文摘
骨骼肌功能很大程度上取决于完整的能量代谢,应激反应,抗氧化防御机制。在这项研究中,我们测试了总补充的效果α-酸(LA) +辅酶Q10 (PPAR Q10)γ共激活剂α(PGC1α)活动,表达glutathione-related第二阶段培养酶、谷胱甘肽(GSH)含量C2C12肌管。补充肌管的250μmol / L + 100μmol / L Q10核PGC1水平显著提高α总开关的能量代谢及线粒体生物起源。核PGC1的增加α伴随着PPAR的增加γtransactivation,下游PGC1的目标α,增加线粒体转录因子mRNA集中参与线粒体复制和转录。此外,补充肌管与LA + Q10导致增加基因编码的蛋白质参与应激反应,谷胱甘肽合成,其回收利用。在LA-plus-Q10-treated肌管谷胱甘肽是重要的4倍增加明显。谷胱甘肽的增加伴随着核Nrf2蛋白质含量增加,一定程度上调节γGCS和GST基因表达。目前的数据表明,合并后的补充与LA + Q10骨骼肌细胞可能会提高能源体内平衡,压力反应,抗氧化防御机制。
1。介绍
的过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)共激活剂α(PGC1α)一直被认为是总开关能量稳态的1]。PGC1αPPAR等与转录因子相互作用γ,这是一个下游PGC1的目标α,从而调节适应性生热作用,线粒体生物起源和骨骼肌纤维类型的转换(1]。功能研究表明诱导阻力增加骨骼肌疲劳在孤立的转基因老鼠overexpressing PGC1α(2]。一个激活的PGC1α与表达的增加slow-twitch (I型)纤维的特点是增加了线粒体生物起源,因此氧化代谢为主要能量来源(1]。体育锻炼可能激活PGC1α(3),而衰老伴随着PGC1的显著下降α在骨骼肌表达4]。这减少PGC1α可能损害线粒体呼吸能力,从而增加活性氧的生产进而导致谷胱甘肽(GSH)枯竭和氧化应激。因此,激活PGC1策略是必要的α,增加谷胱甘肽合成及其回收从而维持肌肉功能和完整性。
α-酸(LA)是合成辛酸的线粒体,线粒体作为辅助因子α-ketoacid脱氢酶(5]。内源性合成旁边拉也可能源自外源性补充食物来源包括(看过的6])。作为一个组件内线粒体电子传递链的膜,辅酶Q10也称为泛醌是集中参与细胞呼吸和线粒体生物起源。此外,众所周知其自由基清除属性,这在一定程度上是由电子转移(看过的7])。洛杉矶和Q10不能孤立地工作8]虽然鲜为人知的潜在的LA + Q10协同活动的肌肉细胞生理学。因此,在这项研究中,我们调查的影响结合补充PGC1 LA + Q10α水平、压力反应和合成谷胱甘肽在培养肌管。
2。材料和方法
R (+) LA和Q10获得Sigma-Aldrich有限公司(德国慕尼黑)。洛杉矶是溶解在DMSO(卡尔·罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)。Q10股票的解决方案准备如前所述[9]。股票的解决方案被储存在−80°C到使用。
2.1。细胞培养
C2C12细胞(细胞培养应用研究所,慕尼黑,德国)保持在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含有葡萄糖4.5 g / L, 4更易与L谷酰胺,1 L更易与丙酮酸钠,10%胎牛血清(FCS), 100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(PAA, Coelbe,德国)。细胞生长在5%的股份有限公司2在37°C下湿润的气氛。每个治疗前,C2C12细胞分化通过血清饥饿肌管应用DMEM补充2%马血清(美国Gibco,生活技术,卡尔斯巴德)48 h - 72 h。所有细胞培养plasticware从Sarstedt购买(Numbrecht、德国),除非另有说明。所有细胞培养检测车辆控制执行,并不影响任何参数的测量。
2.2。细胞毒性测试
通过中性红试验(细胞毒性测定10]。中性红的分析是基于pH-dependent积累中性红在可行的细胞的溶酶体。C2C12细胞被播种在24-well板块(费舍尔科学、Schwerte、德国)100000细胞/密度好,72 h的分化,处理250μmol / L + 100μmol / L Q10 24 h血清培养基,分别。包含测试物质的培养基新鲜血清介质包括50所取代μ克/毫升的中性红(卡尔罗斯)。孵化3 h后,细胞中被和提取使用解决方案包括50:49:1 (v / v / v)乙醇,水,冰乙酸。板的吸光度测定读者(Labsystems,芬兰赫尔辛基)在540海里。
2.3。瞬时转染和PPARγ荧光素酶报告基因分析
在24-well盘子C2C12细胞分化。细胞被瞬变与三个向量转染:包含PPAR的一个向量γ小黑裙(配体结合域),一个包含报告基因UAS-GAL4-vector萤火虫荧光素酶,和归一化向量(pRL-TK;包含Promega,德国曼海姆)Renilla reniformis荧光素酶基因。转染了使用JetPei转染试剂(Polyplus转染,Illkirch Cedex,法国)根据制造商的指示。转染24 h后测试化合物以及1μM罗格列酮应用于血清中,治疗24 h。随后,细胞细胞溶解和荧光素酶活性测定使用Dual-Luciferase报告基因分析系统(Promega)根据制造商的协议200年Tecan无限标(Crailsheim Tecan集团有限公司,德国)。
2.4。RNA隔离和实时PCR
C2C12细胞precultured 6-well板块在300000细胞/密度。细胞分化,随后处理250μmol / L + 100μmol / L Q10和各自的化合物在coapplication 16 h。
RNA实时PCR与TRIsure孤立后,制造商的协议(Bioline Luckenwalde,德国)。引物设计primer3软件以下序列:PGC1α转发:TGCCCAGATCTTCCTGAACT;反向:TCTGTGAGAACCGCTAGCAA;TFAM转发:TAGGAAAATTGCAGCCCTGT;反向:GCTGAACGAGGTCTTTTTGG;18 srrna转发:CCTGCGGCTTAATTTGACTC;相反:AACTAAGAACGGCCATGCAC (MWG生物技术,Ebersberg,德国)。实时PCR进行使用Sensi-Mix一步工具包(Quantace,柏林,德国)。
2.5。安捷伦微阵列分析
差异基因表达决心通过安捷伦芯片平台(源生物科学,画像GmbH,柏林,德国)。C2C12细胞治疗如上所述。RNA的基因芯片分析孤立使用试剂盒RNeasy工具包(杜塞尔多夫,德国)根据制造商的协议。安捷伦快速Amp标签装备一种颜色(美国圣克拉拉安捷伦科技)是根据制造商的说明用于产生和放大荧光cRNA。通过NanoDrop产量和标签的cRNA控制测量(热费希尔科学)。杂交,安捷伦基因表达杂交工具包使用根据制造商的协议。微阵列幻灯片洗(安捷伦协议)后,随后用安捷伦芯片扫描仪进行扫描。使用安捷伦特征提取数据提取。质量参数(例如,背景去趋势或网格)和异常的样本都是被监控的。
6.7微阵列分析大卫生物信息学资源(数据库进行注释,可视化集成的发现(11];http://david.abcc.ncifcrf.gov/)使用。因此,调控基因的基因id(> 2或褶皱变化)上传。对于后续功能集群,KEGG(京都基因和基因组百科全书)通路地图。
2.6。在计算机启动子分析
启动子分析、基因序列差异受拉+ Q10治疗上传到MatInspector软件(http://www.genomatix.de/),以便确定Nrf2假定的结合位点。
2.7。谷胱甘肽测量
C2C12细胞治疗与测试化合物24 h如上所述。随后,细胞在10更易清洗和细胞溶解/ L盐酸和反复冻融循环。谷胱甘肽微量滴定板试验后确定协议根据Vandeputte et al。12]。总之,细胞蛋白质被添加6.5%磺基水杨酸和离心沉淀(2000 g×15分钟)。细胞样本应用于微量滴定板,与股票缓冲和试剂混合组成的混合(最终反应浓度)0.71更易与L / L DTNB和0.24更易NADPH。的反应是初始化添加谷胱甘肽还原酶(1.2国际单位/毫升,西格玛奥德里奇有限公司)。动态测量的发色团DTNB-GSH在一盘415海里进行读者(Labsystems,芬兰赫尔辛基)。总谷胱甘肽决心使用GSH-standard曲线(所有试剂卡尔罗斯,除非另有说明)。
2.8。免疫印迹分析PGC1α和Nrf2核提取物
对于PGC1α和Nrf2检测、细胞治疗与测试化合物6 h。随后,细胞用冰冷的PBS洗净,刮掉,离心机,核提取物随后准备所描述的瓦格纳et al。(2010)13]。数量的40μ每个样本的g蛋白混合加载缓冲区,在95°C的环境为5分钟和12% sds - page分离。随后,样品都被转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜和屏蔽3% (w / v)脱脂牛奶溶解在TBS + 0.05% (v / v) Tween-20 (TBST)至少2 h和探测与抗体PGC1 (1: 200;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,美国),Nrf2 (1: 200;Santa Cruz), TATA盒结合蛋白(真沸点;圣克鲁斯;1:200),或α微管蛋白(Abcam,剑桥,英国;1:5000)在一夜之间在4°C。后,膜被孵化与二次抗体(1:4000年anti-rabbit (Bio-Rad,慕尼黑,德国):Nrf2;1:4000 anti-mouse (Bio-Rad):真沸点,α微管蛋白;1:3000抗体(Santa Cruz): PGC1) 1 h,乐队是可视化使用ECL试剂(热科学)ChemiDoc XRS系统(BioRad)。分子量的蛋白质乐队估计使用西方C标准(Bio-Rad)。
2.9。统计分析
使用SPSS统计分析进行了19(美国芝加哥IBM)。数据分析的常态分布(Kolmogorov-Smirnov)。在非参数Mann-Whitney不是正态分布数据U测试应用。学生的t以及或单向方差分析(方差分析),Dunnett-T(齐次方差)事后进行测试。数据表示为±SEM。意义是接受。
3所示。结果
为了测试测试化合物的细胞毒性C2C12肌管与250年孵化μmol / L + 100μmol / L Q10(缩写为LA加上Q10)后24 h。条件下研究了细胞生存能力不是负面影响LA + Q10治疗(图1(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
PGC1α是一个重要的监管机构的骨骼肌能量恒定性。因此,我们决定PGC1α核蛋白质含量后6 h(孵化与LA + Q10。拉加Q10补充C2C12肌管核PGC1显著增强α蛋白质含量,总结图1 (b)。PGC1差异α蛋白质含量在洛杉矶+ Q10治疗的反应也反映在PGC1方面α基因表达(图1 (c))。事实上我们发现PGC1增加70%αLA-plus-Q10-treated mRNA水平肌小管细胞比未经处理的控制。
PGC1α集中参与PPAR的规定吗γ活动,这是一个下游PGC1的目标α。因此,我们决定PPARγtransactivation在瞬变转染C2C12肌管使用荧光素酶报告基因分析。罗格列酮(1μmol / L;rosi)作为积极的控制。治疗我们的C2C12肌管与LA + Q10 PPAR明显增加γtransactivation约50%(图1 (d))。然而,LA + Q10 cotreatment不如罗格列酮的PPAR的感应γtransactivation而言。
有氧肌肉营业额可能伴随着感应部分产生的活性氧的呼吸链内线粒体膜。因此,我们调查是否以及在多大程度上拉+ Q10的应用可能会影响细胞谷胱甘肽是一种重要的内源性抗氧化剂。通过使用安捷伦基因芯片技术,我们发现了几个记录不同受拉+ Q10在C2C12肌管。我们筛选这些基因在谷胱甘肽合成的作用,新陈代谢,和回收。有趣的是在谷胱甘肽通路12基因调节有差异(值< 0.001,Benjamini浓缩得分< 0.05)由于LA + Q10补充数据的总结2(一个)和2 (b)。
(一)
(b)
(c)
这两个γGCS轻、重链被LA + Q10歧管调节治疗。自γgc是谷胱甘肽合成的关键酶,我们进一步确定细胞谷胱甘肽水平在我们的骨骼肌细胞。重要的是,感应的γGCS基因表达是伴随着细胞谷胱甘肽增加4倍LA-plus-Q10-treated细胞相比控制(图2 (c))。
谷胱甘肽还原酶(GSR)集中参与NADPH-mediated减少GSSG谷胱甘肽,从而为进一步提供谷胱甘肽的反应。与拉加Q10孵化后,我们观察到GSR基因表达(图3.2倍增加2 (c))。有趣的是,不仅GSR glucose-6-phosphate脱氢酶2 (G6PD)和phosphogluconate脱氢酶(PGD)基因表达是由LA + Q10。使用这两种酶提供NADPH GSR GSSG减少。
诱导glutathione-S-transferase(销售税)可能防止骨骼肌脂质过氧化物从而提高应激反应。事实上,它已经表明,脂质过氧化物,如4-hydroxynonenal由于销售税灭活接合与谷胱甘肽(14]。我们发现在我们的肌管不同基因编码销售税(销售税α1,销售税α2,销售税α3,销售税α4,销售税π1,销售税π2,销售税μ6)调节的cotreatment LA + Q10(数字2(一个)和2 (b))。
识别结合位点在小鼠Nrf2 LA-plus-Q10-regulated基因启动子区域,各自的小鼠被上传到MatInspector启动子序列。总结,如图2 (b)多个结合位点,Nrf2已确定的启动子γgc (GCLC(0 - 4假定的结合位点),GCLM (0 - 4)), GSR(1 - 5),销售税(销售税α1(1 - 2),销售税α2(1),销售税α3(0 - 2),销售税α4(0/4),销售税π1(主),销售税π2(主),销售税μ6 (0 - 2))ODC1 (1) G6PD(1),和PGD(1 - 6)基因,分别(图2 (b))。
C2C12细胞的治疗与LA + Q10 TFAM mRNA水平增加了70% ((图)与控制3(一个))。此外,拉加Q10补充导致增加核Nrf2水平,总结了图3 (b)。
(一)
(b)
4所示。讨论
条件下研究了核PGC1 LA + Q10显著增加α在我们的骨骼肌C2C12细胞水平。PGC1α在一定程度上控制PPARγ激活是集中参与细胞葡萄糖摄取。事实上它一直先前表明,硫辛酸可能刺激葡萄糖摄取和通过PPAR在脂肪细胞的胰岛素敏感性γ端依赖信号转导通路(15,16]。
PGC1α线粒体生物起源是一个关键因素。PGC1α,在核呼吸因子1 (NRF1) coactivates线粒体转录因子(TFAM;也称为mtTFA)对线粒体复制和转录(至关重要17,18]。因此,我们决定TFAM水平LA-plus-Q10-treated肌管。有趣的是,拉加Q10导致增加TFAM mRNA水平比未经处理的控制(图3(一个))。LA + Q10 cotreatment比单一治疗LA和更强有力的Q10本身增加TFAM基因表达(数据没有显示)。还需要进一步的研究来证明是否TFAM基因表达的增加由于LA + Q10 cotreatment也反映在增加核TFAM蛋白质含量以及细胞线粒体密度,增加ATP合成和耗氧量。
我们观察到显著增加细胞谷胱甘肽水平在LA + Q10治疗的反应在我们的骨骼肌细胞。类似于PGC1α随着年龄的增长细胞谷胱甘肽水平降低(19]。因此,LA + Q10可以预防年龄相关性谷胱甘肽耗竭。LA + Q10的潜在机制增加细胞谷胱甘肽可能是有关增加半胱氨酸吸收如前所报道(20.]。此外,在目前的研究加上Q10基因表达显著增加γGCS,限制酶的谷胱甘肽合成。γGCS基因表达的转录控制核因子erythroid-like衍生因子2 (Nrf2)、一顶帽子N 'Collar基本亮氨酸拉链转录因子(21- - - - - -23]。有趣的是,拉加Q10治疗也多方面调节众多消费税也Nrf2目标基因(24]。因此,我们决定Nrf2核水平在我们的骨骼肌细胞反应的LA + Q10治疗。自洛杉矶+ Q10核Nrf2水平大幅增加,这似乎是可信的谷胱甘肽通过的感应γGCS以及感应GST基因表达的C2C12细胞通过Nrf2-dependent可能发生机制。事实上,它最近建议,可以作为一个目标的半胱氨酸残基亲电试剂Nrf2抑制剂Keap1 [25]。
我们的基因表达分析还揭示了鸟氨酸脱羧酶1 (ODC1) LA + Q10敏感分子目标(褶皱变化= 2.1,见图2 (b))。有趣的是,ODC1运动诱导的骨骼肌(26]。ODC1活动的增加可能会增加细胞水平的腐胺,精胺和亚精胺27),从而提高DNA稳定性(28),需要进一步调查。
在这项研究中我们测试的组合LA + Q10 PGC1而言α活动、应激反应和细胞谷胱甘肽的水平。然而,我们也进行了实验使用拉和Q10作为单一疗法以与我们的结果的任何测试物质管理(数据没有显示)。而Q10主要是调解PGC1α诱导活动,增加压力反应和细胞谷胱甘肽的水平。TFAM基因表达而言,无论是单一测试化合物增强TFAM。因此,TFAM感应可能是由于在coapplication洛杉矶和Q10协同互动。因此,为了同时诱导PGC1,应激反应基因,在骨骼肌细胞和细胞谷胱甘肽水平拉+ Q10的组合,而不是单一化合物治疗可能建议。
整体显示数据表明,硫辛酸的组合+辅酶Q10诱发PGC1α,提高应激反应,增加细胞培养的骨骼肌C2C12细胞中谷胱甘肽水平,总结图4。与250年我们补充肌管μmol / L和100μmol / L Q10。洛杉矶的浓度,在这项研究中,使用的是在大生理上可实现的6,29日),而似乎Q10含量高于实现在人类血浆和骨骼肌30.]。因此,目前发现关于洛杉矶的角色和Q10 PGC1α活动、应激反应、体外培养的骨骼肌细胞和抗氧化防御应该在适当的体内模型验证。
缩写
| γgc: | γ-Glutamylcysteine-synthetase |
| 销售税: | Glutathione-S-transferases |
| G6PD: | Glucose-6-phosphate脱氢酶2 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽 |
| 第三期: | 谷胱甘肽还原酶 |
| 拉: | α-酸 |
| Nrf2: | 核因子erythroid-like 2派生因素2 |
| ODC1: | 鸟氨酸脱羧酶1 |
| PGC1α: | 过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)共激活剂α |
| PGD: | Phosphogluconate脱氢酶 |
| TFAM: | 线粒体转录因子的 |
| rosi: | 罗格列酮。 |
作者的贡献
a·e·瓦格纳和i m·a·恩斯特的贡献同样这项工作。
承认
作者感谢戈比Steinkamp和薇薇安笨蛋为优秀的技术援助。