集团VIB磷脂酶一₂促进扩散INS-1胰岛瘤细胞,对抗脂质过氧化反应和炎性细胞因子诱导细胞凋亡和氧化剂代理

文摘

集团VIB磷脂酶一₂(iPLA₂γ)是分布在膜性细胞器中β发生氧化反应,线粒体和过氧化物酶体,分泌细胞表达的胰岛β肽和INS-1胰岛瘤细胞,可受伤的炎性细胞因子,例如,il - 1β和干扰素-γ,通过氧化剂,例如,链脲霉素(STZ)或t-butyl-hydroperoxide (TBHP),通过过程相关的机制β类型1和2糖尿病细胞损失。我们发现孵化INS-1细胞il - 1β和干扰素-γ,或与STZ TBHP原因增加iPLA的表达式₂γ信使rna和蛋白质。我们准备好的INS-1击倒(KD)细胞系iPLA减少₂γ表达,他们比控制INS-1细胞增殖较慢并接受增加膜过氧化作用的细胞因子或氧化剂的反应。积累氧化磷脂分子物种STZ-treated INS-1细胞通过LC / MS / MS扫描,并在iPLA水平₂γkd细胞超过控制细胞。iPLA₂γkd INS-1细胞也表现出更高水平的比控制细胞凋亡与STZ孵化时或者与il - 1β和干扰素-γ。这些发现表明,iPLA₂γ促进β细胞增殖,其表达式是在炎症或增加氧化应激作为一种机制来减轻膜损伤,可能会增强β细胞的生存。

1。介绍

糖尿病(DM)是人类最常见的内分泌疾病,达到大流行比例在美国和其他地方1]。DM代表一个星座的障碍分为大类类型1和2 (T1DM和2型糖尿病)。T1DM是由于自身免疫破坏体内胰岛β肽(2,3],炎性细胞因子释放的入侵期间白细胞胰岛炎被认为参与这些过程(4,5]。其中有il - 1β损害胰岛素分泌,造成胰岛损伤(6),和干扰素-γil - 1,大大强化了破坏性的影响β(7]。这些影响是介导的诱导一氧化氮(NO)合酶表达和生产过剩的8- - - - - -13],可以诱导细胞凋亡的机制,包括代活性氧导致氧化应激(13- - - - - -15]。

2型糖尿病被认为进化后的初始胰岛素抵抗近正常糖耐量是由补偿分泌过多的胰岛素β肽(16,17]。在某种程度上未能维持胰岛素的分泌在足够高的水平,葡萄糖耐受不良和随之而来的公开的DM (18]。一个因素的最终失败β细胞减少补偿β细胞质量50%或更多,这至少部分发生凋亡β细胞死亡(16,19]。尽管许多机制可能参与这些过程,生产引起的活性氧代谢压力提出了代表损伤,最终导致的最后共同通路β电池故障(17,20.- - - - - -29日]。在支持观察β肽表达低水平的抗氧化剂防御酶相比其他组织(30.- - - - - -33),从葡萄糖毒性,抗氧化化合物提供保护小岛在体外和2型糖尿病动物模型的发展在活的有机体内(34,35]。

β细胞必须维持一个高水平的代谢活动,提供营养的关键信号的耦合传感胰岛素分泌(36- - - - - -50),为了满足不断对胰岛素的生物合成和加工的需求。长时间的过度刺激的β肽可能最终导致他们的失败结果的压力强加于线粒体和内质网(ER) (51- - - - - -53]。蛋白质合成,包括胰岛素原,发生在急诊室,必须正确折叠和新兴的蛋白质,其中包括二硫键的形成。这是一个氧化反应,需要维护在ER prooxidant环境。持续过度会导致ER应激和生产过剩的活性氧(ROS)超过ER还原能力,导致活性氧泄漏ER和细胞氧化应激(54- - - - - -57]。

线粒体代谢减少活性氧的主要来源生产通过完整的分子氧在呼吸链中产生超氧化物阴离子()[58,59),而产量增加,代谢活动(21,60]。是被超氧化物歧化酶(MnSOD)催化歧化作用到H₂O₂这可以减少H₂通过过氧化氢酶或阿谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽。如果代超过移除,多余的H₂O₂可以接受菲^{2 +}催化转化为^•(芬顿反应)或和^•HO (Haber-Weiss反应)。这些活性氧可以通过机制,包括损伤线粒体膜磷脂过氧化反应(14,61年和应力途径的激活27- - - - - -29日]。线粒体磷脂过氧化反应可以沉淀内膜细胞色素c的释放到胞质(14,62年- - - - - -65年),这可以启动细胞凋亡66年,67年]。释放形成的细胞色素c与caspase-9 apoptosome [68年),导致激活的刽子手caspases-3, 6和7,拆除细胞(66年,69年]。

它提出了磷脂酶A₂(中国人民解放军₂)可以通过修复预防或中止凋亡peroxidized膜磷脂(63年- - - - - -65年,70年- - - - - -76年]。中国人民解放军₂酶催化的水解sn二酯键的glycerophospholipids产生游离脂肪酸和2-lysophospholipid和至少16个主要团体在中国人民解放军₂总科是公认的77年,78年]。在他们提出的功能膜改造和保护或修复膜的氧化损伤(63年- - - - - -65年,70年- - - - - -72年在一个涉及到解放军的序列₂催化的氧化脂肪酸残基(73年)产生一个可以reacylated lysophospholipid未氧化的脂肪酸保持膜完整性(74年]。

一个解放军₂适合这样的角色因为取代基氧化脂肪酸通常发生在吗sn2的位置磷脂大多数多不饱和脂肪酸(PUFA)取代基,如亚油酸酯(C18:2)和花生四烯酸(C20:4)酯化(73年,74年]。PUFA尤其容易受到氧化,因为他们包含国际清算银行烯丙基的二根不稳定H原子可以抽象产生carbon-centered激进,容易与氧气反应生成脂肪酸氢过氧化物(73年]。氧化减少的疏水性sn2脂肪酸取代基,并允许它的亲水性磷脂headgroup更紧密(73年]。这增加分离头组,这导致的sn二酯键更方便于解放军₂。解放过氧化脂肪酸可以降低醇后,谷胱甘肽氧化酵素被解放军从磷脂释放₂酶(75年,76年]。

两个组的成员VI解放军₂已经提出家庭扮演这样一个角色在修复氧化线粒体膜磷脂(63年- - - - - -65年,70年- - - - - -72年]。集团通过中国人民解放军₂(iPLA₂β)本地化胰岛瘤细胞中线粒体和防止oxidant-induced细胞凋亡,并从iPLA胰岛细胞₂β零的老鼠表现出增强的易感性oxidant-induced细胞凋亡(63年- - - - - -65年]。Oxidant-induced肾近端小管细胞的脂质过氧化和死亡(RPTC)会使解放军第六组₂抑制剂bromoenol内酯(贝尔)71年),和R-BEL选择性地抑制组VIB解放军₂(iPLA₂γ),加速oxidant-induced脂质过氧化反应和肾皮质线粒体损伤72年]。此外,当小发夹核糖核酸(成分)腺病毒用于减少RPTC iPLA₂γ表情,脂质过氧化反应和敏感细胞凋亡诱导的氧化剂叔丁基氢过氧化物(TBHP)增加70年]。

后者的观察(70年- - - - - -72年]表明iPLA₂γ行为减少脂质过氧化,预防oxidant-induced肾近端小管细胞凋亡,这可能反映了iPLA₂γ催化的氧化PUFA残留物从glycerophospholipids在线粒体氧化应激条件下形成的。这可能允许合成lysophospholipid与一个未氧化的reacylated PUFA残留物,从而恢复功能,由于氧化膜受损。在缺乏iPLA₂γ或者当其活动受损,这修复机制不能充分运作,这可能导致进步的线粒体损伤,最终引发细胞凋亡的线粒体途径70年- - - - - -72年]。

这里我们进行了实验,以确定是否iPLA₂γ可能在体内发挥类似的作用β肽因为线粒体氧化应激引起的损伤似乎是一个重要的机制β细胞在糖尿病的发展[损失16- - - - - -35]。我们的研究涉及iPLA的准备₂γiPLA击倒INS-1胰岛瘤细胞系₂γ表达式是减少稳定表达的成分和比较这些线控制INS-1细胞系敏感性脂质过氧化和细胞凋亡诱导的炎性细胞因子il - 1β和干扰素-γ和氧化剂代理TBHP70年)和链脲霉素(STZ) [79年]。

2。材料和方法

2.1。材料

彩虹分子质量标准、PVDF膜和特里同x - 100来自Bio-Rad(美国里士满,CA);从热费希尔SuperSignal西毫微微衬底;Coomassie试剂和sds - page供应来自英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德);牛血清白蛋白(BSA,脂肪酸免费的,分数V)来自议员生物医学(梭伦,哦,美国);链脲霉素(STZ)和叔丁基氢过氧化物(TBHP)从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。细胞培养

INS-1鼠胰岛瘤细胞稳定转染,mock-transfected INS-1 RPMI 1640培养基培养细胞生成和包含11毫米葡萄糖,10%胎牛血清,10毫米消息灵通的缓冲区,2毫米谷氨酰胺、丙酮酸钠1毫米,50毫米β巯基乙醇、青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素,基本上如前所述80年]。交换的媒介是每2天,和细胞培养分离一周一次。细胞融合增长到80%,治疗后收获表示在图中传说或结果的文本部分。孵化项目都在37°C下95%空气/ 5%公司的氛围₂。

2.3。建立iPLA₂γ击倒INS-1胰岛瘤细胞系使用核和一个慢病毒载体

两个hairpin-forming寡核苷酸针对iPLA₂γ信使rna被克隆到FIV H1 Lentivector根据制造商的指示(印度国家银行系统生物科学、山景、钙、美国),描述程序(80年]。针对合成寡核苷酸序列在下面斜体和下划线。序列的第一个5′-GATCCGCAAGAGTGAGTATTGATAACTTAAGAGAGTTATCAATACTCACTCTTGCTTTTTT-G-3′。第二个寡核苷酸5′-GATCCGGGCCATATTAGCATTCATGCTTCAAGAGAGCATGAATGCTAATATGGCCCTTTTTTG-3′。构建表达shrna FIVH1-iPLA指定₂1和FIVH1-iPLA₂2。细胞与新霉素被选中。

2.4。免疫印迹分析

细胞被收获,用近一个整除(30μg)的溶解产物分析了蛋白质sds - page (8 - 12% Tris-Glycine凝胶,表达载体),转移到Immobilon-P聚乙二烯二氟化物膜(美国Bio-Rad,里士满,CA),免疫印迹分析和加工,如前所述[81年]。主要为iPLA抗体浓度₂γ(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)是1:500。二次抗体浓度是1:10000。图中描述的其他抗体的浓度传说。免疫反应性的乐队被可视化增强化学发光(ECL)。

2.5。INS-1测定细胞增殖率

INS-1细胞增殖率测量的两种方法,如前所述[80年]。一个分析是基于荧光增强CyQuant GR与核酸结合时,它反映细胞DNA的数量(82年]。细胞被播种到96孔板(3×10³细胞/)。介质被1或3天后,细胞被冻结(−20°C)。DNA测定CyQuant分析工具包(分子探针,Inc .,尤金,或者美国)参照标准曲线。CyQuant GR(200的解决方案μL)被添加到每个好,孵化(5分钟,房间温度)。荧光测定微型板块荧光计(激发,480海里;发射,538海里)。第二个实验是基于对胸苷掺入模拟5-bromo-2′-deoxyurindine (BrdU)在增殖细胞中DNA (83年]。细胞被播种(10⁴细胞/)和培养(3天)在试验一种酶联免疫分析法检测设备三世BrdU标记后(罗氏应用科学)。

2.6。脂质过氧化作用

脂质过氧化是使用开曼TBARS量化分析工具(美国开曼化工、安阿伯、MI)根据制造商的指示,如前所述[64年,84年]。来自多不饱和脂肪酸脂质过氧化物分解形成一系列复杂的羰基化合物,包括反应性物种,如MDA。测量硫代巴比土酸活性物质(TBARS)通过确定吸光度在530纳米是用来评估脂质过氧化的程度84年]。结果表示为μ摩尔/μg蛋白。

2.7。HPLC-ESI-MS / MS分析氧化脂质

脂质提取INS-1细胞被储存在密封的瓶(N₂−20°C)抑制artifactual氧化、提取和分析了LC / MS / MS的方式类似于先前描述(85年在公证高效液相色谱(美国热电子,圣何塞,CA)使用修改后的梯度(86年]在C8柱(15厘米×2.1毫米,σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)界面的离子源的热电子有利的三重四质谱仪和扩展的质量范围在负离子模式下操作。串联女士扫描的前兆m / z295年,m / z319年,m / z343进行单独识别glycerolipid分子物种含有含氧形式的多不饱和脂肪酸(PUFA)亚油酸酯(C18:2),花生四烯酸(C20:4),或docosahexaenoate (C22:6),分别。主要oxylipid物种(1-stearoyl 2-hydroxyeicosatetraenoyl)——确定sn-glycerophospho-ethanolamine [(C18:0 / HETE) gpe),它是由MRM量化782.76→319.3,这是一个过渡,对应的生产HETE羧酸盐阴离子(mh)的⁻父oxy-phospholipid的离子物种。

2.8。流式细胞术对细胞凋亡的评价

INS-1细胞凋亡测定使用Annexin-VFLUOS染色工具包(美国罗氏应用科学,印第安纳波利斯)根据制造商的指示,基本上如前所述[64年,87年]。短暂,收获细胞被洗PBS和resuspended Annexin-VFLUOS标签解决方案(100μ孵化后L)。(10 - 15分钟,15 - 25°C),细胞被转移到fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)管和稀释1:5提供的缓冲设备。荧光在细胞分析FACscan流式细胞分析仪(BD生物科学,火花,医学博士,美国)的激发波长488 nm,与WinMDI 2.9软件和数据处理。

2.9。统计分析

结果表示为±SEM。进行评估的数据未配对,双尾学生的之间的差异以及两个条件或通过与适当的posthoc方差分析测试对于较大的集,如前所述[80年,81年,87年]。重要性水平图中所描述的传说,和一个值< 0.05被认为反映了显著差异。

3所示。结果

3.1。INS-1细胞iPLA₂γ表达和炎性细胞因子和氧化剂的影响

表达iPLA INS-1胰岛瘤细胞被发现₂γ信使rna和iPLA₂γ免疫反应性的蛋白质定量聚合酶链反应和免疫印迹,分别(图1),也表现出iPLA₂活动(没有显示)。孵化与炎性细胞因子il - 1β和干扰素-γ导致iPLA INS-1细胞表达的增加₂γ信使rna浓度的方式(图1(一)),iPLA的表情₂γ免疫反应性的蛋白质表现出类似的模式(图1 (b))。

主要iPLA₂γ免疫反应性的乐队(图1 (b))迁移明显兆瓦的大约74 kDa的sds - page及免疫印迹分析INS-1细胞溶解产物,但其他乐队的观察变量强度明显MW 40至88 kDa(未显示),如前所报道(88年,89年]。虽然全身iPLA₂γcDNA编码一个88 kDa蛋白质,转录和转译监管机制导致生产多个不同大小的基因产物,和主要的物种经常迁移74 - 77 kDa的明显兆瓦(88年,89年]。

iPLA表达的增加₂γ信使rna诱导il - 1β和干扰素-γ依赖于培养时间(图1 (c))。孵化INS-1细胞氧化的代理链脲霉素(STZ) [79年)(图2(一个))或t-butyl-hydroperoxide (TBHP) [70年)(图2 (b))也导致表达iPLA浓度增加₂γ信使rna(图2)和蛋白质(没有显示)。

这些发现暗示iPLA upregulation的可能性₂γ表达式可能代表一个补偿性反应有害特工为了提高β细胞生存在炎症和氧化应激的设置。研究这种可能性,抑制iPLA INS-1细胞的效果₂γ检查表达式。

3.2。建立iPLA₂γ可拆卸的INS-1细胞系

INS-1细胞感染FIV构造包含插入产生炒RNA(控制)或在iPLA shRNA针对序列₂γ信使rna。选择neomycin-resistant细胞导致隔离的两个克隆稳定整合可拆卸的结构和表达细胞iPLA不到20%的控制₂γ分析了实时PCR(图时mRNA的内容3(一个))或北部墨迹图(图中未显示)和减少大量的iPLA₂γ免疫反应性的蛋白质对西方的屁股(图3 (b))。的iPLA₂γ击倒(iPLA₂γkd)细胞系也减少iPLA展出₂活动(图中未显示),相当的大小减少mRNA水平(图3(一个))。iPLA水平₂γ表达式是一个稳定的控制和iPLA财产₂γkd INS-1细胞系,坚持文化的串行通道。

3.3。INS-1细胞系增殖率

细胞增殖测定使用一个指标,表现出强烈的荧光增强与核酸(82年]。相同数目的细胞INS-1细胞系被播种在时刻0,和监控他们的增长率在72年人力资源。INS-1 iPLA₂γkd线扩散速率明显低于那些控制INS-1细胞(图4)。当扩散也获得了类似的调查结果来衡量BrdU并入DNA (83年]和播种时执行在不同的初始细胞密度(没有显示)。

3.4。脂质过氧化作用在INS-1细胞系

脂质过氧化作用是通过测量监控TBARS [64年,84年在INS-1与il - 1细胞系孵化β和干扰素-γ或与氧化剂代理STZ TBHP类似条件下的数据1和2。相对于细胞只有车辆孵化,孵化与细胞因子诱导混合显著增加脂质过氧化反应在两种控制INS-1细胞(在iPLA倍)和₂γkd细胞(倍),后者实现水平(pmol /μg蛋白)显著高于前者(pmol /μg)(图5)。观察类似的模式在孵化与STZ诱导脂质过氧化反应在显著上升控制INS-1细胞(在iPLA倍)和₂γkd细胞(倍),后者实现水平(pmol /μg)显著高于前者(pmol /μg)(图5)。孵化TBHP也诱导的脂质过氧化的内容控制INS-1细胞(在iPLA倍)和₂γkd细胞(倍),有一个无意义的趋势水平实现后者(pmol /μ在前(g)超过pmol /μg)。

3.5。HPLC-ESI-MS / MS分析氧化脂质分子物种积累与链脲霉素INS-1细胞孵化

检查氧化脂质分子物种INS-1细胞,LC / ESI /串联质谱扫描是用来检测母离子,解放一个氧化不饱和脂肪酸羧酸盐阴离子(图6(一))在碰撞离解(CAD)激活(85年]。Hydroxyeicosatetraenoate (HETE) (m / z319.3)引起的氧化模拟glycerophosphoethanolamine (GPE)物种18:0/20:4-GPE (oxy-analogm / z782.76)被发现代表最丰富的氧化脂质物种在INS-1细胞(图6 (b)),这是与事实相一致,这也是最丰富的氧化GPE脂质在激活血小板85年),18:0/20:4-GPE是最丰富的GPE INS-1细胞脂质(90年和大鼠胰岛91年]。图6 (b)显示一个MS / MS扫描父(mh)⁻离子前体的范围m / z400年到m / z2000年,产生HETE (mh)⁻(m / z319.3)在碰撞离解激活,m / z782.76是主要的母离子。图6 (c)是一个扩张的质谱范围m / z782.5到785.0,说明了(¹³C] isotopomer (mh)的分布⁻离子。

的内容oxylipid物种(C18:0 / HETE) gpe INS-1细胞被量化LC / ESI / MS / MS MRM过渡782.76→319.5(数据的扫描6 (d)- - - - - -6 (g)),发现孵化与STZ诱导的增加(C18:0 / HETE) gpe的内容只与矢量控制INS-1细胞转染(数字6 (d)和6 (e))和iPLA₂γ可拆卸的INS-1细胞(数字7(f)和7(g))。基底的水平(C18:0 / HETE) gpe和孵化与STZ iPLA后实现₂γ击倒INS-1细胞超过控制INS-1细胞(图7(h)),这是符合iPLA的提议₂β行为从磷脂特许权氧化PUFA残留,这样合成lysophospholipid可以与一个未氧化的脂肪酸reacylated取代基恢复父磷脂的结构和功能63年,64年]。

氧化心磷脂物种没有直接观察到由于母公司的丰度相对较低脂质在所有细胞脂质和亚油酸酯残留的倾向,心磷脂的主要取代基脂肪酸,氧化后进行断链反应,产生各种各样的截断sn2取代基而不是single-predominant物种[92年]。类似的行为已经观察到的其他多不饱和脂肪酸(93年]。线粒体含有大量的GPE脂质,不过,他们接受最大的部分修改测量线粒体脂质类在诱导细胞凋亡(94年),这表明GPE线粒体磷脂氧化脂质氧化是一个代理的标志。

3.6。INS-1细胞株的细胞凋亡

细胞凋亡被膜联蛋白V绑定通过流式细胞仪测定监控(64年,87年与il - 1 INS-1细胞株孵化β和干扰素-γ类似条件下在图1。炎性细胞因子诱导细胞凋亡的增加一个健壮的混合控制INS-1细胞和iPLA₂γkd细胞和凋亡细胞的比例cytokine-treated条件明显高于后者(比前者(%)%)(图7(一))。孵化INS-1细胞系的氧化剂代理也STZ诱导浓度增加凋亡细胞的比例明显高于iPLA₂γkd细胞()比控制INS-1细胞()在最高STZ浓度(7.5毫米)(图进行测试7 (b))。

4所示。讨论

丧失分泌细胞β肽发生在I型和II型糖尿病(T1DM和2型糖尿病)和细胞凋亡被认为是主要的机制β细胞死亡发生(16,19]。脂质氧化启动细胞凋亡中起着重要的作用[17,20.- - - - - -29日,有人建议,生成的活性氧导致cardiolipinperoxidation线粒体膜,造成thelipidbilayer和强化膜透化作用,细胞色素c的释放,细胞凋亡61年- - - - - -67年]。理解的机制β细胞线粒体膜用来保护其免受氧化损伤可能产生洞察的发病机制β细胞的损失和发展意味着治疗或预防T1DM和2型糖尿病。

磷脂酶一₂(中国人民解放军₂)水解glycerophospholipids产生游离脂肪酸和2-lysophospholipid [77年,78年,解放军₂被认为参与信号和membrane-remodeling过程包括氧化损伤的修复膜,以保持其功能完整性(70年- - - - - -74年]。当发生脂质过氧化反应,氧化了sn2,磷脂脂肪酸取代基变得更疏水和更容易地获得磷脂酶(73年]。解放军lysophospholipid,结果₂催化的氧化脂肪酸取代基可以与一个未氧化的脂肪酸reacylated恢复原生父磷脂的结构和功能。

两名脂肪酶的家庭(95年)被指定组第六人民解放军₂(96年]或patatin-like磷脂酶domain-containing (PNPLA)蛋白质97年]在重塑线粒体心磷脂可能扮演这样一个角色,也不需要Ca酶^{2 +}催化活性。集团通过中国人民解放军₂(iPLA₂β)是这个家族的第一个成员识别(98年,99年),也是指定的PNPLA9。集团VIB解放军₂(iPLA₂γ之后)是公认的(88年,One hundred.和也指定PNPLA896年,97年]。iPLA₂γ线粒体和过氧化物酶体中表达89年,101年,102年),这都是膜性细胞器,产生活性氧,和iPLA₂γ与iPLA合作₂β在某些情况下(刺激磷脂水解103年]。

线粒体也包含iPLA₂β,和观察果蝇人类巴斯综合征模型提高了兴趣iPLA的可能性₂β参与心磷脂改造(104年]。巴斯综合症tafazzin基因的突变的结果,它编码线粒体phospholipid-lysophospholipid transacylase,和疾病的特点是严重cardioskeletal肌病,low-cardiolipin内容和异常心磷脂脂酰组成(105年]。Tafazzin-deficient果蝇有类似的心磷脂含量和线粒体功能异常与monolysocardiolipin积累,这表型是失活的压抑iPLA₂β基因,这表明iPLA₂β有助于monolysocardiolipin形成(104年]。

几个观测表明iPLA₂γ也参与心磷脂重建。的选择性超表达iPLA₂γ在小鼠心肌导致线粒体功能改变与心脏功能障碍(106年,107年),和遗传iPLA消融₂γ产生一个有缺陷的线粒体生物能量学表型(108年)与认知功能障碍与海马相关异常,包括线粒体变性和改变心磷脂含量和分子物种分布(109年]。iPLA₂γ零老鼠也会表现出夸张的高脂肪食源性组织心磷脂含量和成分的变化和线粒体脂肪酸氧化模式改变的110年,111年]。心磷脂重构在心力衰竭大鼠心肌线粒体发生似乎也涉及iPLA₂γ(112年]。

iPLA₂β和iPLA₂γ合作影响某些细胞命运的决定(113年),酶可能参与决定细胞存活,要么屈服于心磷脂代谢氧化损伤通过他们的角色。在β肽,刺激诱导细胞凋亡导致iPLA₂β从细胞溶质再分配到线粒体(63年- - - - - -65年,92年,114年- - - - - -119年]。例如,Staurosporine刺激INS-1细胞线粒体超氧化物生产,这导致线粒体膜过氧化反应,细胞色素c的释放,细胞凋亡63年- - - - - -65年]。Staurosporine-induced膜过氧化作用和细胞凋亡β肽是由overexpressing减毒iPLA₂β和放大的药物抑制或基因消融(63年- - - - - -65年]。这对于iPLA可能反映了一个角色₂β特许权氧化心磷脂脂肪酸残基生成monolysocardiolipin物种可以reacylated恢复原生结构(63年- - - - - -65年]。

药理学(120年观测表明,iPLA₂γ可能扮演相同角色,心磷脂改造(112年),这是符合异常而导致的心磷脂含量和组成的基因操纵iPLA₂γ表达式[108年- - - - - -110年]。在肾近端小管细胞,药物抑制或分子生物抑制iPLA的表达式₂γ增加易感性oxidant-induced脂质过氧化反应,线粒体功能障碍,和细胞死亡70年- - - - - -72年]。这些观察结果促使我们决定iPLA₂γ可能发挥类似的作用β肽,给定的重要性β细胞损失通过氧化损伤在糖尿病的发展20.- - - - - -35]。

我们的发现表明iPLA₂γ参与维护的总质量吗β肽通过促进其增殖和保护他们免受氧化膜损伤诱导炎性细胞因子或氧化剂代理,导致细胞凋亡。我们iPLA₂γ击倒(KD) INS-1细胞系表现出比控制INS-1细胞显著降低增长率。炎性细胞因子il - 1β和干扰素-γ增加INS-1细胞iPLA₂γ表情,和一个类似的反应发生在INS-1细胞与氧化剂代理STZ和TBHP孵化。这些发现表明,iPLA₂γ可能是调节作为补偿损伤修复机制,以应对代理吗β肽,这是符合iPLA的观察₂γkd INS-1细胞也更敏感比控制细胞损伤炎性细胞因子和氧化代理。这些发现在β细胞行符合增加敏感度oxidant-induced肾近端小管细胞的脂质过氧化和细胞凋亡与iPLA减少₂γ表达式[70年),建议iPLA₂γ在修复过程中发挥作用氧化膜和减轻oxidant-induced细胞损伤。

细胞因子和氧化剂代理的机制增加iPLA的表达₂γ尚未确定实验,但是iPLA的积累呢₂γ信使rna表明增加转录。当前实验检查潜在机制的重点是三种可能性。一是氧化还原敏感的转录因子NF_κB是通过激活ROS-mediated抑制亚基我的失活_κB (121年- - - - - -124年),NF_κB iPLA刺激转录₂γ基因直接或间接。NF_κB激活导致β细胞损伤引起的细胞因子(125年]类似条件下使用这里描述的研究。两个是iPLA的转录激活₂γ通过p38 MAPK-dependent通路基因可能发生,因为刺激引起β细胞ER应激和细胞凋亡导致p38 MAPK激活(87年],ROS-induced p38 MAPK激活导致细胞凋亡在其他细胞(126年,127年]。

三是ROS-induced氧化细胞磷脂收益率为转录因子PPAR论争的配体γ正如之前报道的(128年iPLA],然后激活转录₂γ基因。正是在这方面感兴趣的条件,导致3 t3l1成纤维细胞脂肪细胞的分化导致PPAR的表情γ而在转录upregulation iPLA₂γ和iPLA₂β和酶,阻止针对块分化(113年]。

INS-1细胞氧化磷脂的存在对氧化剂代理这里描述的研究是由执行LC / MS / MS扫描的脂质提取的前兆m / z295年,m / z319年,m / z343年为了识别glycerolipid分子物种包含单氧合形式的多不饱和脂肪酸(PUFA)亚油酸酯(C18:2),花生四烯酸(C20:4),或docosahexaenoate (C22:6),分别。主要oxylipid物种鉴定(硬脂酰hydroxyeicosatetraenoyl) -glycerophosphoethanol-amine ((C18:0 / HETE) gpe),它是量化的MRM过渡782.6→319.3,这对应于生产HETE羧酸盐阴离子(mh)的⁻父oxy-phospholipid的离子物种。小观察到其他物种m / z值但没有进一步低信号的特征,因为从有限的脂质中获得INS-1细胞的数量与实际工作。

尽管C18:0 / HETE-PE最丰富的氧化磷脂观察到这里,它可能不是唯一的氧化物种在这些条件下形成的。氧化脂质只代表一小部分未氧化的前体(大大低于1%),和所有但最丰富的物种可能会低于定量的限制,即使在混合物,当膜脂质可用于分析的数量限制。此外,其他磷脂氧化产品,例如,那些包含酯化hydroperoxy——或者ketofatty酸衍生品(129年),就不会被检测到的方法用在这里,也未能检测酯化短链取代基引起的PUFA氧化(130年]。此外,无论是地区——还是氧化的定向性是决定在我们的研究,因为有限的氧化脂质可用于表征,和有可能C18:0 / HETE-PE由几个不同的异构体,报道的其他细胞(85年]。

尽管如此,我们认为C18:0 / HETE-PE代表一个合理的磷脂氧化的标志在我们的实验中有几个原因。首先,体育更丰富的氧化物种刺激单核细胞和血小板比其它磷脂头部组类的氧化物种,包括电脑、π,PS、PG (131年],C18:0 / HETE-PE最丰富的氧化diacyl-phospholipid在这些条件下(85年,131年,132年]。第二,前体C18:0 / C20:4-PE物种最丰富的体育INS-1细胞(90年,91年]。此外,含有大量的线粒体PE脂质,他们接受最大的部分修改测量线粒体脂质类在诱导细胞凋亡(94年),这表明PE脂质氧化作为代理标记线粒体磷脂氧化。

这里的LC / MS / MS测量报告表明INS-1细胞C18:0 / HETE-PE内容增加在孵化与氧化剂代理和较高iPLA细胞₂γ表达水平来控制细胞相比都被拆毁了。这是兼容iPLA的角色₂γ氧化磷脂的改造涉及切除氧化PUFA残留屈服lysophospholipid物种可以reacylated未氧化的脂肪酰coa分子。这将生成本机磷脂结构和恢复其正常功能,从而减轻氧化损伤的影响,否则诱导细胞凋亡。

5。结论

集团VIB磷脂酶一₂(iPLA₂γ)在线粒体分布和表达的分泌胰岛β肽和INS-1胰岛瘤细胞易受氧化损伤的炎性细胞因子,例如,il - 1β和干扰素-γ,通过氧化毒素,例如,链脲霉素(STZ)或t-butyl-hydroperoxide (TBHP),通过过程相关β类型1和2糖尿病细胞损失。我们在这里展示INS-1细胞孵化与il - 1β和干扰素-γ,或与STZ TBHP iPLA的增加他们的表达₂γ信使rna和蛋白质,INS-1击倒(KD)细胞系iPLA减少₂γ表达比控制INS-1细胞增殖较慢并接受增加膜过氧化孵化时细胞因子或氧化剂。积累的氧化磷脂物种(1-stearoyl 2-hydroxyeicosatetraenoyl)sn-glycerophosphocholine证明在STZ-treated INS-1细胞通过LC / MS / MS扫描,和iPLA水平₂γkd细胞超过控制细胞。iPLA₂γkd INS-1细胞也表现出更高水平的比控制细胞凋亡与STZ孵化时或者与il - 1β和干扰素-γ。在一起,这些观察结果表明,iPLA₂γ促进β细胞增殖,其表达在炎症或增加氧化应激可以减轻膜损伤,从而提高β在这些条件下细胞的生存。

缩写

贝尔:	Bromoenol内酯
计算机辅助设计:	碰撞离解激活
C18:2:	亚油酸酯
C20:4:	花生四烯酸
C22:6:	Docosahexaenoate
糖尿病:	糖尿病
呃:	内质网
应急服务国际公司:	电喷雾电离
流式细胞仪:	Fluorescence-activated细胞分类
谷胱甘肽:	谷胱甘肽
HETE:	Hydroxyeicosatetrenoate
干扰素-γ:	干扰素-γ
il - 1β:	白介素1 -β
iPLA2β:	集团通过中国人民解放军2
iPLA2γ:	集团VIB磷脂酶一2
LC:	液相色谱法
KD:	可拆卸的
MDA:	丙二醛
MRM:	多反应监测
女士:	质谱分析
女士/小姐:	串联质谱
PC:	磷脂酰胆碱
体育:	磷脂酰乙醇胺
答:	Phosphatidylglycerol
PI:	磷脂酰肌醇
PS:	磷脂酰丝氨酸
PUFA:	多不饱和脂肪酸
ROS:	活性氧
RPTC:	肾近端小管细胞
扫描电镜:	平均数标准误差
成分:	小发夹核糖核酸
SOD:	超氧化物歧化酶
STZ:	链脲霉素
TBARS:	硫代巴比土酸活性物质
TBHP:	t-butyl-hydroperoxide。

确认

这项工作是由美国公共卫生服务补助R37-DK34388 P41-RR00954 P60-DK20579 P30-DK56341, S。包支持培训资助5 T32 DK007120。作者感谢阿兰·波尔的技术援助和罗伯特·桑德斯的援助准备纸和数字。

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