文摘
阿霉素(阿霉素)导致长期的心肌病,依赖于氧化应激和收缩性障碍。Tirapazamine (TP),一个实验性的辅助药物,通过red-ox转换与阿霉素相同。这项研究的目的是评估一个tirapazamine对氧化应激的影响,收缩蛋白水平,心肌细胞坏死的老鼠注射阿霉素。老鼠腹腔内注射每周6次tirapazamine两剂,5 (5 tp)和10毫克/公斤(10 tp),而阿霉素在剂量服用1.8毫克/公斤(阿霉素)。随后两组同时接受两种药物(5 tp +阿霉素和10 tp +阿霉素)。Tirapazamine减少心脏脂质过氧化和正常化RyR2蛋白质水平改变阿霉素。没有明显的谷胱甘肽(GSSG比率的变化,总谷胱甘肽,cTnI, AST, SERCA2水平之间的强力霉素和TP +阿霉素组。观察心肌细胞坏死组10 tp和tp +阿霉素。
1。介绍
阿霉素(阿霉素)是一种非常有效的抗肿瘤药物,但其使用剂量依赖性是有限的,不可逆转的,进步的心肌病,可能成为明显的年完成治疗后(1- - - - - -5]。毒性的主要pathomechanism与氧化应激和障碍的收缩蛋白的功能,这至少是部分相关的氧化应激(6- - - - - -10),因此我们认为任何代理造成red-ox平衡的变化可能会影响DOX-related cardiotoxic效果。
Tirapazamine (TP),专门为根除肿瘤细胞缺氧,这通常对古典收音机——和化疗11,12),通过与阿霉素相同的red-ox代谢变化。毒品有一个温和的抗肿瘤活性(13,14),但是已经证明在许多实验研究,结合经典的化疗和放疗可以提高抗癌效果比经典的化疗治疗(15- - - - - -17并因此给希望它作为辅助。
而且这两种药物TP和阿霉素通过类似red-ox-related代谢转换(图1)。这些代谢途径的TP在常氧条件下和阿霉素与单电子还原与自由基的形成,分别TP *或阿霉素* (18,19]。许多NADPH和NADH-dependent酶催化反应是常见的对阿霉素和TP,例如,NADPH细胞色素P450还原酶(16,20.,号21- - - - - -24),NADPH氧化酶(25- - - - - -27)、过氧化氢酶(28,29日]。在下一步中,TP *和阿霉素* reoxygenated nonradical母体化合物,同时形成一个超氧化物自由基()。这个循环的反应可能导致生产过剩的重复许多次,这可能是过氧化氢的来源和更多的有毒的氢氧自由基(10]。这些活性氧(ROS)负责氧化应激。
它已被证明,一些ROS-dependent cardiotoxic效果也观察阿霉素后管理(30.- - - - - -32]。其中有障碍的Ca2 +细胞内的平衡(33),线粒体功能障碍(34),心肌细胞死亡(35),和心脏重塑(36),最终导致收缩性障碍和心力衰竭(1,2,33]。Ca ROS-related障碍2 +细胞内平衡导致心脏收缩性干扰部分相关转录后的调控RyR2和SERCA2 [7,9,37- - - - - -39]。转录调控的蛋白质,由阿霉素,也被发现40,41]。
总结、强力霉素和TP参与相同类型的单电子还原生产过剩导致活性氧。根据ROS-dependent机制负责毒性,TP可能会改变心肌细胞对阿霉素的反应。因此,如果有一两种药物之间的相互作用,这可能是临床重要性。这项研究的目的是评估TP对氧化应激的影响,收缩蛋白水平,心肌细胞坏死的老鼠注射阿霉素。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
实验协议是经当地医科大学生命伦理委员会批准在卢布林。这项研究是在性发育成熟的男性进行白化大鼠的纯种CRL: (WI) WUBR应变,获得商业育种(Warsaw-Rembertow、波兰)。动物的初始体重160 - 195克都保持在稳定的条件下与12 h 22°C光/暗周期和给定的标准颗粒饲料LSM (AGROPOL、波兰)。老鼠腹腔内(i.p。)暴露于阿霉素(阿霉素;Ebewe、奥地利)和/或tirapazamine (TP;国际实验室,美国)。
动物被随机分为六组():阿霉素:阿霉素1.8毫克/公斤;5 tp: tirapazamine 5毫克/公斤;10 tp: tirapazamine 10毫克/公斤;5 tp +阿霉素:1.8毫克/公斤阿霉素和5毫克/公斤tirapazamine;10 tp +阿霉素:1.8毫克/公斤阿霉素和10毫克/公斤tirapazamine;控制了i.p。0.9%氯化钠溶液。阿霉素(1.8毫克/公斤)和tirapazamine剂量腹腔注射一周一次了六周的学习小组。一周后政府这两个化合物的研究终止。动物牺牲,血液和心脏解剖期间收集的样本。
20毫升的心被盐水然后切割室间和冠林。左心室的壁是放置在液氮和存储−75°C到次生化和分子分析。右心室壁样本在缓冲10%福尔马林固定和组织学检查处理。
2.2。测定血清生化参数
心脏cTnI(美国商业生活用品诊断)浓度在大鼠血清与ELISA评估两种类型的抗体被用于确定:抗体覆盖微量滴定板和二次抗体结合辣根过氧化物酶。酶促反应的产物是spectrophotometrically发现在450海里。
天冬氨酸转氨酶(AST)与商业活动是由动力学方法诊断包(Cormay、波兰)之间的氨基转移L-aspartate 2-oxoglutarate催化了AST和NADH吸光度下降为340 nm。
2.3。测定组织标记Red-Ox失衡
所有测量数据进行匀浆从~ 20毫克的冰冻的心脏样品使用提取每个商业设备的制造商提供的缓冲区。
在心脏匀浆脂质过氧化的评价是基于丙二醛和4-hydroxyalkenals浓度(MDA + 4)。商业为MDA工具包生物技术法律外包- 586 + 4有(Oxis美国研究)是用于评估。方法的概念是基于MDA和4有N-methyl-2-phenylindol之间的反应。N-methyl-2-phenylindole和甲醇混合后上层清液从均质化,获得的甲磺酸加和所有试剂都放置在温度45°C为60分钟。接下来,包含产品的解决方案是离心机和上层清液被转移到使用的塑胶板光谱光度测量的读者PowerWave XS (BioTek美国)在586海里。随后,这个过程是根据生产进行描述和MDA的浓度+ 4 hne测试样品中校准曲线的计算公式。获得日期计算考虑的建议中所描述的过程。获得的研究结果表示在nmol / g心脏样本。
可比NADPH和NADH浓度测定的分光光度法测定中所描述的商业工具(美国生物视觉)。心脏匀浆是孵化60°C为了分解辅酶ii粒子。最终读数是使用PowerWave XS微型板块分光光度计(美国Bio-Tek)在450海里。
谷胱甘肽测定进行了使用商业套装谷胱甘肽(gssg - 412(美国OxisResearch)。冰冻的心脏(~ 20毫克)样品中均质提取缓冲由制造商提供。总谷胱甘肽(谷胱甘肽t;谷胱甘肽+ GSSG)决定在酶反应,在Ellman试剂(5、5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic酸)与谷胱甘肽反应形成颜色产品的最大吸光度在412海里。谷胱甘肽的浓度和GSSG谷胱甘肽(GSSG比率进行评估后测量反应的速度和建立校准曲线。谷胱甘肽的浓度和GSSG决定基于校准曲线所描述的公式和。的基础上获得日期GSH / GSSG比率计算。
2.4。测定DNA氧化损伤
商业工具(Fermentas,立陶宛)被用于心脏DNA的隔离根据制造商手册。冷冻组织在液氮粉碎,悬浮在TRIS-EDTA (TE)缓冲区。然后,样本在裂解缓冲孵化65°C。释放DNA提取使用氯仿然后沉淀沉淀的因素。
DNA氧化损伤心肌的评估通过测量的数量基本网站所谓(美联社)与商业工具(Dojindo、日本)。孤立的DNA标记与ARP试剂,它可以识别醛基的开环美联社网站,可以结合生物素。然后,biotin-avidin-specific连接和辣根过氧化物酶在650 nm用于比色检测。
2.5。SERCA2和RyR2蛋白质水平的决心
组织样本在20毫米均质磷酸盐缓冲剂(pH值7.4;比例:0.5 g的组织和2厘米3蛋白酶抑制剂的缓冲区)鸡尾酒(美国Sigma-Aldrich)有聚四氟乙烯的均质器活塞在4000 rpm(5分钟)。然后,匀浆在离心机在4°C 20分钟14000 rpm,用来量化SERCA2和RyR2蛋白免疫印迹。五个随机选择的样本来自不同的随机选择的动物在每个学习小组。20μ克蛋白质是装载在聚丙烯酰胺凝胶,和一个50分钟的电泳分离在XCellSureLock减少条件下执行器(美国英杰公司)在恒定电压为200 V。分离后,凝胶和硝化纤维膜放在两层滤纸之间,把两个电极之间的伊势亚二世污点模块electrotransfer装置(美国表达载体)。转移进行了60分钟的恒定电压30 V。墨迹是使用西方的微风中显色检测工具(美国表达载体)。非特异性抗体结合网站被封锁,细胞膜是孵化的解决方案主要抗体:老鼠单克隆抗体鼠SERCA2蛋白(克隆2 a7-a1;美国亲和力BioReagents)或对老鼠RyR2蛋白(克隆34 c;美国亲和力BioReagents)。洗后,膜与二次孵化抗体结合碱性磷酸酶。最后一步是马克的网站与抗原反应的反应碱性磷酸酶和发色体。乐队是量化的相对强度使用一维图像分析软件(美国柯达),和所有的值都是规范化的各自beta-actin信号强度作为加载控制(美国Abcam)。
2.6。幻灯片的准备组织学评价
4μm组织学幻灯片石蜡块常规处理和苏木精和伊红染色())。Selye的方法也用于可视化心肌细胞坏死。
2.7。统计分析
获得的数据被表示为平均数±标准差和由STATISTICA 5.0统计分析软件。连续数据比较实验人群使用Kolmogorov-Smirnov测试。统计学意义的差异控制和学习小组是由学生的评估t以及或UMann-Whitney测试。群体是由单向方差分析比较。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。氧化应激的标记
MDA水平+ 4 hne显著高于控制(表相比,所有的学习小组1)。然而他们在10 tp +阿霉素组相比明显降低阿霉素。以来的改变脂质过氧化的标志是明显的TP组接受高剂量的阿霉素,标记的DNA氧化损伤测量在这些组:氧化DNA损伤水平高在接受阿霉素组和10 TP +阿霉素控制相比,但这两组之间没有显著差异(图5)。NADPH水平(表1)在10 tp组明显高于+阿霉素控制和强力霉素组相比,虽然总谷胱甘肽水平明显升高只有阿霉素治疗组相比,控制。谷胱甘肽(GSSG率升高比控制在各个学习小组。然而,阿霉素相比没有明显差异。NADH水平显著下降5 tp组相比,控制,但增加10 tp +阿霉素相比,阿霉素组。在一起,说阿霉素和TP标记参与氧化应激水平增加。然而,在所有这些测试参数、强力霉素和10之间的统计学意义tp +阿霉素是唯一观察到指脂质过氧化标记。
3.2。光学显微镜评估心肌
心的形态学评价阿霉素组没有透露坏死的迹象,无论是在他走时还是Selye染色,具体为坏死。相反,心肌细胞坏死的迹象中发现了10个tp和10个tp +阿霉素和确认上述染色(数字2(一个)和2 (b))。低强度坏死病灶附近观察炎性浸润。
(一)
(b)
3.3。等离子体浓度cTnI和AST等离子体活动
cTnI水平显著高于组10 tp和tp +阿霉素控制相比,这是伴随着大鼠心肌形态学的变化(表2)。AST等离子体活动无关紧要的变化被发现在所有学习小组。
3.4。蛋白质SERCA2 RyR2
SERCA2蛋白质含量低剂量管理后TP与阿霉素明显高于对控制和强力霉素组(图3)。阿霉素降低和增加5 tp RYR2蛋白质水平比较控制(图4)。5 tp +阿霉素组RYR2的水平明显高于与强力霉素组,但控制相比没有区别。在一起,阿霉素组之间的比较和TP +阿霉素已经表明,低剂量的TP RyR2的增加和增加剂量的TP SERCA2接收阿霉素浓度的老鼠。
4所示。讨论
强调上面,TP的新陈代谢在常氧条件下运行通过同样的途径阿霉素cardiotoxic-related机制(16,19,20.,25,26,28,29日]。假设共同服用这两种药物导致的交互指red-ox地位和心肌细胞细胞毒性。由于这些原因研究的目的是评估氧化应激和在大鼠心肌细胞坏死同时管理TP和强力霉素。此外,由于强力霉素对RyR2和SERCA2产生不利的影响7,9,37- - - - - -39)和收缩的关键分子,这些蛋白质也被评估的内容。
当前研究的主要结果表明TP对氧化应激的保护作用和RyR2蛋白质水平被强力霉素。然而,一个累加效应指SERCA2蛋白质水平被发现在低剂量阿霉素的TP了。没有添加剂对心肌细胞坏死的影响当老鼠服用这两种药物在同一时间。
中突出显示部分1,NADPH用于单电子还原的研究药物引起活性氧生成(10,25- - - - - -27]。矛盾的是,另一方面,NADPH淬火ROS的谷胱甘肽是一个不可或缺的因素再生机制。根据这一事实NADPH水平可能会下降。然而,没有改变NADPH在任何团体接受阿霉素或TP浓度。此外,显著增加被发现在10 tp +阿霉素比较控制和强力霉素。这种观察到的效应可能是由于适应机制使NADPH的生产过剩,例如,G6PDH和苹果酸酶的主要细胞来源的因素,对氧化应激的反应。NADPH-dependent谷胱甘肽(GSSG比率较高不仅在10 tp +阿霉素,双重的增加和控制被发现在每个测试组。NADPH的正常水平,同时提高谷胱甘肽(GSSG比其他组表明谷胱甘肽的生理NADPH-dependent再生能力是非常有效的。问题是为什么谷胱甘肽(GSSG比例升高。据透露,MDA + 4 hne浓度也高于每个测试组,和,因此,谷胱甘肽(GSSG比率甚至在更高水平不足以熄灭脂质过氧化反应和氧化压力仍然存在甚至一周后最终的剂量。
此外,它已经表明,脂质过氧化作用的心只老鼠与阿霉素管理控制相比高出四倍。政府与TP在动物用强力霉素治疗降低脂质过氧化水平,这表明一个保护性TP的影响。之前的大多数研究表明氧化应激症状后短时间内单剂管理或持续剂量阿霉素的应用。知道阿霉素的red-ox新陈代谢,可以假设在药物仍存在于组织,生产活性氧和氧化应激,在多项研究证明(23,42,43]。存在氧化应激后一周的最后剂量阿霉素,因此从生物药物已被删除后,与另一项研究是一致的(44)和基于氧化应激假说解释迟到的阿霉素毒性(45,46]。根据这个假设氧化损伤,形成于阿霉素的存在,是“记录”,多年后可能导致明显的心脏衰竭。ROS,形成于阿霉素的存在,导致线粒体DNA (mtDNA)氧化损伤(47- - - - - -49]。这些变化可以导致合成所必需的蛋白质干扰线粒体功能,尤其是复合物的电子传递链代谢途径(50]。结果,这导致了生产过剩的活性氧与生理条件。线粒体ROS水平的增加会导致线粒体DNA损伤和这样的循环事件可能重演直到最后线粒体的生产力是有限的(51),可能后续严重影响组织的代谢率高。最后,一个人可以观察收缩性干扰和充血性心力衰竭。值得强调的是,线粒体是特别容易受到氧化应激的影响(如前所述)(51]。
有充分的证据证明毒性损伤线粒体形态(阿霉素引起的活动52],生化[10,53,54),和分子水平(45,55,56]。此外,它还指出,TP导致线粒体功能障碍(18]。与上述关系,NADH的水平,电子传递链的主要基质,评估。NADH水平没有显著差异的任何组织管理阿霉素相比,控制(阿霉素、5 tp +阿霉素10 tp +阿霉素);然而,显著增加NADH水平在10 tp +阿霉素组相比,阿霉素。因此,该集团表示保护TP (10 TP +阿霉素)的影响同时也更高的NADH的水平。这是一个讨论的问题如果增加水平的NADH的线粒体核苷酸本身的失败或升级合成。看来,第一个解释是更有可能因为NADH合成是基于机会的脂肪酸和克雷布斯循环。这两种代谢途径受阻阿霉素:机会由于障碍的长链脂肪酸运输(57)和克雷布斯循环通过阻断顺乌头酸酶超氧化物形成的阿霉素(10]。因此,似乎更高浓度的NADH观察10 tp组+阿霉素可能累积的结果不利的行为这两个因素对电子传递链。考虑到减轻高剂量的TP对脂质过氧化的影响与强力霉素治疗大鼠的心,DNA氧化损伤(线粒体和核的总和)也被评估在这些组。结果证实氧化应激的存在在所有评价组;然而,没有研究化合物间的相互作用。
还应该强调pathomechanism心肌的收缩性障碍是多方向的。氧化应激过程中起着重要的作用,在本研究评估基于MDA和oxDNA水平,引起了两种化合物。氧化应激通过累积和线粒体功能障碍(随着时间的推移不断升级)导致ATP耗竭54,58)必要的过程中心肌纤维收缩。也可能依据病理变化在钙调节蛋白RyR2 SERCA2。最后,氧化应激可导致心肌坏死,重塑,收缩性障碍。在目前的研究已经证明,阿霉素多半RyR2蛋白质水平降低。相比之下,后管理5 tp RyR2水平控制在2.5倍。后增加TP (10 TP) RyR2的剂量水平高于控制大约是30%,但差异无统计学意义。TP引起氧化应激,同时增加RyR2的水平,这表明氧化应激并不是一个因素限制RyR2合成尽管扰乱这种蛋白质的功能。因此,减少RyR2水平观察阿霉素组可能不导致氧化应激。也许是希望政府有相反的两种化合物的行为不会引起变化而控制。本文整合了我们的观察两组5 tp +阿霉素和10 tp +阿霉素。 Moreover, RyR2 level in groups administered DOX and TP was significantly higher when compared to group given DOX only, which suggests protective influence of TP on regulation of RyR2 level in hearts of animals treated with DOX. A RyR2 concentration decrease was also observed in other studies [40,41包括我们之前的研究[59)的累积剂量阿霉素15毫克/公斤(周),三周后获得的样本药物管理局的终止。之间有互动5 tp和阿霉素属于SERCA2水平SERCA2水平明显高于5 tp +阿霉素组相比,阿霉素。似乎这种变化可能对心肌细胞有负面影响。这些假设是由伯克et al。60),这表明显著降低小鼠的生存因素SERCA2基因的超表达用强力霉素治疗以及更大程度的组织学损害而同基因的控制。之间没有交互TP和阿霉素与心肌细胞坏死。观察形态学特征的坏死10 TP +阿霉素组应该被理解为TP坏死的行动,因为特征相似组10 TP和TP +阿霉素。类比推理,一个人可以解释cTnI浓度,证实的存在在10 tp +阿霉素组心肌细胞坏死。
总之,研究揭示,运动员之间的交互存在剂量依赖的相关性TP和阿霉素与心肌氧化应激和浓度的蛋白质参与心肌收缩。开放的问题是如果观察到的改变是持久或者长时间后的反向变化。出于这个原因,进一步研究不同的时间范围后,最后一个剂量的药物都需要评估的影响,相互作用对心脏的收缩功能。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。