早期再灌注中短暂性酸中毒通过PI3k-Akt-eNOS信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤

摘要

本文认为，短暂性酸中毒再灌注通过激活PI3K-Akt-eNOS通路对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤具有心肌保护作用。

1.介绍

在心肌缺血期间，组织pH值显着下降并在再灌注后恢复正常[1］．最近，研究报告说，酸中毒（pH <或= 7.0）在缺血期间对细胞死亡进行深受保护。然而，再灌注后，从酸性到正常pH的快速返回可能导致肌细胞失去活力。这种后损伤的恶化是通过细胞内pH（phi）的突然或快速变化介导的“pH悖论”[2］．再灌注后pH的正常化引发反应性氧物质（ROS）形成并开始线粒体渗透性过渡孔（MPTP），其最终导致心肌细胞中的细胞死亡，而酸中毒可以防止线粒体渗透性过渡孔（MPTP）开口[3.］．因此，在早期再灌注过程中延长短暂性酸中毒可预防心肌缺血再灌注损伤。

缺血后适应是一种新的心肌保护策略，包括在再灌注开始时应用短周期的缺血-再灌注，是一种很有前途的心肌保护方法[4.那5.］．并且这种保护与磷脂酰肌醇3-激酶-AKT依赖性细胞选择信号传导途径的激活有关，其是再灌注损伤的一部分，其在再灌注时激活时赋予心脏保护剂的反应损伤激酶（风险）[6.那7.］．此外，Cohen等人报道，缺血后适应通过在再灌注前3分钟维持酸中毒，抑制复氧心肌产生活性氧，防止MPTP的形成[8.］．因此，我们假设在再灌注（酸中毒后处理）开始时直接酸性输注可以模仿缺血性后处理，并诱导pH的延迟回收并保护心肌免受缺血再灌注损伤，并且该保护作用可能由PI3K-enos信号传导途径介导。

2.方法

实验程序符合中华人民共和国国家卫生研究所出版并经国家动物伦理委员会批准的《实验动物护理和使用指南》。

2.1。孤立的灌注大鼠心脏制剂

雄性Sprague-Dawley大鼠（450-550g）蜂精，然后用尿道（700 mg / kg）麻醉。迅速切除心脏并安装在Langendorff设备上并灌注含有（以mm）115.0 NaCl，5.0kcl，1.2 mgso的改性克雷斯 - Henselit碳酸氢盐缓冲液（KHB）。_4.，1.2 kH.₂宝_4.，1.25 cacl.₂，25.0 Nahco._3.和11.0葡萄糖，用95％o平衡₂和5％的co₂为了产生灌注丁酸pH 7.4，并如前所述在37°C下保持[8.］．最初调节流速以产生60mmHg的灌注压力，然后保持恒定。然后将水填充的胶乳球囊插入左心室（LV）并充气，得到6至8mmHg之间的端舒张压（LVEDP）。连接到灌注管线的压力传感器用于连续记录灌注压力。

2.2。实验方案

大鼠随机分为7组(每组)。对照组心脏稳定30 min后，冠状动脉球囊充气30 min，全心无血流缺血，再灌注120 min (C组)。缺血后6个周期15 s再灌注和15 s闭塞(IPO组)。在酸中毒再灌注组，心脏灌注KHB调节pH为6.9，再灌注前3分钟(H⁺团体）。通过用80％o平衡来调节酸性灌注缓冲液₂/ 20％CO₂(pH值6.9)。用100%氧平衡的碱缓冲液对心脏进行后处理，观察碱是否能消除缺血后适应的保护作用₂（pH 7.8）（IPO +哦^-）.哦^-小组，心脏只用碱性缓冲液再灌浆，没有缺血后处理。最后，将PI3K特异性抑制剂枯草林（100nmol / L）加入到酸性灌注中并注入心脏中的前3分钟后的心脏（H.⁺+ WORT组）。在麦芽汁组中，用正常的KHB COTREATEMMENTES（100 nmol / L）再灌注心脏。在用相应的处理中再灌注的前3分钟后，将所有基团切换到与5％CO的缓冲液平衡₂。在所有的心中，再灌注持续了120分钟。

2.3。梗塞尺寸测量

再灌注120分钟后，冠状动脉重新入围。将心脏称重并在-20℃下冷冻20分钟，然后在厚度为1-2mm的厚度切割水平长轴。将切片在37℃下在37℃下孵育15分钟，缓冲的1％三苯基四唑氯化钡，以染色非截味的心肌砖红色。然后将切片固定在10％福尔马林中5分钟。梗死大小被定义为如前所述的坏死区重量与缺血区的比率[9.］．

2.4。孤立心中一氧化氮释放的定量

在先前描述的灌注液中没有测量释放[10.]，其消光系数在环境温度下为411 nm至401 nm。分别使用双光束光谱仪(DW2000, SLM-Aminco, USA)进行测量。

2.5。Akt和Enos的Western Blot测定

将冷冻心脏组织使用裂解缓冲液（20mmol / L Tris-HCl，pH 7.5,50mmol / L 2-巯基乙醇，5mmol / L EGTA，2mmol / L EDTA，1％NP40，0.1％十二烷基硫酸钠（SDS），0.5％脱氧胆酸，10mmol / L NAF，1mmol / L PMSF，25mg / ml Leupeptin和2mg / ml抑肽蛋白），然后在4°C下以12000g以12000g离心20分钟，然后在12000g下离心20分钟。使用Bradford测定（Bio-rad，USA）测定蛋白质浓度。将含有等量的样品在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后将蛋白质转移到PVDF膜上在4℃下过夜。在Tris缓冲盐水（TBS）中封闭膜在1小时的Tris缓冲盐水（TBS）中封闭，并在1：1000稀释时与抗AKT或抗enos抗体和GAPDH（电池信号传导技术，MA）孵育过夜在4°C。用磷酸盐缓冲盐水吐温（PBST）三次洗涤30分钟后，然后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）孵育，缀合的抗兔IgG为1：2000稀释1小时。用酶化学发光开发蛋白质条带，通过具有分析软件的密度计测量图像。

2.6。测量免费的15-F2T-异前烷烃

通过使用酶联免疫测定试剂盒（Cayman Chemical，Ann Arbor，Mi），通过使用如上所述的[11.］．根据制造商提供的协议，使用亲和吸附剂和亲和柱（Cayman Chemical，Ann Arbor，Mi）纯化灌注液和均质的心脏组织（在PBS中）进行纯化，然后加工用于分析。血浆或心脏无动15-F2T-ISOP的值分别以心脏匀浆的灌注液或PG / MG蛋白表达为PG / mL。

2.7。统计分析

数据以均数±均数的标准误差(S.E.M.)表示。数据采用组内及组间方差分析。各组均数的多重比较采用Tukey检验。使用统计软件包(GraphPad Prism, San Diego, CA, USA)进行分析。显著性差异定义为。

结果

3．1．心脏功能

如表所示1，缺血前的基线数据都不是所有群体之间的统计学意义。在对照心中进行30分钟的缺血和30分钟再灌注，LVEDP较高，+ DP /和−dp /与缺血前的基线数据相比较低。IPO治疗显着降低了LVEDP和增加+ DP /和−dp /与I / R组相比再灌注（30分钟）（，与I / R）。当用碱性灌注液进行后处理时，它不再是保护剂。酸性再灌注（h⁺组）还改善了心功能，类似于后处理的效果。但是，PI3K抑制剂麦芽汁还原该保护（） （桌子1)，虽然与对照组相比，正常KHB灌注下单独使用wortmannin对心功能没有明显改变(）.

3．2.梗塞大小

后处理减少了梗塞大小控制心脏风险区％（） （数字1）.然而，通过后处理的碱化灌注液消除了这种保护（） （数字1）.然而，与对照组相比，单独仅增加梗塞大小的碱性缓冲再灌注（） （数字1）.酸性的灌流液(H⁺组）模仿后处理的保护，由PI3K抑制剂Wortmannin（） （数字1）此外，与对照心相比，单独的Wortmannin单独患有正常的KHB灌注液（）.

3．3.一氧化氮释放

与对照组相比，后后处理在再灌注时间点（30分钟）时显着增加了一氧化氮释放（） （数字2），通过后处理的碱化灌注液来恢复。酸性灌注缓冲液也增加了一氧化氮水平，其被PI3K抑制剂烃毒素的分配物阻断。虽然与对照组相比，Wort组中的一氧化氮水平甚至更低（），这表明本研究中使用的烃烃的剂量足以抑制PI3K活化。

3．4．Akt和eNOS的蛋白表达

如图所示3.和4.，与对照相比，后处理诱导AKT和烯烯蛋白表达的磷酸化。然而，用碱性灌注酸盐的分配酸地取消了这些效果。酸性灌注缓冲液复制了后处理的效果，证明了Akt和enos蛋白表达的磷酸化增加。然而，通过PI3K抑制剂蒿肽的COTEATEMENTER来恢复这种效果。单独输注Wortmannin也抑制Akt和Enos表达的磷酸化。

3.5。灌注水平和无组织自由15-F2T-异前烷

与对照组相比，IPO集团的灌注液和心脏组织中，自由15-F2T-ISOP的水平显着降低（或者与c，表格2）.与碱性灌注液的后处理增加灌注液和心脏组织15-F2T-ISOP，与对照中相当的水平相比（，IPO +哦^-与宝;，IPO +哦^-与控制，表2）.酸性灌注缓冲液减少了自由的灌注液和心脏组织15-F2T-异前烷，由Wortmannin恢复。单独的Wortmannin没有影响灌注液和梭裔的水平15-F2T-异前烷与对照组相比。

4。讨论

该研究在分离的大鼠心脏中证明，通过延迟PHI回收，缺血后处理施加心脏保护，因为这种效果被碱性灌注液消除了。酸性灌注模仿后处理的心脏保护作用，限制心肌梗塞大小，改善心肌功能，并通过再灌注过程中的细胞内酸中毒抑制ROS产生。此外，酸性灌注增加了Akt磷酸化，eNOS表达和一氧化氮释放，其通过与Pi3K抑制剂Wortmannin进行加氢物恢复。这些结果表明，在早期再灌注相期间通过激活PI3K-AKT-eNOS信号传导途径来施加酸性灌注。

不同传输系统的组合行动，包括NA⁺/H⁺换热器,Na⁺/Symport和H⁺- 尿布乳酸乳酸，在再灌注过程中发挥疫苗的回收作用。冲洗乳酸，h⁺、有限公司₂结果phi的正常化[12.］．因此，减少抗粘土式冲洗液可以衰减跨膜H.⁺梯度并降低Na的活性⁺/H⁺-exchanger和na⁺/同向转移。细胞内低pHi抑制Ca²⁺- 初始再灌注期间MPTP的依赖性超分子和打开，保护心脏免受缺血再灌注损伤的影响。Javier等。[13.发现酸性再灌注可以延长细胞内酸中毒，但它仅持续到再灌注的前3分钟。超过这一时期心脏尽管细胞外酸中毒，但仍然迅速恢复了PHI。在我们的研究中，我们在再灌注的前3分钟内与酸性缓冲液进行灌注，我们的结果也发现3分钟的酸性灌注模仿缺血后处理的保护作用。然而，潜在的机制并不顺利。

各种研究已经证明，通过通过PI3K / AKT途径的磷酸化激活再灌注时，后处理程序通过激活风险途径来保护心脏免受再灌注损伤。在目前的研究中，我们已经表明，后后处理增加了PI3K / AKT的激活，并且有限的心肌梗死尺寸，同时排入碱性灌注液通过后处理诱导的AKT磷酸化并钝化后处理的心脏保护，这与Fujita等人一致。’s report [14.］．我们的数据进一步表明，酸性灌注模仿缺血后后处理的保护作用，证明了梗塞尺寸减少和改善的心功能，伴随着AKT的激活。然而，PI3K抑制剂Wortmannin还原了酸性灌注液的保护并降低了Akt的磷酸化。这些结果表明，酸中毒再灌注至少部分地通过PI3K-AKT途径的激活保护了从I / R损伤的心肌保护。

此外，通过缺血后处理诱导的PI3k / akt的激活进一步激活下游靶，例如内皮一氧化氮合酶（Enos），其将诱导释放[15.-17.］．否可以导致抑制线粒体渗透率过渡孔口，这可以是细胞死亡和心脏保护的关键末端效应器[18.那19.］．研究发现，抑制没有合成酶的梗塞后处理的梗塞尺寸限制效应[20.］．在目前的研究中，我们已经表明，酸中毒再灌注不会在灌注液中没有释放，而增强的心肌烯烯醇蛋白表达，而碱性灌注液的输注降低了灌注液中NO的水平以及心肌烯烯烯蛋白表达，伴随着AKT的活化降低。除此之外，PI3K抑制剂Wortmannin没有释放和烯雌蛋白表达，并平行于Akt和eNOS的磷酸化。所有这些结果表明酸中毒诱导了PI3K-AKT-eNOS途径的激活，由此不会增加释放，从而导致缺血再灌注损伤的衰减。

此外，短暂再灌注时氧合的恢复导致线粒体产生ROS, ROS可诱导氧化应激，从而导致再灌注时心肌损伤，而再灌注时的酸中毒已被报道降低ROS的生成[3.］．ros清除剂的管理缓解心肌缺血再灌注损伤[21.那22.］．在我们的研究中，我们发现酸性灌注液降低了灌注液和心脏组织15-F2T-异前烷的水平，氧化应激的特定标志物，类似于后处理的效果。它表明酸性灌注液可以抑制由心肌缺血再灌注损伤引起的氧化应激。然而，酸性灌注液的这种效果被PI3K抑制剂馄饨菌阻断。这些发现集体表明酸中毒部分通过激活PI3K信号传导途径来抑制氧化应激的酸中毒减弱缺血再灌注损伤。

总之，酸性再灌注精确地模仿了后处理的保护。酸中毒通过抑制ROS产生并通过激活PI3K-AKT-eNOS途径抑制ROS产生并增加释放来赋予CadioProtection。

作者的贡献

新乔，金津徐，新威刘，惠民刘同等贡献了这项研究。

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