文摘

淀粉样蛋白-β(一个β)病理与线粒体功能障碍伴随着能源降低和升高活性氧簇(ROS)的生产。单体和低聚物β已发现线粒体内,他们积累时间的方式证明了在转基因小鼠和阿尔茨海默病(AD)的大脑。我们假设细胞外的内化β总量是线粒体损伤的主要原因在这里,我们报告后注入的纤维β海马体,有严重的轴突损伤是伴随着的入口β进入细胞。此后,一个β出现在线粒体与离子梯度的改变内在的线粒体膜。这种效果是伴随着亚细胞结构的破坏,氧化应激,显著减少呼吸控制比例和水解atp酶的活性。口头管理褪黑素减少氧化应激,提高了线粒体呼吸控制比例,改善能量不平衡。

1。介绍

胞内积累高度amyloidogenic 1-42残渣淀粉样蛋白-β肽( )可能造成,(a)下降β退化由于ubiquitin-proteasome系统的破坏,(b)增加细胞内生成β或(c)的吸收增加β从外部源(1,2]。的内化 肽的主要神经元与脂质raft-mediated内吞作用[2]。这些脂质筏是动态程序集内的蛋白质和脂质自由浮动liquid-disordered双层细胞膜中胆固醇和鞘磷脂(扮演关键的角色3]。相反地,胆固醇和鞘磷脂代谢密切相关β(4]。事实上,有线索表明β水平的变化对血液中的胆固醇含量,而阿尔茨海默病(AD)的临床进展通常与高胆固醇血症和高胆固醇在大脑中5,6]。

越来越多的另一个因素相关性作为神经损害是氧化应激的机制,这是一个标志的特点β全身的脑损伤在广告7),广告转基因小鼠(8),以及在体外和其他在活的有机体内模型的神经退行性条件(9,10]。线粒体功能异常和相关的氧化剂应激与许多复杂疾病和衰老11,12等),协会已基本建立了在体外测定线粒体自由基的生产过剩。膜相关氧化压力反过来又与脂质改变(13),和海马神经元的接触β,在体外,引发氧化损伤细胞膜,伴随着积累sphingomyelin-derived神经酰胺物种和胆固醇(14]。事实上,通过阻止神经酰胺和胆固醇的积累可以保护神经元免受死亡引起的β;这是一种抗氧化剂α生育酚或耗尽海马神经元的鞘磷脂含量的抑制剂丝氨酸palmitoyltransferase,鞘脂类的病原反应一步合成(15]。焦脱髓鞘瘠薄的皮层灰质以及探明一直在观察AD患者和相关转基因老鼠β斑块核心(16]。因此,它是可能的髓磷脂的分解促进有毒的累积β原纤维,最终积聚在大脑(17]。

有证据表明,另一方面,淀粉样前体蛋白(APP)和一个β积聚在线粒体膜,观察到在后期广告或转基因小鼠的大脑部分(18- - - - - -20.]。一个β细胞应用于人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞被发现内化并被线粒体利用运输车外膜(汤姆)[21]。大部分的进口 出现内膜相关,只有一小部分是局部矩阵。

我们假设由于其两性分子的性质(22),它的物理化学成分(23),由于氧化应激(10,24),一个β为自己的线粒体通路从细胞外空间,破坏膜流动性,导致精力充沛的障碍。这种机制的膜透化作用引起的β和自己的内化可能是线粒体功能障碍的主要原因。

由于氧化应激在这些致病机制被认为是一个关键因素,褪黑激素应该减少的功能失调的表现β吸收(25]。褪黑激素是一种证明抗氧化剂(26,27),特别是在大脑中,降低分子损伤动物模型展示的广告(28,29日),以及在其他神经退化的实验模型30.- - - - - -33]。有两个重要的线索关于褪黑素的作用线粒体救援,(1)褪黑激素穿透线粒体在那里进行清除自由基(34,35),(2)褪黑激素直接抑制线粒体渗透性转换孔(MtPTP) [36]。

为了进一步文档这些潜在的保护作用的褪黑激素,我们工作在活的有机体内通过注射纤维 直接在海马CA1锥体神经元层。岁Wistar鼠用于这些实验没有其他条件或遗传倾向形成斑块或其他广告功能。

2。结果

2.1。轴突损伤足总β注射的老鼠

最引人注目的异常变化是校内的积累,粘连,形成β聚集在有髓鞘的轴突。因此,一个β入侵的同心multilamellar髓鞘轴突(少突细胞细胞质)。这些β聚集引起的解剖和破坏髓鞘层壁画液泡化,形成洋葱bulb-like状突起,发现在慢性疾病(37]。在某些情况下,所有层中断和积极的一个β免疫反应性从轴突的间质内腔观察(图1)。在洋葱bulb-like状突起,β似乎形成聚合;一旦轴突和线粒体内,β骨料被瓦解,采用颗粒状外观。

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图1
一个β-诱导轴突损伤。颅内注射后β大脑海马,小块组织含损伤区域的后缀在四氧化锇2%,48小时在812年嵌入,嵌入切成70 - 90纳米超薄部分,然后使用一个从受到免疫组织化学过程β抗体。结合位点的主要抗体被发现通过孵化gold-labeled二级抗体。最后,部分是复染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,在电子显微镜下观察到。(a)淀粉样蛋白缠结同心层内的轴突的髓鞘(白色箭头)和髓鞘的扩大,相应的积累的β从主杆,是观察。Electrodense点稀疏在轴突(黑色箭头),似乎也进入腔从主杆(白色箭头)(16700 x)。(b)βelectrodense点渗透到轴突从扩大洋葱bulb-like结构(白色箭头)(10000 x)。(c)洋葱球细节(35750 x)显示丰富electrodense材料显示对应于黄金β(白色箭头)和分离区(黑色箭头)。淀粉样蛋白缠结似乎颗粒一旦越过髓鞘(黑色箭头)。(d)髓鞘在PBS-injected观察老鼠的大脑(放大2156倍)。
2.2。含量高的饮食中β老鼠又显著增加有关线粒体膜损伤

动物喂养与普通实验室啮齿动物饮食显示正常血液中胆固醇水平。当这些动物是鼠脑内注射β显示不仅大大减少线粒体结构损伤程度相比β又还hypercholesterolemic动物由于含量高的饮食,如电子显微镜观察到(图2)。


图2
含量高的饮食显著相关动物线粒体完整性的损失更重要。图显示差异PBS-injected大脑从动物接受常规实验室啮齿动物amyloid-injected大脑的饮食和其他两组。这些后者从动物接收正常的饮食和高从动物接受的食物。Amyloid-injected大脑显示重大损失比PBS-injected大脑线粒体膜的完整性。然而,这些动物此外美联储含量高的饮食更受到了影响。
2.3。鼠脑内注射足总 导致细胞外聚集,轴突退化,在线粒体积累

颅内注射后的36个小时 脑组织,并受到传统和透射电子显微镜检查。使用多克隆抗体β免疫组织化学、细胞外的肽伴随着强烈的小胶质反应(数据未显示)透露,预计(图3 )。70 - 90纳米超薄大脑部分从相同的孵化β主要抗体,其次是孵化gold-labeled二级抗体。通过电子显微镜观察显示β线粒体(图内免疫反应性3 ),伴随着重要的肿胀,外膜破裂,嵴溶解(数字3 和3 )。一个β发现局部的嵴线粒体的内膜。在H2O2——在足总β大脑又重要的观察超微结构的改变。H2O2被选为一个积极的氧化压力的控制,因为它的众所周知的致病性关系β(综述[38])。最突出的变化是外围嵴的液泡化,如图3。在线粒体空泡形成是伴随着electrodenseβ免疫反应性与夹杂物被分组和绑定到膜,尤其是内部嵴膜。细胞膜破裂导致不连续,缺口的形成。线粒体看起来肿杂乱无章的膜结构和嵴消失。在一些局部地区,intermembranous空间没有和线粒体出现像一个不规则扩大,single-membrane囊(图3 )。


图3
一个β在线粒体中,特别是在嵴的内膜,伴有严重破坏细胞器。(一)存款β聚集到海马邻近皮层注射后36个小时,如图所示,DAB-revealed辣根过氧化物酶免疫组织化学(40 x)。Congophilic淀粉样沉积仍可见到颅内注射后21天(数据没有显示)。(b)β免疫反应性(白色箭头)在线粒体内注射后的36个小时 到海马CA1锥体神经元在35000 x放大。同样的从β多克隆抗体的常规使用免疫组织化学过程中使用但显示6 nm gold-labeled第二抗体。线粒体肿胀与破碎的嵴及其残余细观察到电子致密布满灰尘颗粒混杂在一起。此外,膜的完整性丧失和一些液泡变得明显(黑色箭头)。(c)没有嵴线粒体高度肿胀,像大囊,含有细electrodense颗粒,线粒体外膜破裂(白色箭头),和空泡形成。在这种情况下,从β抗体是一个无关紧要的二级抗体,用于控制。(d)完好无损的PBS-injected线粒体超微结构控制老鼠(37000 x)。
2.4。鼠脑内注射的合并β进入线粒体与线粒体自由基生产过剩

大脑部分得到每组确定线粒体质量密度通过Mitotracker绿色调频,选择性荧光染料的线粒体定位是独立的膜电位。PBS-injected大脑线粒体显示统一的定期箱状形状分布和大小从318到1832纳米(不等的意思 海里)平均集成光密度(IOD) (数据4(一)和4 (b))。在一个β又的大脑,发现线粒体形成细胞核周围的集群大小从529到7400海里(的意思 nm, IOD = )(数据4 (c)和4 (d))。类似的集群观察H2O2又大鼠( ),他们到达了一个大小23μ(数据4 (e)和4 (f))。

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图4
的存在β线粒体内活性氧过剩有关。控制大脑表现出正则分布线粒体大小为964 (a) 365海里,根据Mitotracker绿色染色,这本质上是在水溶液而成荧光nonfluorescent线粒体膜的积累。细胞核出现在蓝色,与DAPI染色。在大脑控制PBS-injected线粒体ROS的数量是微不足道的,推断从CM-H2XRos染色,特别是线粒体内由于正电荷积累它获得氧化,细胞内ROS (b), CM-H2XRos腹腔内注射在活的有机体内2小时之前获取组织样本。足总β又显示大脑线粒体的不同分布,主要细胞核周围的,从529年到7400年不等的海里,形成集群(c), (d)。集成光密度(IOD) CM-H2XRos-stained线粒体明显( )升高在足总β- - - H2O2又大脑(e)和控制(d)相比,(f)。为了估计有多少线粒体从线粒体质量制造出过量的活性氧,我们把IOD的MT-Green IOD CM-H2XRos每组,我们发现足总之间的显著差异β又大脑和控制图形(如附件所示 )。

以关联的存在β在线粒体和线粒体自由基的生产过剩,36小时后的应用 前2小时获取组织样本,CM-H2XRos, dihydro-X-rosamine chloromethyl导数,腹腔内注射;CM-H2XRos potential-dependent调查,评估的直接生产线粒体活性氧(ROS)的细胞。红色CM-H2XRos染料扩散到活细胞的能力,标签只有积极线粒体呼吸39)和固定后留存。一旦位于细胞,减少CM-H2XRos被活性氧氧化荧光mitochondrion-sensitive探针和隐藏在这种细胞器;因此,它的氧化是有用的检测活性氧(主要是超氧化物阴离子, )和可能的活性氮物种(一氧化氮,•不,和过氧亚硝基,ONOO−)。通过对比IOD大小相等的随机选择的区域在一个光学部分,乘以CM-H2XRos-stained线粒体的数量,每组估计的生产过剩的活性氧。因此,英足总β又大脑显示出显著的ROS生产过剩,如预期(图在图4)。

2.5。褪黑激素可以显著减少ROS生产过剩

口头管理(20毫克/公斤/天添加到饮用水),褪黑激素 血清pg / mL 01:00 - 02:00 h, 84%高于控制(数据未显示)。在这个剂量,褪黑素显著减少线粒体ROS生产过剩,图的图形表示5。因此,线粒体CM-H2XRos IOD水平 又在老鼠大脑减少35%服用褪黑素的饮用水,而在H2O2鼠脑内注入老鼠,褪黑激素治疗ROS水平平均降低了69%,相比之下,H2O2鼠脑内注入大鼠没有褪黑激素治疗(图5)。


图5
褪黑素显著降低线粒体ROS生产过剩。正如所料,褪黑素减少荧光来自CM-H2XRos氧化在英足总β- - - H2O2又的大脑。根据图4大多数线粒体在大脑注射β或H2O2是产生自由基。现在,通过比较在大脑的动物产生的自由基的强度接收治疗那些动物没有褪黑激素,褪黑激素非常重要的减少数量的观察产生自由基,如图表所示。

最后,通过获得ROS之间的商,由CM-H2XRos估计,和线粒体质量,估计Mitotracker绿色标题,fA的显然更大的能力 导致氧化损伤对H2O2(图在图4),降低其基底值(图5)。褪黑素减少自由基的能力是重要的在这两个实验小组。

2.6。淀粉样β蛋白抑制呼吸控制比例和atp酶活性

颅内注射后的36个小时 ,我们发现一个β阳性免疫反应性在线粒体,线粒体损伤密切相关,ROS生产过剩,如上所述。线粒体被隔离以检查可能的发现与提到的功能指标之间的相关性,如线粒体呼吸控制比(RCR)和F1Fo-ATPase水解活动。前措施线粒体能力闲置率低但对ADP通过ATP(高速度40以这样一种方式,是可行的推断出电子转移的泄漏,而伴随的磷酸化,或从呼吸多少对比部分分开;后者,作为衡量的能力等内膜潜在维护一个耦合的能量质子电化学梯度与ATP合成(41]。一个比较PBS-injected获得了显著差异( )和足总β组( )( )。这种差异是fA时显著降低β又动物摄入饮用水(fA的褪黑激素β 足总β 梅尔, )(图6)。


图6
一个β全身的线粒体功能障碍。为了关联的存在β在线粒体和线粒体活性氧的生产过剩与功能性改变,耗氧量在孤立的线粒体(1毫克/毫升)使用一个Clark-type氧电极测定34°C治疗缓冲区,添加琥珀酸为底物。呼吸控制比率(状态3率):(状态4率),作为一个指示器的适当的呼吸之间的耦合和磷酸化,揭示了fA的显著下降β- - - H2O2又大脑,与控制( )。然而,显著改善RCR观察动物与褪黑激素治疗( )。

H2O2又大脑,作为积极的控制,表现出更显著减少RCR ( 褪黑激素治疗(数据),同时回应8和9)。

有趣的是,两足总β和H2O2减少腺苷三磷酸酶水解活性,但与RCR响应,褪黑激素没有改善这个参数(足总β=足总β+梅尔)(图7)。


图7
atp酶的水解活动没有回应褪黑激素。ATP酶水解是由比色反应测量自由正磷酸盐的释放(π),基于磷钼酸的形成复杂的酸中紧随其后的是减少或络合基本染料产生有色配合物。电子传递停止时,等内膜潜力开发的ATP水解的线粒体ATP合酶。然而,在存在βatp酶的水解活性显著降低而完整的大脑( ),没有任何复苏melatonin-treated动物(足总β=足总β 梅尔·),这可能意味着不同的损伤机制β。事实上,另一份报告探讨了直接互动的可能性β复杂的α亚基F1Fo-ATP合酶(42]。

图8
线粒体ROS /比率。线粒体的数量产生自由基(ROS /线粒体比率)是更大的在足总β和H2O2又没有大脑褪黑激素治疗,但效果是通过使用褪黑激素显著降低。
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图9
一个β降低线粒体膜流动性密切相关自由基生产过剩和呼吸控制比例。衡量估算准分子单体荧光强度比(即/ Im)的民进党,线粒体膜的膜流动性评估为了展示β,进口在细胞膜外,能够引起线粒体损伤一旦合并在细胞器中。我们发现组织产生更多的自由基(足总β和H2O2组),显示更多的改变膜流动性和RCR相比PBS-injected大脑作为控制( )。通过使用褪黑激素,膜流动性和RCR明显改善(足总β+梅尔和H2O2+梅尔组)。

一般来说,更广泛的氧化损伤与较低的呼吸控制比和较低的腺苷三磷酸酶水解活动(图8)。

2.7。氧化应激有直接相关性低膜流动性和低熔

在建立的存在之间的联系β这个细胞器,线粒体功能障碍,我们寻找膜流动性的改变。这个参数与膜脂质成分改变的程度,它是一个著名的致病因素直接影响能量耦合的Ca2 +泵,随之而来的精力充沛的失败。的确,我们发现颅内注射后足总β和线粒体内外观,显著减少膜流动性明显比控制Ie / Im (fA荧光值β 与PBS-injected控制 , )。动物的大脑接收显示明显恢复(fA褪黑激素治疗β 与英足总β 梅尔 , )(图9)。

3所示。讨论

大量的实验数据支持的假设大脑中的淀粉样蛋白沉积是AD痴呆的病因学因素之一(43)和胞内的级联的假说”β“获得了优势18]。它已被证明 解开线粒体呼吸链,这在阿兹海默症病理中发挥着关键作用44]。从结构上来讲,β诱导线粒体肿胀孤立(45,46)和功能降低ATP合成和各种线粒体酶的活动,作为证明在活的有机体内(47),在体外在培养的神经元细胞或星形胶质细胞暴露在肽(45,47,48]。因此,一个β全身的线粒体损伤可能是一个扩展的淀粉样蛋白级联假说,20年前提出的代谢改变应用程序在AD发病机制启动事件,随后导致的聚合β,特别是 (43,49]。后,不同的神经毒性机制β被提出,包括破坏线粒体功能通过绑定的β绑定酒精脱氢酶(ABAD)蛋白质19),或形成离子通道使钙吸收导致神经炎的剂量和时间的方式异常(50),或线粒体通透性转换孔的耦合抑制呼吸道复合物(51,52]。

一个根本的因素是小胶质细胞的overactivation随之而来的超表达的促炎细胞因子和ROS的显著增加,它总是盛行[53- - - - - -56]。反过来,ROS可能来自一个先天免疫反应被破坏信号(55,57或者他们可能来自受损的线粒体(58]。后者意味着一个病态的恶性循环,线粒体呼吸链的功能障碍和ROS泄漏给对方。然而,有一个相关的问题,线粒体损伤的结果intraneuronal存款的内源性寡聚物种β吗?或者细胞外fA的沉积β能够达到的线粒体,导致恶化之前斑块的出现?

应用程序本地化trans-Golgi网络,内质网(ER),和endosomal,溶酶体,线粒体膜。因此,解放的β无论可能发生和形成胞内积累应用和β- - -γ-secretases本地化,尤其是当应用程序中(了59]);这不是在当前使用的动物实验。本文提供的数据,从岁获得纯种老鼠的大脑,证明线粒体进行颅内注射后的主要结构和生理变化 ,进而导致细胞外存款的形成,最终出现在线粒体。

线粒体基因似乎被激活之前斑块的形成,除了增加H2O2内容,伴随着细胞色素氧化酶活性,减少在年轻Tg2576老鼠出现之前β斑块(20.]。目前尚不清楚是否可溶,intramitochondrially产生了β可能导致损害的电子传递链,根据应用的理论倾向在线粒体膜(60),一个β必须从外部导入线粒体,细胞溶质。这一现象被发现,涉及到的移位酶外膜(汤姆)和内膜的移位酶(TIM),如图所示在人类大脑皮层脑组织标本由汉森彼得森et al。21]。

然而,一个β有能力本身permeabilize膜。没有丢弃,β从胞质可能入侵线粒体,值得考虑的是,大量的细胞外β神经元外,形成斑块,甚至可见传统的光学显微镜。一个β肽是两亲水脂分子,含有亲水性氨基端伸展(28残留物)和疏水c端域(残留29-40/42)部分生成应用程序跨膜域。在溶液中,β肽显示大幅展开构象与二级结构含量减少;然而,后者大幅增加在磷脂囊泡尤其是富含胆固醇和神经节甘脂(61年,62年]。的能力β插入膜更取决于胆固醇:磷脂的比例。通过使用相同的实验设计在这份报告中,我们发现了重要的证据β全身的线粒体膜脂质含量的变化,可能直接相关的部分β分子间相互作用和部分相关β全身的氧化应激(未公开的数据)。氧化压力,另一方面,可能诱导膜透化作用,揭示了中子反射计在脂质影响63年),而老化与胆固醇的变化,膜鞘磷脂,磷脂含量(61年,64年,65年]。因此,根据我们的假设,所有这些因素都集中促进了β进入细胞,最终是线粒体。

事实上,选择性吸附、内化和退化的主要阻力同种型的β肽, ,已被证明在分化PC12细胞。肽的内化与肽的浓度成比例地增加中、内化的数量 大约是5倍高于的数量吗 (66年]。

一个β细胞应用于人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,被证明是内化和被线粒体21]。在其他的实验在活的有机体内异硫氰酸荧光,——(FITC)标记 介绍了通过尾静脉注入小鼠血脑屏障(BBB)呈现渗透治疗百日咳毒素,容易穿过permeabilized BBB, 48小时后 阳性神经元广泛(67年]。这些实验演示细胞外的可能性β,即使是外生 ,可能intraneuronal的来源β。一旦进入神经元,Aβ线粒体损害负责,为我们演示了。我们有健康的老鼠大脑中所示颅内注射后 ,这种肽在细胞外的斑块积累。没有另一个先前存在的病理条件或倾向,和实验下进行在活的有机体内条件。细胞外积累的 恰逢轴突变性和积极的一个β免疫反应性在线粒体内,伴随着超微结构的改变与线粒体功能障碍一致。所有的这一切也配合Saavedra et al。2他发现,细胞外β导致细胞内的一个βApoE及其内部化不是依赖,但这是一个脂质raft-mediated机制。此外,一个β被证明是更有效地通过轴突比细胞体内化。

我们发现,如前所述,轴突退行性改变与提升β免疫反应性(图1)。这是可能的轴突退化可能的起源和髓鞘脱失路径允许的条目β通过逆运输到神经元。先前的报道显示数量的增加β和 公元白质伴随着大量的髓磷脂碱性蛋白显著减少,髓鞘含蛋白脂质蛋白和2′,3′循环3′核苷酸磷酸二酯酶。这些观察表明,广泛的白质轴突髓鞘脱失是阿尔兹海默症病理的基础,导致电容损失和严重的神经传导干扰,严重损害脑功能(68年]。新假说表明,髓磷脂分解late-myelinating大脑区域释放铁,促进有毒淀粉样蛋白寡聚物和斑块的发展,进而破坏更多的髓鞘69年,70年)(图1)。值得一提的是,铁是密切相关的氧化应激和氧化应激是一个关键的主人公在神经退行性疾病8,10,15,24,71年,72年]。此外,我们还发现了一个重要的一个β全身的重排在膜胆固醇和脂肪酸合成在细胞质膜和线粒体膜(数据没有显示)、高潮和膜流动性的显著改变(图9)。

众所周知,高水平的循环胆固醇并不意味着高胆固醇浓度在脑组织,本质上是因为血液中胆固醇不穿过血脑屏障(BBB)。然而,高胆固醇血症和积累有一定的联系β肽在大脑。的机制还不是很清楚,但是氧化胆固醇代谢物27-hydroxycholesterol可能起着关键作用。我们的结果(图2和9)配合其他报告的结果73年- - - - - -75年]。

曾经的内化β线粒体及其渗透能力记录,我们继续评估线粒体的生产过剩自由基的存在引起的β,通过使用CM-H2XRos rosamine导数保留固定后,腹腔注射在活的有机体内。这种方法允许我们检查生产过剩自由基不改变大脑的自然建筑组织或细胞之间的相互关系。线粒体的变化和质量β链构象变化探讨了利用Mitotracker绿色,应用体外在大脑组织切片。

氧化应激和β毒性是相互依存的现象。事实上,病理的影响β严重依赖其引发氧化应激的能力(42]。有两种主要手段β诱发氧化应激,一个是通过激活NADPH-oxidase可能在神经元和神经胶质(76年,77年链接),氧化还原控制和神经炎症信号通路(68年]。另一个手段β诱发氧化应激与线粒体损伤,机制与细胞凋亡密切相关(78年]。相反地,氧化应激诱导细胞内积累的β通过加强amyloidogenic通路(79年]。H2O2是一个著名的解偶联剂的线粒体呼吸活动,产生浓度抑制状态3 (ADP-stimulated)呼吸和大幅降低ADP:阿比(80年]。评估电子传递链复合物和克雷布斯循环酶显示α酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和顺乌头酸酶容易失活,这是一个可逆过程(81年]。褪黑激素直接解毒作用H2O2由此产生的产品是N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine也是一种有效的自由基清除剂(81年,82年]。因为这个原因H2O2被选为积极控制和RCR以及水解atp酶的活性在H2O2良好的手术又大脑褪黑素治疗,这意味着氧化应激可能解释这些变化。然而,在足总β又大脑,褪黑素软有利的影响,但它未能调节腺苷三磷酸酶水解活动。这一发现解释了能量代谢减退有关β,因为腺苷三磷酸酶水解活动负责生成一个质子梯度的ATP。有趣的是,β在结构上类似于F1的抑制剂的ATP synthase-binding序列(i)、ATP酶活性的天然抑制剂F1Fo-ATP合成酶复杂的线粒体。因此,与i, Aβ可能抑制atp酶活性可能F1Fo-ATP合成酶的α亚基相互作用复杂(83年]。我们推测,这直接相互作用可能导致抗氧化治疗的失败恢复腺苷三磷酸酶水解活动在足总β又的大脑。即使褪黑素已被证实能改善线粒体功能在正常和病理条件下,这种影响其抗氧化活性有关。

褪黑激素似乎并不直接影响腺苷三磷酸酶水解活动。然而,这种内源性神经激素合并到线粒体,可能会降低耗氧量与它的浓度,抑制氧通量增加任何过多的ADP的存在,和减少膜电位变化,抑制生产 和H2O2,展示了在小鼠肝细胞84年]。此外,通过使用褪黑激素可以维持氧化磷酸化和ATP合成的效率,同时增加呼吸系统的活动复合物(主要配合物我、III和IV) (84年]。褪黑激素也已经被证明是有效预防线粒体一氧化氮合酶诱导帕金森小鼠(85年]。然而,褪黑激素也未能恢复nitrosative应激失败的腺苷三磷酸酶水解活动脓毒性小鼠(86年]。这些数据表明β全身的线粒体的改变,正如在早期阶段所描述的那些广告淀粉样斑块的出现之前,是内化的结果β。淀粉样肽后,连续生产过剩,引发更多的氧化应激(44[]和神经炎症55,87年),导致细胞外的斑块的形成。因此,的影响β在线粒体可能是淀粉样蛋白级联的延伸。这里给出的结果支持假设的内化β在广告期间线粒体功能障碍的主要原因。

结束语
细胞外的存款β可以访问线粒体的吗β能力permeabilize细胞膜和脂质影响。因此,一个β可以通过外膜细胞外空间,这些存款变得如此巨大的形成斑块,与传统显微镜可见。的角色β全身膜损伤和的能力β通过不同的隔间基本了解线粒体能量衰竭。所有上面提到的,在一个上下文,脂类和相关的氧化应激发挥关键作用。

4所示。材料和方法

4.1。在活的有机体内一个β又模型

手术和动物与严格遵守护理程序进行护理的指导和使用实验动物(国家卫生研究院出版数量86 - 23岁的贝塞斯达,医学博士,美国)。所有协议和程序批准的机构的动物保健和使用委员会。雄性Wistar鼠(250 - 280克;三)成对被安置在身子上的殖民地的房间黑暗与灯光在20:00 h /光周期;还提供了一些食物和水随意。老鼠被分为( )在以下组:(1)车辆(PBS)注入老鼠,(2)纤维 又大鼠(足总β),(3)H2O2(200μ米)鼠脑内注入大鼠(H2O2)。另外两个组,足总β+梅尔和H2O2+梅尔被包括在内。在这种情况下,足总β或H2O2鼠脑内动物接受抗氧化治疗注射褪黑素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),这是溶解在水容器的剂量20毫克/公斤/天(24]。H2O2作为一个积极的控制因为其强大的氧化能力和特殊的能力改变线粒体状态3 NADH-linked呼吸(88年]。汽车的实用程序,控制与解决方案β,如生理盐水或PBS已经建立了从公布的数据(89年,90年]。一个β展品化学,促进了活性自由基的形成肽。它是可以接受的用PBS代替β肽因为甚至无毒β衍生品,不排除炒β通常的控制在活的有机体内模型中,拥有alkylsulfides metal-independent方式可能与氧气反应生成亚砜(91年]。此外,这些衍生品可以生成PBN加合物,表明peptide-derived自由基物种的存在(72年]。

海马注射的β1-42(2毫升的最终浓度1毫米)进行如前所述[10,24,71年]。冻干合成一个β1-42(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)肽是可溶性(10−4M)过滤、无菌PBS,然后被允许孵化与连续搅拌(聚四氟乙烯搅拌棒在800 rpm) 23°C 36 h (71年,92年)以形成纤维总量。老鼠,与水合氯醛麻醉(350毫克/公斤,i.p。),被安置在一个立体定位仪颅内注射在5分钟内(协调:前后=−3.8毫米,medial-lateral = 2.0毫米,从前囱dorsal-ventral = 2.6毫米93年),使用5-microliter汉密尔顿微量调节注射器加上30针规通过灵活的油管。针注射后5分钟了。相同的坐标用于PBS-injected控制和H2O2实验组。

36小时内注射后,老鼠深感麻醉和灌注transcardially PBS的200毫升。此外,灌注了那些动物用于免疫组织化学过程与4%多聚甲醛。大脑被和一块组织(164 - 180毫克),包括损伤区域,被穿孔(直径10毫米),底部的针。这段包括海马组织和邻近皮质。

4.2。免疫组织化学

对于一个β免疫组织化学,5毫米的大脑切片与多聚甲醛后缀为2小时,在PBS洗净,切成25 - 30μ米厚的部分与Vibratome(莱卡)。使用常规immunoperoxidase进行免疫组织化学染色技术在自由浮动的部分。在0.05 PBS组织第一次洗,然后冲洗1% H2O2在PBS,洗在0.05 M PBS, preincubated PBS中含0.3% Triton x - 100 (PBST);部分在一夜之间被孵化与兔子从室温β抗血清(反β一个421:1500年,PBST Santa Cruz)的0.1%。15 h后,组织洗两次0.3% PBST其次是孵化与辣根peroxidase-bound山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体2小时(圣克鲁斯生物技术有限公司)。组织在0.3% PBST洗,然后在PBS,然后对3 3′-diaminobenzidine (DAB)(σ化学公司)。

immunoelectron显微镜,海马组织样本在4%多聚甲醛固定24小时,沉浸在蔗糖2.3 24小时。小块被削减2%和后缀四氧化锇在PB 0.2 45分钟,然后嵌入48小时812年嵌入(电子显微镜科学)。超薄部分70 - 90海里被削减的超微切片机(Reichert Om3)和安装在镍网格,然后孵化2小时5% BSA和0.1%鱼明胶。immunolabeling实验,安装部分被孵化24小时在4°C主要从多克隆抗体β(圣克鲁斯生物技术)稀释1:1000,然后洗了四次与PBS tween-20 0.1和0.1%,并进一步培养3小时在室温下用6 nm gold-conjugated二级山羊anti-rabbit抗体(杰克逊Immunoresearch实验室)稀释1:500。与PBS四洗后,部分复染色有2%的醋酸铀酰柠檬酸铅5分钟和15分钟检查蔡司EM 906透射电子显微镜(从,德国)。

4.3。饮食

为了强调胆固醇在神经元的重要性β全身的伤害,动物鼠脑内注射β被分成两组,一个定期收到实验室啮齿动物的饮食食物,而另一组是用高4%的食物加上1%绞痛酸(哈伦Teklan道明。01418)。图像进行了分析通过使用图像Pro-Plus软件(v5.1)和结构破坏确定损坏的膜的比例对完整、健康的线粒体膜/领域。

4.4。分析线粒体自由基的生成

Mitotracker红色CM-H2XRos(分子探针),rosamine导数用于检测线粒体自由基,在DMSO溶液稀释成1毫米股票的解决方案。100年μL的溶液被稀释在5毫升无菌生理盐水溶液和存储在4°C作为工作的解决方案。0.030应用的剂量μ克/公斤,CM-H2XRos并不影响线粒体的功能属性加载后,由于呼吸系统输出和细胞生存能力不显著改变,评估在一个单独的研究(数据没有显示)。两个小时CM-H2XRos腹腔内注射后,灌注动物transcardially PBS其次是4%多聚甲醛。大脑被立即删除并沉浸在8 - 10 h的固定剂。在PBS短暂洗涤之后,大脑切片切成25 - 30μ米厚的部分,包括感兴趣的领域,与vibratome孵化自由浮动MitoTracker绿色(分子探针,交货/ Em 490/516 nm),而有选择地污渍在活细胞线粒体和细胞内固定(94年]。然后部分是安装在胶(Vecta债券)涂层玻璃幻灯片,用DNA染色,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),包含安装介质(Vectashield、向量实验室)为了评估线粒体质量与核细胞复染色用蓝色(例/ Em 359/461 nm)。分析了线粒体自由基通过监控氧化荧光产品(例/ Em 554/576 nm)的荧光显微镜下CMH2XRos(卡尔蔡司Axioskop)。集成光密度(IOD),线粒体的数量,以及其线粒体区是由使用图像分析软件(Image-Pro + v5.1)。

4.5。线粒体隔离

短暂,脑组织剁碎,放在prechilled Dounce均质器和她缓冲区(0.25蔗糖,5毫米玫瑰和1毫米EGTA, PH值7.4),其次是离心10分钟,每分钟2500转4°C, recentrifugation的上层清液(8500 rpm, 10分钟)获得原油线粒体颗粒,进而,在冰,10分钟后孵化是在她再次resuspended +脱脂牛血清白蛋白(σ化学公司)。白蛋白是线粒体的消除离心悬浮在9500 rpm, 10分钟。线粒体中的蛋白质含量比例确定使用洛瑞的方法(95年]。

4.6。呼吸控制比率(软)

耗氧率的测量是在34°C使用一个孵化室水套和Clark-type O2电极(黄色的春天仪器有限公司,黄色的春天,哦,美国)和呼吸控制比率计算根据机会和威廉姆斯(96年]。1.9毫升的饱和空气特制缓冲区(125毫米氯化钾,20毫米拖把,MgCl 5毫米和0.1毫米EGTA pH值7.6)添加到室和平衡与氧电极与搅拌3分钟。刚做好的线粒体蛋白质(1毫克/毫升)被添加到缓冲室和孵化与搅拌3分钟。呼吸开始通过增加5毫米正磷酸盐(π)、琥珀酸5毫米和1毫米ADP。琥珀酸的氧化,少量的ADP刺激呼吸比率(3)直到ADP成为疲惫(4)状态。呼吸控制比(RCR)比率的计算状态3 / 4耗氧率。

4.7。腺苷三磷酸酶水解活动

腺苷三磷酸酶活性测定在40°C中包含125毫米氯化钾(1毫升),40毫米拖把(pH = 8), 3毫米MgCl2线粒体蛋白质的,加上0.1毫克,反应开始和40μL (ATP(75毫米)和30%三氯乙酸10分钟后停止。自由正磷酸盐(π)交付的ATP水解是衡量在660 nm基于比色测定钼磷酸盐复杂的形成在酸介质(添加3.3%钼酸铵在3.8 N H2所以4和10% FeSO4)其次是减少或络合基本染料产生有色配合物(97年,98年]。

4.8。线粒体膜流动性的变化

1,3-dipyrenylpropane (DPP)并入膜形成分子内准分子主要依赖媒介微粘度和温度的决心99年]。膜流动性是由估算准分子单体荧光强度比(即/ Im)荧光探针,商,反射膜磷脂的横向移动One hundred.]。短暂,线粒体在Tris-HCl resuspended缓冲区(pH值50毫米,8),然后由声波降解法分散15秒前被离心分离13000 rpm。线粒体膜颗粒是resuspended使用洛瑞和蛋白质测定方法(95年]。0.1毫克的线粒体蛋白质混合在spectrofluorometric细胞包含Tris-HCl(20毫米,pH值7.5)。民进党在乙醇溶液的光谱年级被稀释(0.02毫克/毫升)和混合膜磷脂膜的荧光探针的摩尔比率1:1400和混合物在黑暗中孵化4小时在室温下。民进党纳入膜的荧光测量在24°C珀金埃尔默荧光光谱仪,LS50B。荧光团很兴奋在329 nm和单体和准分子荧光强度在379和480海里,分别。

4.9。统计分析

所有数据显示为±SE一式三份的实验手段。统计分析的数据为多个比较是由双向方差分析学生的紧随其后 测试。一个比较,之间的任何差异的重要性意味着是由未配对 测试。意义的标准 在所有的统计评估。