吡格列酮联合治疗与洛沙坦和加法减少肾脏氧化和Nitrative应力引起的慢性高脂肪,蔗糖和钠的摄入

文摘

我们最近表明,与洛沙坦和吡格列酮联合治疗提供协同效应与单一疗法在改善病变肾脏结构和功能的Sprague-Dawley老鼠喂高脂肪、高钠饮食和20%蔗糖的解决方案。本研究旨在探讨底层机制提供的添加剂renoprotection联合治疗。洛沙坦,吡格列酮,他们的结合是口头管理8周。肾丙二醛水平的增加和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚基的表达硝基酪氨酸和减少总超氧化物歧化酶活性和铜、zinc-superoxide歧化酶表达式是实实在在的证据存在的氧化和nitrative应激模型大鼠的肾脏。与这两种药物治疗,单独和组合,改善这些异常变化。联合治疗显示出协同效应在减少丙二醛水平,几乎和硝基酪氨酸表达,与单药治疗相比正常水平。所有这些结果表明,提供的添加剂renoprotection联合治疗可能归因于进一步减少氧化和nitrative压力。

1。介绍

高脂肪、蔗糖和食盐的摄入量,一个既定的习惯在工业化国家中,对人类健康是一个重要的危险因素。事实上,长期食用高脂肪,高蔗糖饮食诱导肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常和高血压(1]。然而,高脂肪和高蔗糖饮食是否能导致肾损伤仍存在争议(2,3]。除了这场辩论,临床和实验研究表明,慢性高钠摄入量引起蛋白尿和肾纤维化和疾病进展(4- - - - - -6]。事实上,我们实验室已经证明Sprague-Dawley (SD)老鼠喂食高脂肪,高钠饮食(HFS)和20%蔗糖溶液为16周可以开发相对肾损伤的早期阶段,如蛋白尿、局灶性节段性肾小球硬化症(7]。

此外,我们表明,联合治疗与洛沙坦(血管紧张素ⅱ受体阻滞剂,ARB)、吡格列酮(过氧物酶体proliferator-activated受体-γ,PPARγ受体激动剂)提供协同作用改善肾脏结构和功能的损伤7]。其他临床和实验研究也有报道,PPARγ受体激动剂提高了renoprotective ARB的影响糖尿病肾病和非糖尿病患者肾脏疾病(8- - - - - -10]。然而,据我们所知,底层机制提供的添加剂renoprotection联合治疗仍不清楚。

氧化和nitrative压力在内皮功能障碍的发病机制中起着重要作用,炎症,和肾脏功能障碍(11- - - - - -13]。到目前为止,消费高钠或高脂肪、高蔗糖饮食已被证实能导致氧化和/或nitrative压力在正常大鼠的肾14,15]。多项研究表明,洛沙坦和吡格列酮改善糖尿病肾病的这些应力状态和非糖尿病患者肾脏疾病(16- - - - - -19]。因此,本研究旨在调查与洛沙坦和吡格列酮联合治疗是否可以提供一个协同效应在改善肾脏氧化和nitrative压力与不正常的饮食喂养的老鼠。

2。材料和方法

2.1。化学物质

洛沙坦是由默沙东制药有限公司(杭州)。吡格列酮是购自武田制药有限公司(天津)。总蛋白、丙二醛(MDA)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力测定包购自建成生物技术研究所(中国南京)。多克隆兔anti-MDA抗体购自Abcam(猫没有。:ab6463,剑桥,英国)。多克隆兔anticopper zinc-superoxide歧化酶(铜/ Zn-SOD,猫没有。:BA1401)和单克隆鼠标反β肌动蛋白(猫没有。:BM0627) antibodies were purchased from Boster Biotechnology Inc. (Wuhan, China). Polyclonal rabbit antinicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase subunit(猫没有。:sc-14015) and monoclonal mouse anti-nitrotyrosine (Cat No.: sc-32731) antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, USA). Glucose assay kit was purchased from Rongsheng Biotechnology Co. (Shanghai, China). Albumin and insulin radioimmunoassay kit was purchased from North Institute of Biotechnology (Beijing, China).

2.2。动物和饮食

雄性SD大鼠(g,来自浙江省实验动物中心)是维护受控条件下的光,温度和湿度。调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订)。高脂肪、高钠饮食(HFS)制备所述在我们之前的研究7),由4%的氯化钠,21.1%的蛋白质,20%的脂肪(含15%猪油和1%胆固醇),33%的碳水化合物,维生素和矿物质混合标准。

2.3。实验程序

1周住宿新环境后,老鼠被喂食HFS中饮食和20%蔗糖溶液为16周除了对照组(C,,正常的饮食和水),即持续的研究。8周后接收不正常饮食,老鼠(对照组除外)被随机分配给四组,即模型组()、洛沙坦治疗组(20毫克/公斤,)、吡格列酮治疗组(10毫克/公斤,),联合治疗组(收到洛沙坦+吡格列酮在上述剂量,)。的剂量洛沙坦(20.,21和吡格列酮19,22)是基于以前的研究。根据先前的研究治疗的持续时间被选中(19,20.]。药物被填喂法9:00-10:00点口头管理日常在接下来的8周。治疗组收到同等体积的蒸馏水。

在整个实验期间,每周测量体重(BW)。老鼠被置于代谢笼收集24小时尿液。在研究结束时,老鼠禁食过夜和戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。血液样本来自腹主动脉。肾脏被移除,无荚膜的和立即重。一个肾是冻结在−80°C到加工,另一个是由浸在10%甲醛固定后显微镜检查。

2.4。生物化学分析

肾MDA含量测定采用硫代巴比土酸法如我们之前所述研究[11]。简而言之,样本用硫代巴比土酸治疗,MDA生成一个红色的存在产品吸收最大值532海里。MDA的浓度是通过比较产生的吸光度,计算控制标准1,1,3,3-tetraethoxypropane表示为nmol /毫克的蛋白质。肾脏T-SOD活动采用黄嘌呤氧化酶法测定如前所述[23]。SOD的数量,导致50%抑制超氧化物阴离子单位生产的蛋白质在反应1毫升容量被定义为一个单位(U),抑制率是决定通过测量吸光度在550海里。结果表示为U /毫克的蛋白质。血清胰岛素和尿白蛋白测定使用Gamma-counter。血清葡萄糖是由生物化学分析仪。内稳态模型评估胰岛素敏感性指数(HOMA-ISI)被计算为1 /(葡萄糖血清胰岛素)。胰岛素水平是分析前的自然对数转换24]。

2.5。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)分析

总RNA提取大鼠肾脏使用试剂盒试剂(美国Gibco)。RNA (2μg)是反向转录。用于扩增引物的序列如下:(165个基点),感觉:5′-ATGATGGGACCCGTGATG-3′和反义:5′-GGGACTGCCCGTGAAGAT-3′。铜/ Zn-SOD(387个基点),意义:5′-GCAGAAGGCAAGCGGTGAAC-3′和反义:5′-GCAGAAGGCAAGCGGTGAAC-3′。GAPDH(339个基点),感觉:5′-TCCCAGAGCTGACGGGAAGCTCACTG-3′和反义:5′-TGGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTCCA-3′。

进行PCR反应的最后一卷50μ包含互补脱氧核糖核酸(2 Lμ(200 L)核苷酸组合μ1.25 mol / L), Taq DNA聚合酶(U),正向和反向引物(0.4μmol / L,职责),10PCR缓冲(5μ(36.5 L)和DEPC水μL)。PCR条件如下:最初的变性在95°C 3分钟完成,其次是变性在94°C 30年代,30年代的退火53°C58°C铜/ Zn-SOD GAPDH 60°C, 1分钟在72°C扩展。不同数量的PCR循环进行了定义范围的周期数是线性相关的扩增产物菌进行基因的数量。最优数量的周期是28 GAPDH, 30立方/ Zn-SOD, 32。GAPDH是作为内部控制。基因表达水平进行评估使用图像J软件和规范化的光学密度GAPDH在每个样本。

2.6。免疫印迹分析

蛋白质(40μg)肾匀浆相隔十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质被electrophoretically硝化纤维膜,然后孵化主要抗体(:),铜/ Zn-SOD (:),β肌动蛋白(:一夜之间)和记者二级peroxidase-conjugated anti-rabbit或鼠标抗体。这些墨迹使用增强化学发光可视化工具包(皮尔斯,罗克福德,IL)和评估微使用图像软件。乐队的强度是标准化的β肌动蛋白。

2.7。免疫组织化学

部分(5μdeparaffinized米厚)石蜡包埋的肾组织有三个变化二甲苯和水化的一系列酒精分级。内源性过氧化物酶活动消除3%治疗H₂O₂10分钟。冲洗后磷酸盐(PBS;pH值7.4),5% BSA的部分被封锁在室温下20分钟。主anti-MDA (:)和antinitrotyrosine (:)抗体应用于部分,一夜之间在4°C。在负控制研究中,抗体被PBS代替,相同浓度的多发地鼠标或兔免疫球蛋白G(免疫球蛋白),分别。与PBS冲洗后,肾脏部分与生物素化的第二抗体孵化20分钟在37°C。然后他们被孵化与链霉亲和素生物素复杂(南非广播公司设备,博士德生物技术有限公司,中国)为一个额外的30分钟37°C和冲洗一次。先后,部分是沉浸在一个解决方案3,3-diaminobenzidine和0.02% H₂O₂。最后,部分与苏木精复染色,脱水和安装。幻灯片是在显微镜下检查和拍摄。

半定量的分析,部分使用Image-Pro + 6.0软件进行评估(美国媒体控制论)。平均光密度(集成光密度的结果除以检测区域)的总和计算任意区域,每个样品测量10个字段(疣状MDA和硝基酪氨酸测定肾小球和皮质区域职责)。数据池来计算平均值和统计分析应用于比较不同实验结果的组。

2.8。统计分析

数据表示为的意思SD。对于统计分析,我们使用单向方差分析Newman-Keuls测试紧随其后。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。生理指标

如表所示1和图1在所有组基线,BW相似。后大鼠不断美联储HFS中饮食和20%蔗糖溶液在16周,BW和BW模型组中获得的价值显著增加和药物治疗没有显著影响。模型组的血清胰岛素水平显著增加(和对照组)。HOMA-ISI显然降低了模型组与对照组相比,()。治疗与吡格列酮单独和组合洛沙坦和吡格列酮导致HOMA-ISI增加和降低胰岛素水平相似的水平(和模型组)。此外,没有明显差异在葡萄糖浓度在所有实验团体(数据未显示)。

如表所示1不正常饮食大鼠显示,增加水平的24小时尿白蛋白排泄(UAE)但不尿蛋白排泄(数据没有显示)。这些研究结果表明,该模型大鼠受到相对早期肾损伤。洛沙坦,吡格列酮,其组合减毒阿联酋的增加(和模型组)。治疗相结合产生了进一步减少阿联酋比要么单独药物管理局(与模型组,和对照组)。

3.2。肾MDA含量和表达式

如图2(一个)MDA的温和的阳性染色,观察脂质过氧化作用的标志,在一些控制大鼠的肾小球。适度积极的近端小管细胞的染色观察。在模型大鼠的肾脏,增加免疫染色的肾小球(图2 (b)),而控制老鼠。不正常的饮食也一致的增加肾引起的MDA含量模型大鼠(图3)。洛沙坦治疗,吡格列酮,其组合降低MDA含量和表达式(和模型组)。联合治疗比政府的药物导致进一步减少孤独数据2 (c)- - - - - -2 (f)和3 。

3.3。肾T-SOD活动

如图4,T-SOD活动降低了模型组与对照组相比)。洛沙坦治疗,吡格列酮,它们的组合导致T-SOD活动增加类似的水平(与模型组,和对照组)。

3.4。硝基酪氨酸的表达

如图5(一个)在对照组,硝基酪氨酸表达式被认为在一些肾皮质的近端和远端小管。模型大鼠表现出显著upregulation硝基酪氨酸immunoexpression肾小球的皮质近端和远端小管(图5 (b))。洛沙坦和吡格列酮治疗显著降低肾硝基酪氨酸表达式(与模型组,和对照组)。此外,联合治疗导致协同效应在减少肾硝基酪氨酸表达式几乎正常水平相比单一疗法(与模型组,与对照组数据5 (c)- - - - - -5 (f))。

3.5。肾脏的表达

rt - pcr(图6(一))和免疫印迹(图6 (b))分析表明,信使rna和蛋白质的表达水平在模型大鼠的肾显著增加。洛沙坦和吡格列酮减少肾脏的过度在转录和翻译水平(与模型组,和对照组)。然而,联合治疗进一步减少的表达几乎正常水平相比之下,单一疗法(与模型组,和对照组)。

3.6。肾铜/ Zn-SOD的表情

rt - pcr(图7(一))和免疫印迹(图7 (b))分析表明,铜/ Zn-SOD表达式在模型组降低(和对照组)。洛沙坦治疗,吡格列酮,它们的组合显然增加了铜/ Zn-SOD的mRNA和蛋白表达在肾相似的水平(与模型组,和对照组)。

4所示。讨论

在我们之前的研究7),我们表明,开发的SD大鼠腹部肥胖,血脂异常和高血压饮食接到HFS和20%蔗糖16周的解决方案。与吡格列酮治疗,结合洛沙坦和吡格列酮改善腹部肥胖和血脂异常。联合治疗提供协同效应在减少收缩血压升高、改善肾损伤。然而,这些并不影响与改进的肾血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达。因此,我们只能得出这样的结论:部分renoprotective影响血压的依赖。本研究旨在进一步探索底层机制提供的添加剂renoprotection联合治疗。

本研究的主要结论,从(1)肾损伤在HFS中饮食和20%蔗糖溶液诱导模型老鼠联系在一起,至少在一定程度上,由于氧化和nitrative压力。MDA水平,增加(NADPH氧化酶的胞质单元)和硝基酪氨酸表达式以及减少T-SOD活动和铜/ Zn-SOD表达在肾脏有形证据存在的氧化和nitrative压力;(2)上述这些异常变化是提高了与这两种药物治疗,单独和组合;(3)联合治疗是降低MDA水平,,比单一疗法和硝基酪氨酸表达。

提高水平的活性氧(ROS),导致氧化应激状态,已被证明存在于老鼠高钠或高脂肪,高蔗糖饮食(14,15]。过量的活性氧,如果不是由内源性抗氧化系统,控制会导致脂质过氧化作用。饮食在我们的研究中,HFS和蔗糖溶液诱发明显的氧化应激模型大鼠,肾直接证明明显增加MDA(脂质过氧化作用的最终产品)内容和表达。洛沙坦和吡格列酮治疗8周减少MDA的水平相似。有趣的是,联合治疗取得了进一步降低MDA水平与政府的药物。这些数据表明,提供的协同效应提高肾损伤联合治疗可能会认为,至少在某种程度上,进一步减少氧化应激。

氧化应激可以导致过量的活性氧产量和/或抗氧化能力不足。NADPH氧化酶最近在几个细胞系和特征显示超氧化物阴离子的主要来源(的主要物种(ROS)肾脏和心血管组织25- - - - - -27]。铜/ Zn-SOD氧气防御机制中起着重要的作用。在目前的研究中,我们发现显著增加表达,减少铜/ Zn-SOD表达,降低模型大鼠的肾脏T-SOD活动。Satoh et al。16]说明洛沙坦变弱和实验性糖尿病肾病大鼠肾小球ROS生产。De Cavanagh et al。17)发现,洛沙坦显著防止肾动脉salt-loaded自发高血压大鼠SOD活性下降。此外,Toblli et al。18)报道,吡格列酮可以减少肥胖Zucker鼠肾MDA含量。杨et al。19)表明,吡格列酮增加铜/ Zn-SOD和减少NADPH氧化酶蛋白表达在老鼠体内进步的肾损伤。符合这些最近的报告,在我们的实验条件,洛沙坦和吡格列酮明显减少肾表达,增加了铜/ Zn-SOD表达式,和增强T-SOD活动。有趣的是,联合治疗显示了添加剂对肾功能的影响表达式。综上所述,联合治疗提供了一个协同效应在减少肾脏氧化应激通过NADPH氧化酶的差别进一步对这些基因的表达。

值得注意的是,过量的活性氧产量会导致nitrative压力。与一氧化氮生成过氧亚硝基反应热切地,与酪氨酸残基反应生成硝基酪氨酸和经常被用作nitrative压力稳定的标志(28]。在目前的研究中,增加肾硝基酪氨酸nitrative应力表达式是存在的直接证据。因此,氧化和nitrative应力发生在同一时间在我们的模型大鼠的肾脏。洛沙坦和吡格列酮减少硝基酪氨酸表达类似的水平。有趣的是,联合治疗肾硝基酪氨酸表达式比单药治疗。这些结果表明,提供的添加剂renoprotection联合治疗的另一个原因是由于nitrative压力的进一步减少。此外,这种协同antinitrative效应也成为可能的差别通过进一步对这些NADPH氧化酶表达。

缩写

MDA:	丙二醛
T-SOD:	总超氧化物歧化酶
铜/ Zn-SOD:	铜、zinc-superoxide歧化酶
NADPH:	烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
ROS:	活性氧物种。

确认

这项研究受到了赠款项目的教育部安徽省自然科学基金(没有。KJ2010B466)。作者深深地欣赏Ji-shou侯教授的有用的援助在修改本文。

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