评估一个标准化的电子顺磁共振ROS在人类生产状况gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

尽管越来越感兴趣的角色活性氧(ROS)在健康和疾病,可靠的定量的无创性方法评估氧化应激在人类仍然缺乏。EPR技术,耦合到一个特定的自旋探针(不啻:1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2、5、5-tetramethylpyrrolidine)在这里作为选择的方法获得的直接测量ROS在生物体液和组织。研究旨在证明,不同于目前的“后验”化验ROS-induced损伤的生物分子(如蛋白质和脂质)spin-trapping EPR提供了直接证据的“瞬时”的激进的物种在样例,作为信号区域是受激电子自旋的数量成正比,导致绝对浓度水平。使用最近开发了板凳上连续波系统(e-scan电子顺磁共振扫描仪,力量)处理小(50 ROS浓度非常低的水平gydF4y2BaμgydF4y2BaL)样品,我们成功地监测快速活性氧产量变化后外周血运动员控制运动和久坐不动的主题后抗氧化补充。EPR之间的关系和数据通过各种酶化验结果(例如,蛋白质羰基硫代巴比土酸活性物质)决定。综合,我们的方法允许可靠、快速、无创定量测定人体外周血的活性氧。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

活性氧(ROS)是一组化合物具有高反应活性和短半衰期,因为他们倾向于给予或接受电子达到稳定。gydF4y2Ba

另一方面,细胞暴露在各种各样的ROS通过外源性和内源性的来源。然而,尽管我们整个有机体的极强的接触来自外源活性氧的来源,内源性活性氧扮演最重要和广泛的角色,因为,在我们生命的时间进程,每个人体细胞不断暴露。线粒体活性氧的主要负责生产(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba];酶是另一种内源性活性氧的来源。虽然大多数酶能产生ROS作为活动的副产品(黄嘌呤氧化酶是一个明显的例子)他们中的一些人似乎专门设计生产活性氧:一氧化氮合酶产量没有激进分子;NADPH氧化酶复杂利用电子从氧分子产生超氧化物自由基gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

从内生和外生来源结果连续ROS流出的不间断和累积氧化损伤细胞组件改变很多细胞功能。gydF4y2Ba

最脆弱的生物氧化损伤的目标蛋白,膜脂质和DNA。确实最通常采用氧化应激量化的技术是基于特定的终端产品的决心破坏造成活性氧与这些生物大分子之间的相互作用(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。然而,所有这些方法返回一个间接ROS的决心,而唯一的技术能够提供一个直接自由基检测是电子顺磁共振(EPR)。的事实,这种技术也uncapable直接彻底的检测,因为短半衰期的激进的EPR时间尺度(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。为了克服这种差距,一般一个技巧是因此使用:一个稳定化合物陷阱的激进,成为激进,但半衰期兼容EPR的时间尺度,因此,电子顺磁共振检测。使用化合物分为两个主要团体:旋转陷阱,不使用生物和浓度高,并自旋探针以同样的方式工作,但在较低浓度和更高的效率gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。此外,通过它的本质,EPR是一种定量技术,因为信号与受激电子自旋的数量成正比。因此,使用参考化合物绝对浓度水平可以达到。gydF4y2Ba

尽管极大的兴趣在生物学和医学测量ROS, EPR技术至今未被广泛使用,因为几个技术和方法论的问题(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

一个新的商业电子顺磁共振波谱仪(e-scan力量)是能够克服的差距,对于生物和医疗应用程序,因为它在常见的微波频率和交易水平非常低的浓度(摩尔)小样本卷(50毫升),还应对简单的可移植性和处理功能。通过原理可以应用到许多样本和生物环境,如培养细胞,器官或gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba动物或人类的血。到目前为止,血液是最常用的生物样品测定抗氧化剂活性氧引起的标记和氧化产品生产在人类研究中,而肌肉活检一般道德不切实际的由于其侵入性性质。进一步减少侵袭性的技术,从而增加其临床和诊断的潜力,在此,我们调查的应用radical-probe ROS的测量方法在人类形成毛细管血液。这一目标,我们测试了我们的方法来监控ROS在健康志愿者外周血实施后两个治疗会影响氧化还原状态。gydF4y2Ba

众所周知,对氧化应激的方法之一是通过体育锻炼(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]:一个独特的关系建立与氧自由基的形成,所以提供一个很好的模型来研究氧化之间的动态平衡挑战和抗氧化防御机制在生物系统gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。事实上大家都知道体育锻炼增加活性氧的生成(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba在响应增加氧气利用率造成干扰prooxidant /抗氧化平衡支持前者导致氧化应激。一枚硬币的另一边,抗氧化化合物也可能改变氧化还原状态,通过减少活性氧的生产(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

本研究的目的是评估的有效性由一个新的mini-invasive ROS生成评估过程采用激进的探针EPR技术和改变氧化还原状态由两个干预,即运动和抗氧化剂。除了获得EPR的相关数据来生产氧化损伤,后者通过测量酶化验的主要生物标志物,在静止和控制体育锻炼后尝试。gydF4y2Ba

特别是,gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba活性氧的形成,反映了血液细胞的代谢活动和活性氧的生产gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,分析了毛细管血液中使用桌上型电子自旋共振波谱仪e-scan。另一方面,值得注意的是,有几个生物标志物可以量化的氧化改性大分子生物样本,尽管没有一个人可以独自充分描述氧化损伤;因此,提出了几个化验为了可靠地监测氧化应激生物标本/损失。广泛地查阅(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),硫代巴比土acid-reactive物质的评估(TBARS)和蛋白质羰基(PC)内容是使用最广泛的分析用于确定脂质过氧化反应和氧化损伤蛋白,分别。所有这些原因可能EPR结果之间的相关性和TBARS电脑收集的数据是未遂。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。运动治疗gydF4y2Ba

十八岁(gydF4y2BangydF4y2Ba= 18)男性精英运动员(19.70±1.16岁;高度1.78±0.04米;体重77.65±6.97公斤)的瓦雷泽曲棍球队被招募参加这项研究。受试者参观了实验室的两倍。第一天,收集人体测量和增量测试在跑步机(佔成绩的1%)自愿疲劳评估气体交换阈值(得到)和阿峰gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba吸收(签证官gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba峰)也执行。六分钟的热身运动后(根据身体健康的主题的估计水平),速度提高1公里·hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每一分钟。是签证官gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba测量峰值为51.57±1.36毫升·公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。第二次访问,至少七天之后,受试者进行了10分钟的轻快恒定负载高频(CLE)高剧烈运动和速度相应的签证官gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba= ~ 50%之间的区别和签证官gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba高峰。gydF4y2Ba

2.2。抗氧化治疗gydF4y2Ba

急性调查,十(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)健康久坐的女性(48.80±5.32岁;高度1.64±0.03米;体重56.81±10.35公斤)服用R-thioctic酸(1.6 g)。gydF4y2Ba

2.3。血液采样gydF4y2Ba

每个主题报道在上午9点实验室。在一夜之间快速的血液抽样。科目,所有非吸烟者,避免酒精和咖啡因的摄入至少24小时,并被要求不执行任何形式的锻炼前48小时测试。签署书面知情同意是所有参与者被告知一切险后,不适和收益参与这项研究。程序都符合赫尔辛基宣言和机构审查委员会批准了这项研究。gydF4y2Ba

2.4。EPR对活性氧检测协议gydF4y2Ba

实验协议采用活性氧检测如图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。对于每一个主题,招募锻炼过程中,毛细血从指尖之前和之后(立即、10和20分钟)恒定负载运动。gydF4y2Ba

抗氧化治疗,对于每个主题,毛细管血液从指尖R-thioctic酸前后政府(20、40、60,90分钟,2和3小时)。控制采样在休息,在相同的时间间隔,进行了在同一受试者补充前两天。gydF4y2Ba

对于这两种实验过程,50gydF4y2BaμgydF4y2BaL的血液,收集在肝素化毛细管(Cholestech LDX,德国),进行了分析(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(a))。在自旋捕获(否则标记探针)分子,适合生物利用率、1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrrolidine(不啻,Noxygen科学转移和诊断,德国)。1毫米而言不啻的解决方案是在缓冲区(Krebs-Hepes缓冲区包含25(制造)gydF4y2BaμgydF4y2BaM deferroxamine methane-sulfonate盐(DF)螯合剂和5gydF4y2BaμgydF4y2BaM三水diethyldithio-carbamate钠(DETC))在pH值7.4。血立刻处理而言不啻(1:1)。50gydF4y2BaμgydF4y2BaL获得的解决方案是放在玻璃EPR毛细管(Noxygen科学转移与诊断、德国),这是放置在空腔的e-scan光谱仪(力量、德国)数据采集(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(b))。实际解决方案分析选择填充整个谐振腔的敏感区域。收购EPR参数:微波频率= 9.652 GHz;调制频率:86千赫;调制幅度:2.28克;中心场:3456.8克;扫描宽度:60克;微波功率:21.90 mW;扫描数量:10;接收机增益:3.17·10gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。样品温度首先稳定,然后保持在37°C的温度和气体控制器“生物III”单位,界面上的光谱仪。记录电子顺磁共振信号的一个例子展示的三联体来自互动gydF4y2Ba^14gydF4y2BaN-OH群而言不啻与ROS氧未配对电子(能剧+ OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^•gydF4y2Ba→不gydF4y2Ba^•gydF4y2Ba+ HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)是显示在图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(d)。调查的自由基反应生成的带血的激进分子被收购,光谱顺序记录约5分钟,以便计算活性氧产量。EPR信号成正比的未配对电子数字和可能,反过来,被转换在绝对产生微摩尔(gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔·敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}CP):稳定gydF4y2Ba^•gydF4y2Ba(5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy 3-Carboxy-2、2、5)激进的信号被记录在一个单独的会话和用作参考。gydF4y2Ba

高重现性的EPR测量显示在报告的情节图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。数据被称为两个EPR测量数据(测试我(开放广场),测试II(封闭广场))上执行毛细血管样本相同的健康主题6小时。数据表示为任意单位和电子顺磁共振信号二重积分。回归直线从收集到的数据显示,获得一个优秀的相关系数(gydF4y2Ba= 0.99)导致几乎重合的情节:测试我(斜率:7.98,拦截:15.49);测试二(拦截斜率:7.95:15.95)。约0.5%差异ROS绝对生产(gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔·敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}计算两个测试)。gydF4y2Ba

2.5。限制选择EPR的检测和量化方法gydF4y2Ba

检测的局限性(LOD)和量化(定量限)可以使用我估计准则(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),它定义了这些参数的分析浓度限比(信噪比)至少3:1和10:1,分别在EPR,他们依赖于采集参数,特别是在扫描(NS)的数量,影响线性的信噪比和实验时间。电子顺磁共振谱的ROS在已知浓度的溶液(6gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)记录在同样的采集参数在目前的研究中,采用线属于ROS信号的信噪比与NS = 10 600年被发现。因此LOD和定量限马上计算,分别为6gydF4y2BaμgydF4y2Ba30·M×3/600 = 10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}μgydF4y2Ba米和6gydF4y2BaμgydF4y2BaM×10/600 = 100·10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}μgydF4y2BaM。gydF4y2Ba

2.6。酶化验gydF4y2Ba

金星前后血液样本被静止(立即,20分钟,1和2小时锻炼结束)轻快恒定负载高频运动。大约3毫升的血液来自一个肘前的静脉,与受试者躺在床上。血液样本中收集肝素化真空采血管管(美国正欲真空采血管)和血浆被离心分离(5702 r,埃普多夫,德国)在1000 g 10分钟4°C。样品被存储在多个整除−80°C到化验。样本解冻之前只有一次分析,从收集在两周内进行。gydF4y2Ba

2.6.1。硫代巴比土Acid-Reactive物质(TBARS)gydF4y2Ba

测量TBARS是一个行之有效的方法来检测脂质过氧化作用。我们使用TBARS分析工具包(开曼化学、美国),允许快速光度检测的硫代巴比土酸丙二醛(TBAMDA)加合物在532海里。样本由一个微型板块阅读器读取分光光度计(M200无限,Tecan(奥地利)。一个线性校准曲线计算从纯MDA-containing反应。所有样品重复测定和interassay变异系数范围是在由制造商(大约10%)表示。gydF4y2Ba

2.6.2。蛋白质羰基(PC)gydF4y2Ba

活性物种产生直接或间接通过脂质过氧化反应中间体也可能氧化修改蛋白质。氧化蛋白质的积累是通过活性羰基含量来衡量的。蛋白质羰基分析工具包(开曼化学、美国)被用来评估colorimetrically氧化蛋白质。样本在370 nm,标仪分光光度计(M200无限,Tecan(奥地利),详细描述的制造商。蛋白质氧化值获得归一化到总蛋白浓度在最后颗粒(吸光度读数在280海里),为了考虑蛋白质损失在洗涤步骤,建议在设备的用户手册。所有样品重复测定和interassay变异系数范围是在由制造商表示。gydF4y2Ba

2.7。数据分析gydF4y2Ba

EPR谱都是通过使用软件提供的标准就是力量(2.11版本,赢得EPR系统)。收集所有光谱采用相同的协议,如图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba以上报道。gydF4y2Ba

统计分析了使用GraphPad棱镜包(软件公司。圣地亚哥GraphPad棱镜5日,CA)。使用重复Shapiro-Wilks数据进行了分析gydF4y2BaWgydF4y2Ba测试。在Shapiro-WilkgydF4y2BaWgydF4y2Ba测试中,零假设是,样本来自正态分布。这个假设被拒绝,如果临界值gydF4y2BaPgydF4y2Ba为检验统计量gydF4y2BaWgydF4y2Ba小于0.05。实验数据是用单向方差分析Bonferroni相比其事后测试。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05统计显著性水平。所有的值被报告为意味着±标准差(SD)。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。锻炼gydF4y2Ba

运动性EPR可以显著增强gydF4y2Ba体外gydF4y2BaROS毛细管血液中形成。结果在图进行了总结gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。ROS动力学生产电子顺磁共振信号强度估计的水平变化在休息,继续教育和在20分钟后立即显示后的复苏。gydF4y2Ba

与静止数据相比,具有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)增加活性氧的生产结束时立即观察蜡烛,此后ROS生产回到preexercise条件。gydF4y2Ba

与此同时,可以观察到在图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba,TBARS浓度增加后立即运动,显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)20分钟运动后达到顶峰,之后返回到基线水平。gydF4y2Ba

结束后也立即PC浓度增加蜡烛,即使显示较慢的速度。水平成为统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)在20分钟后锻炼,然而所达到的最高价值观在1小时后的锻炼和拒绝之后(见图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.2。活性氧产量之间的相关性和氧化损伤的生物标志物gydF4y2Ba

表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba报告意味着等离子TBARS值和PC和毛细管血液的活性氧产量值在休息的时候。ROS生产之间的积极关系被发现在休息和等离子TBARS浓度(gydF4y2Ba= 0.74,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba)和血浆PC浓度(gydF4y2Ba= 0.60,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)。在high-resting活性氧产量水平与血浆浓度TBARS和PC。gydF4y2Ba

3.3。抗氧化供应gydF4y2Ba

补充抗氧化剂诱导EPR的形成可检测的变化gydF4y2Ba体外gydF4y2BaROS在毛细管血液,结果在图进行了总结gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。ROS的动力学生产电子顺磁共振信号强度估计的静止,立即R-thioctic酸在3小时后政府所示图和数据记录没有补充相应的间隔时间。活性氧产量水平,后续供应,增加了20分钟后,然后下降(40分钟),并保持在一个较低的水平对休息的价值,达到最低显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)水平补充后90分钟,然后回到基线。之间无显著差异观察实验基线记录和控制数据,没有补充。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

电子自旋共振/电子顺磁共振(ESR / EPR)光谱,毫无疑问,唯一直接的方式来检测和测量自由基。电子顺磁共振光谱学可以用来直接研究自由基在组织或组织分数(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),而spin-trapping代理可以用来稳定自由基,使它们更容易探测。gydF4y2Ba

然而,这项技术存在严重的局限性,尤其是缺乏敏感性在自由基的浓度通常在生物系统中找到。gydF4y2Ba

相对简单的血液撤军过程,更多侵入性组织活检相比,似乎是压倒性的主导因素在人类研究中使用的血液测量。gydF4y2Ba

在这种情况下,同样重要的是认识到自旋捕获的局限性,最终依赖于gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba物种形成的相对稳定的检测显然下游的主要反应途径,我们假设反映动态事件gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

然而,血液与所有器官和组织,因此,许多活性物种的可能来源。此外,大量的可氧化的基板已经出现在血液和携带大量的物质被认为是氧化应激的标记(例如,TBARS、蛋白质羰基)。这些标记的血药浓度的变化反映了相应变化感兴趣的组织(大多数时候骨骼肌)[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的事实,绝大多数有关人类研究测量使用血浆或血清氧化还原状态。这个选择可能是考虑到等离子体更好地反映组织后采用氧化还原状态与等离子体收集过程的缓解。然而,后一种选择,我们不能排除潜在文物所产生的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba化学在自旋探针的制备和孵化阶段或使用自旋的陷阱,尽管这种限制并非EPR独有样品制备,因为它具有解释意义的活性代谢物测量gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba,尤其是在人血浆。gydF4y2Ba

此外,由于经典的测试主要量化ROS水平在人血浆与红细胞,这些研究没有考虑循环细胞的作用。金斯伯格et al。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)提高了抗氧化剂进行量化的严重怀疑报告只在等离子体可以信任代表真正oxidant-scavenging能力。gydF4y2Ba

事实上红细胞可能发挥抗氧化和prooxidant活动。因为高铁浓度(~ 20毫米),红细胞(RBC)可以被视为一种“铁矿”,但矛盾的是,它也是血液抗氧化能力的主要组件之一,其中最抗细胞氧化应激。一个非常有效的细胞内减少机械,加上其高细胞密度使红细胞活性物种的一个有效的“沉”。可能不仅血液本身,更重要的是,整个有机体可以受益于红细胞清除能力。背面的红细胞抗氧化能力是其能力,反过来,活性物种的来源。红细胞内超氧化物自由基生成的缺氧或部分含氧血红蛋白,通常发现在低水平,可能在生理条件下,并不代表细胞的一大危害。同样,加拿大皇家银行的能力没有清除或生成摩尔浓度gydF4y2Ba^•gydF4y2Ba可以很容易地由高铁血红蛋白还原酶/ NADH /糖酵解系统。完全不同的可能情况,当红细胞穿过一个组织,一个强烈的活性氧的生产/氮物种发生。在这些条件下,红细胞可能积累氧化损伤,进而反映出其他组织和器官的氧化应激。出于这个原因,红细胞表面的氧化状态是潜在的候选人监控整个氧化应激状态。gydF4y2Ba

在运动过程中,由于活性物种生成血液和肌肉,它是合理的假设有一个双向运动肌肉的活性物种的血,反之亦然,直到达到平衡。同样可以适用于交流血液成分,即血浆,红细胞,白细胞,血小板gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,一旦遇到某些基本假设:活性物种与足够的半衰期有能力跨膜并生成活性物种在附近的隔间。gydF4y2Ba

基于这些考虑,针对减少侵袭性的方法,从而增加其临床及诊断的潜力,在此,我们调查的应用radical-probe方法测量外周血的氧化应激状态。而且新鲜,而不是冻结,样本用于EPR测量能够获得活性氧产量的估算,而不是一个层面上,假设这个过程让我们获得更精确和可靠的结果。gydF4y2Ba

未配对电子(s)携带物种,因此,EPR可见。然而ROS半衰期(超氧化物gydF4y2Ba]gydF4y2Ba(年代):10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba};一氧化氮(gydF4y2Ba]:在环境温度0,4)太短了如果EPR相比时间所以他们EPR-invisible规模。因此,物种必须“困”,转换为更稳定的自由基成为EPR检测。自旋捕获或探针分子,适合生物利用率,不啻是采用,因为它是一个分子的扩散在所有细胞车厢,包括线粒体(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。事实上,由于其独特的物理化学性质,不啻探针能够跨生物膜,从而检测活性氧在等离子体和细胞内的隔间。这样,EPR测量允许我们的活性氧产量达到一个相对定量测定人体血液样本。gydF4y2Ba

此外,由于其在激进的检测效率高,不啻探针可以使用在非常低的浓度(0.5 - 1毫米)旋转陷阱(10 - 50毫米)相比,最大限度地减少副作用的探针在生物样品。此外而言不啻迅速反应并允许激进的检测在一个化学反应,而其他的探测需要至少两个反应,这可能会导致文物(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

高重现性的测量实验被执行了两次同一主题的六个小时。实际上这个过程本身会使不可能重复相同的实验几次相同的血液样本。然而,收集到的数据表明,重复实验从一个休息的主题几乎重合的结果(见图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和红色的圆图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

大量证据已详尽的广泛运动与自由基的形成有关。戴维斯et al。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)首先建立运动后自由基形成详尽的身体活动通过展示提高电子顺磁共振信号(约gydF4y2BaggydF4y2Ba= 2.004)在肌肉和肝脏匀浆。其他的研究(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)也能够证明提高电子顺磁共振信号与运动。有很多报道,提供合理的支持认为锻炼会增加活性氧的生产,而线粒体是这些氧化剂的重要来源gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。其他来源的体育锻炼中氧化应激炎症反应介导的中性粒细胞(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),释放的过渡金属,如铁、支持芬顿化学与氢氧自由基的形成,生产者之间的相互作用和高铁血红蛋白脂质过氧化物(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),和黄嘌呤氧化酶的活性gydF4y2Ba25gydF4y2Ba可能在缺血-再灌注模型[]gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。可能会猜测,高强度体育锻炼会破坏脆弱的氧化剂和抗氧化剂之间的平衡防御和线粒体呼吸链和其他途径促进自由基的生成。如上所示,在调节血液是一个组织最重要的氧化还原状态变化出现在运动。gydF4y2Ba

用ESR谱,我们的研究清楚地展示了人类毛细管血液,一个短期的轻快恒定负载高频运动(CLE)沉重的强度,诱导氧化损伤自发现活性氧产量显著增加(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

其他地方的报道(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),职业运动员表现出快速增长在ROS开始锻炼。其次是逐步减少ROS的大小生产,20分钟后到达初始值。这是在协议与适应性反应的概念有氧训练使运动员酶随时间减少响应进一步显著激活,这增加了活性氧生成引起的体育锻炼了身体排毒ROS的能力。gydF4y2Ba

顺便说一句,我们想强调,本研究的主要目的是评估ROS生成的功效评估手术是采用一个迷你。就因为这个原因我们被迫使用动脉毛细管血液样本即使我们完全意识到动脉的血液,因为循环系统设计,非常远离肌肉是在运动过程中活性氧的主要来源。因此,我们认为,当使用一个系统性决心ROS水平肯定会发现低主要是因为产生ROS的一部分已经被血液缓冲本身。贝利et al。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)表明,在典型的EPR谱,积极venoarterial浓度gydF4y2BaαgydF4y2Ba苯基-gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba-butylnitrone (PBN)加合物,检测到的动脉和静脉循环,在中等强度锻炼。在同一篇论文中,作者报道EPR信号振幅的增加,根据运动强度的动脉和静脉的血液循环。然而发现ROS水平总是发现低动脉与静脉血样。确实值得注意的是,尽管采用适度的运动水平在目前的研究中,发现合适的检测方法显著差异;证明其可靠性甚至采用了实验条件下。另一方面,在采用收购协议下,ROS水平测量估计的限制在本研究结果检测和量化。gydF4y2Ba

活性氧和氮物种的增加产量停止锻炼后可能导致高浓度的过氧化脂质和蛋白质标记运动后(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。测量这些后者只在等离子体足以描述红细胞和肌肉氧化还原状态的改变,因为不同的隔间之间的良好的沟通gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。事实上目前的研究结果表明,脂质过氧化反应,以TBARS,运动后立即升高,直到20分钟(图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba)。许多研究已经提供了适应症大幅增加在有氧运动后血浆脂质过氧化水平gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。TBARS间隙的延迟,ROS更快生产动力学相比,在协议的观察Echtay et al。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)提出,由诱导脂质过氧化反应产品调节线粒体ROS生产蛋白质的表达,抑制线粒体gydF4y2Ba通过诱导分开生产。否则,清除氧化蛋白质从血液,据推测,一个耗时的过程,也考虑到氧化修饰的蛋白质可以通过活性氧的影响发生直接或间接通过接合lipoxidation终端产品。由于这些原因,蛋白质羰基含量仍长期升高(1 h)运动后(图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。其他研究通常报告后立即增加类似于我们的锻炼,而增加蛋白质羰基复苏的主要是0.5到6小时后消失(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。不同的生活反应的蛋白质羰基报道也可能是由于不同的强度和或多或少muscle-damaging运动模式用于研究和不同的参与者的身体健康工作(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

第二本研究的目的是检查是否测量血液氧化应激标记,目前在生物医学研究中,常见的做法是ROS-production的象征。虽然几乎所有的氧化应激生物标记已经批评了他们的可靠性(包括那些在当前研究中使用)gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba),很明显,在休息,所有更改表明氧化应激增加活性氧的生产(图直接相关gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。然而时间进程变化的氧化应激标志物延迟和更长的使用(数据gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba比ROS-production动力学(图)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),在动态条件下不可能相关。换句话说,它必须强调,良好的EPR和酶化验数据之间的相关性发现不代表这里的验证测试提出了EPR技术。原则,采用酶方法能够测定ROS生产带来的损伤,同时EPR是唯一的技术能力,通过使用合适的探针,量化中活性氧的生产本身。这些原因我们不能假设“先验”现有这些方法之间的关系我们不能绝对肯定,活性氧产量将同时产生损害。另一方面,本研究收集的数据似乎表明,绝大多数的相关的实践研究收集血液样本后立即或在其他一些早期运动后可能会导致不准确的推论(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

类似的考虑可能表达的分析补充抗氧化的影响。硫辛酸(gydF4y2BaαgydF4y2Ba研究采用-酸)。事实上这个分子是一种内源性的抗氧化,减少的形式,也就是说,dihydrolipoic酸,形成thiol-disulphide氧化还原系统gydF4y2Ba39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。而且这一部分也可以补充细胞内谷胱甘肽水平(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba),是一个重要的代数余子式的多酶复合物和丙酮酸脱氢酶。gydF4y2Ba

的确,在我们的研究中,R-thioctic酸的峰活动相应的时间延迟后补充(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),据其他作者(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。抗氧化剂可以定义为分子,防止自由基和细胞损伤是至关重要的维持最佳健康在动物和人类身上。在所有的生物系统,细胞需要足够水平的抗氧化防御系统,以避免过度生产的有害影响的ROS,所以预防相关的损害。确实过剩的活性氧产量可能发挥作用在许多疾病的病理生理学的条件,包括癌症、阿尔茨海默氏症和动脉粥样硬化。许多基础研究在人类研究和观察性流行病学研究表明,抗氧化剂可以防止氧化损伤。然而,这仍然是一个有争议的问题因为临床试验的结果不一致gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。确实有必要对大型多中心前瞻性随机对照试验评估的影响不同类型和剂量的抗氧化剂补充在选定的对象组。本研究中采用的方法论的方法可能是一个有效和实用的工具来解决问题在急性或慢性疾病。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

尽管医疗领域正越来越多地意识到自由基和氧化应激的重要性,筛查和监测尚未成为常规试验。方法在此提出允许可靠、快速和无创测量的瞬时浓度直接在人类外周血ROS。由于其简单性加上EPR谱的高敏感性和特异性,它比较积极与一些现有的方法已经成功地应用于测量人体血液的激进的物种。后准确地测试和确定最合适的试验过程,这种EPR决心甚至可以成为一个交钥匙,大量的常规和医疗诊断的自动化技术应用氧化应激的时间进程。而且这些发现似乎是有效的在休息和干预后都能改变一个生命系统的氧化还原状态。总之,ROS生产评估提出了EPR测量过程在毛细管血液似乎很适合提供一个可靠的指示关于自由radical-mediated变化出现在骨骼肌,心脏和肝脏。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢意大利运动医学联合会的科学委员会的财政支持。他们感激曲棍球瓦雷泽的所有运动员和教练团队和所有科目参加了实验。作者还要感谢曼博士Liberi博士和罗伯特·梅尔齐意大利力量Biospin为他们的技术支持。gydF4y2Ba

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