肾Cytopathological狼疮的迹象

在电子显微镜下观察,狼疮小鼠肾组织部分显示大量的间质,皮下,牙龈存款;扩散抹杀脚的过程;系膜和endocapillary扩散;和几个毛细血管腔(图的闭塞3(一个))。生活感染疟疾的组的肾脏部分显示正常脚过程宽度和密度几乎完全没有存款(图3 (b))。gamma-irradiated感染疟疾的组中,有皮下和牙龈存款与扩散抹杀脚过程(图3 (c))。

在肝组织肝细胞的凋亡特征特性,如染色质缩合、空泡形成、核仁肥大细胞膜出泡,观察肝细胞的感染疟疾的团体(生活或γ辐照)(数据3 (e)和3 (f)),但并没有出现在未感染肝脏红斑狼疮(图3 (d))。

3.5。肾和肝组织的凋亡变化前后狼疮小鼠感染疟疾

肾脏和肝脏部分使用TUNEL染色细胞凋亡检测试剂盒来证实肾和肝组织的凋亡变化。我们从现场观察到肾部分感染疟疾的组表现出更少的凋亡细胞(图4 (b))与狼疮组或gamma-irradiated感染疟疾的集团(数字4(一)和4 (c))。相比之下,从狼疮小鼠肝脏部分显示最少的凋亡细胞(图4 (d)),有一个显著增加肝脏凋亡细胞来自疟疾组织(生活或γ辐照)(数据4 (e)和4 (f))。TUNEL结果评估表2。

3.6。影响血浆TNF水平——疟疾感染α和il - 10

我们比较血浆TNF -α和il - 10浓度在疟疾感染组与狼疮组。积累的数据从10个人从每组小鼠,如图5(一个)和5 (b)表示,显著增加()血浆TNF水平α和il - 10在感染疟疾的组与狼疮未感染组,而在gamma-irradiated疟疾感染的细胞因子的水平组类似的红斑狼疮组,说明一个可行的寄生虫对观察malaria-ameliorating效果至关重要。

4所示。讨论

系统性红斑狼疮是一种慢性炎症性自身免疫性疾病的多种起源。有积累的证据表明,在自身免疫性疾病中观察到西方国家的增加部分下降引起的传染性疾病(29日]。例如,它已被观察到,轮状病毒感染在婴儿和年轻的成年糖尿病小鼠nonobese延迟糖尿病的发病和降低其发病率(30.]。在这里,我们调查的影响女性BWF1的注射小鼠生活或gamma-irradiated疟疾在系统性红斑狼疮引起的氧化应激和细胞凋亡。我们的研究结果清楚地表明一个改善生活的影响疟疾通过恢复肾组织谷胱甘肽水平和减少的水平不,H₂O₂,MDA,但这种效应还不清楚gamma-irradiated疟疾组。最近的一项研究表明刚地弓形虫感染可能防止lupus-like综合症的发展自身免疫性BWF1老鼠(31日]。疾病的严重程度呈正相关,增加细胞内ROS水平生产和系统性红斑狼疮小鼠脂质过氧化作用,依照Tewthanom等的报道。32)和Turi et al。33),这表明,增加氧化应激与活跃在系统性红斑狼疮患者肾小球疾病。足够的谷胱甘肽浓度所需的各种功能,包括保护细胞免受氧化损伤的淬火氧化剂种类、淋巴细胞激活,激活自然杀伤细胞,lymphocyte-mediated细胞毒性(34]。减少细胞内谷胱甘肽水平可能是由于ROS-induced谷胱甘肽氧化或从细胞谷胱甘肽的出口。合成谷胱甘肽还原将进一步增强活性氧的生产在氧化挑战[35]。破坏抗氧化防御系统已经涉及到发展和加速狼疮肾炎。在目前的研究中,减少狼疮小鼠的细胞内谷胱甘肽水平与疾病严重程度负相关,证实了TEM。然而,疟疾感染增加谷胱甘肽的水平在肾和肝组织。肾脏功能没有明显改善疟疾感染后,同意格林伍德的研究等。20.),报告轻微下降,肾功能postmalaria感染。14天似乎没有足够的时间来恢复在狼疮小鼠肾脏功能受损,相反,慢性感染疟疾是必要的。疟疾的凋亡效应在TUNEL显微照片的数量减少肾细胞凋亡细胞核的生活感染疟疾的组。事实上,肾脏氧化应激是系统性红斑狼疮和疟疾感染的特征。然而,似乎氧化应激导致狼疮肾组织损伤参数指向抗寄生物的防御在疟疾感染。在健康小鼠(nonlupus)伊莱亚斯等人报道,氧化应激的产品以及对寄生虫的免疫反应是至关重要的变化在肾脏架构(malaria-associated-acute肾脏损伤)和微血管内皮渗透性的BALB / c小鼠感染p .鼠安卡(36]。然而,在肝组织,疟疾感染显著诱导肝细胞凋亡。在疟疾感染肝细胞的凋亡与肝功能异常,肝脏的功能测试。Kochar et al。(2003)报告疟疾感染的肝脏功能障碍和组织病理学变化如肝细胞坏死、胆汁淤积、肉芽肿病变,和疟疾结节(37]。的肝肿大观察感染疟疾的集团是生活在和谐与其他报告(38]。我们的结果同意国王的结果等。4)报道,增加T淋巴细胞的凋亡可能是由子集减少细胞内谷胱甘肽浓度和疾病的严重程度可能会增强生产过剩的活性氧在系统性红斑狼疮。红血球减少,白细胞的增加是一个著名的疟疾感染的临床表现。我们的结果对于gamma-irradiated疟疾是有趣,因为本研究中使用的高剂量的辐射足以杀死寄生虫,导致一个象狼疮肾而未感染组,在肝脏,gamma-irradiated感染疟疾的组比狼疮或更惨的生活感染疟疾的组。这两个器官的不同结果需要进一步调查。细胞因子的不平衡中起着重要作用的加速度lupus-like自身免疫性疾病。在这项研究中,我们观察到生活增加血浆TNF水平——疟疾感染α和细胞因子il - 10。这些细胞因子的操作可能代表一个潜在的治疗系统性红斑狼疮的治疗策略(39]。以前的研究已经表明TNF -α不足是一个重要的触发和司机NZB / W lupus-like自身免疫的小鼠(40]。此外,据报道,il - 10的表达lupus-prone NZM2410老鼠能改善狼疮疾病(41]。

综上所述,我们的数据显示一个改善效果在女性BWF1小鼠的肾组织的结构和功能水平后生活疟疾感染。

5。结论

我们的数据表明,疟疾感染减轻红斑狼疮肾炎减少肾脏氧化应激和抗氧化防御系统。

利益冲突

所有作者已阅读及同意纸和批准其提交的内容。作者声明没有利益冲突和国家提交的论文尚未发表或在其他地方,工作符合《华尔街日报》的伦理政策和工作进行了相关的伦理审查后国际公认的道德标准。

承认

作者扩展他们的感谢院长以来在沙特国王大学科研资助这项工作通过研究小组。以序列- vpp - 002。