文摘
本研究调查的影响抗氧化剂trolox和二硫苏糖醇(DTT)在大鼠蓝斑(LC)神经元。电生理测量动作电位放电和全细胞电流响应每个抗氧化剂的存在表明,有三个在LC神经元亚种群。在电流钳实验中,大多数神经元(55%;6/11)没有回应的抗氧化剂。剩下的神经元表现出超极化和降低发射率(27%;3/11)或去极化和提高燃烧率(18%;2/11)。钙和JC-1成像表明,这些影响并没有改变细胞内Ca2 +浓度,但可以作为抗氧化剂治疗影响线粒体功能调节线粒体膜电位。这些表明antioxidant-sensitive LC神经元的亚种群可能更容易受到氧化应激(例如,由于ATP耗竭和/或overactivation Ca2 +端依赖途径)。事实上也许这族群LC神经元的优先摧毁了在帕金森症等神经系统疾病。如果是这样的话,可能会有保护作用的抗氧化剂治疗。
1。介绍
氧化应激在神经元是因为生产自由基和抗氧化剂之间的不平衡控制。这个过程会导致细胞损伤,严重时,可以触发凋亡或坏死(1]。事实上,这种氧化应激可能启动某些神经病理学如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症,氧化损伤生物分子细胞功能障碍和神经死因(1,2]。
确切的机制,即健康的神经元变得敏感,氧化应激是未知的,也不清楚抗氧化治疗限制氧化损伤的传播。例如,据报道,不同级别的氧化剂可以调节离子通道,从而影响起搏等重要的神经功能(3- - - - - -5]。因此,抗氧化治疗已被开发和使用,确实有利影响在预防或减缓神经疾病的发病6]。
抗氧化剂可以调节转录因子,最终导致氧化应激(7]。另一方面,它已经表明,分子被认为是抗氧化剂,因为它们的抗氧化能力在体外(如维生素A和类维生素A)在生物有不同的影响(在活的有机体内),他们可以增加氧化损伤生物分子,产生氧化应激(8- - - - - -10]。事实上自由基是至关重要的组件的许多细胞内信号通路(审查[11]),和一个夸张的水平下降可能导致不受欢迎的细胞活动。因此,许多因素导致不同的抗氧化剂在人类和动物试验的有效性包括不同的抗氧化剂的剂量和时间管理。
本文探讨了两种不同的抗氧化剂的作用(Trolox和德勤)起搏在蓝斑(LC)神经元。这些抗氧化剂可以螯合不同活性物种。这两种化合物膜渗透,所以他们可以很容易地访问细胞内的隔间。Trolox是一种水溶性维生素E模拟与抗氧化剂光谱(12),而德勤是一种还原剂,作用于硫醇(sh)组13]。在这里,我们表明,LC神经元表现出三种不同类型的电生理反应这些抗氧化剂。我们相信这些反应可能代表三个神经元数量,微分灵敏度自由基和参与LC神经元的巨大损失中观察到疾病如帕金森病。
2。实验程序
2.1。准备的大脑切片
本研究中使用的所有程序批准的纽卡斯尔大学动物保健和伦理委员会。老鼠大脑切片包含信用证准备从瑞士(P7-12两性)呈现无意识与氯胺酮(100毫克/公斤i.p)。根据先前建立的协议(14]。老鼠被斩首,大脑迅速删除,沉浸在冰冷的“修改蔗糖相像”包含(mM): 25 NaHCO3,235年11葡萄糖,蔗糖,2.5氯化钾,1不2阿宝41 MgCl2和2.5 CaCl2,都洋溢着95% O2/ 5%股份有限公司2(15]。小脑和脑干被孤立和片(270 - 300年μ米厚)与振动组织切片机切(徕卡VT1000S)。片被保存在一个复苏室(包含ACSF)在室温下和高氧实验开始前为1.5 2 h。包含LC的片被确认和转移到一个记录浴,可视化与立式显微镜(奥林巴斯BX50)和过冷与人工脑脊液(ACSF)包含(毫米):120氯化钠,25 NaHCO32.5,11葡萄糖,氯化钾,1不2阿宝41 MgCl2和2.5 CaCl2,不断沸腾O为95%2/ 5%股份有限公司2。LC神经元可视化使用红外视频与微分干涉差显微镜光学和确定根据他们的大尺寸和位置靠近腹外侧边界的第四脑室16]。大多数实验进行神经元片,而我们的Ca2 +成像和JC-1实验使用孤立的LC神经元。
2.2。准备新鲜的LC神经元
神经元是孤立的使用一个适应协议根据[17]。大脑切片被削减使用相同的协议上面描述的“准备的大脑切片”,允许恢复在恢复室1 h。片被放置在ACSF-containing录制室,和神经元被分离,孤立的使用定制的振动设备。这个乐器分离神经元通过振动好与一个密封的玻璃电极尖端略高于组织表面。这种方法每片通常大约10提供健康的神经元。隔离后,神经元被留给15分钟解决玻璃底的记录室温柔ACSF灌注开始之前。
2.3。电生理学
整个细胞电生理记录了使用附加电压钳或电流钳记录模式(Axopatch-1C放大器),数据在100千赫采样和低通滤波在5 kHz。MΩ电极电阻从1.8到2.5。神经元被认为是足够的电压夹在没有松开峰值期间观察到的电压斜坡应用程序(14,16]。
2.4。解决方案和药理学
为了避免perfusion-associated冲刷在全细胞记录,我们使用相同的实验协议如前所述16]。总之,10 s后细胞内访问了,第一电压协议是应用,治疗灌注立即使用快速交换(> 95%随时间变化~ 2 s) local-perfusion系统[18]。第二电压协议是应用180年代后开始治疗。电压钳实验总孵化时间是180年代;其他实验的孵化时间显示在各自的数据。河豚毒素(TTX;1μ米)被添加到灌流液块压敏电阻器Na+当脉冲步协议应用渠道。标准的内部吸管解决方案包含(毫米):135 K methylsulphate, 8氯化钠,10玫瑰,2毫克2ATP, 0.3 Na3三磷酸鸟苷,0.1 EGTA, pH值:7.3。使用标准的外部解决方案是ACSF。所有的实验都在进行°C。
2.5。采集和分析
数据获得使用Axograph 4.8软件(ITC-16接口和Mac电脑G4)和使用Axograph X 1.1.0分析软件。输入电阻、电池电容和串联电阻测量由软件根据对−5 mV脉冲的响应交付后不久获得全细胞记录模式。−8.5 mV的校正,计算使用JPCalc [19),应用于占ACSF之间的接界电位和K甲基硫酸盐在录音中吸管。我- - - - - -V情节是由去极化脉冲协议录音。个人电流正常细胞大小根据整个细胞电容获得电流密度值(pA / pF)。电流密度值是乘以100正常化值测量电流。录音通过坡道和去极化脉冲协议过滤1 kHz之前使用Axograph X软件分析。
2.6。测量的胞质钙2 +和线粒体膜电位(Ψm)
相对细胞内(Ca2 +]或Ψm测量在新鲜分离LC神经元。隔离(方法)后,LC神经元含有荧光体在室温下ACSF孵化10μ俄勒冈州绿色/ 45分钟或5μg / mL JC-1 1 h [20.]。包含孤立和加载的记录室神经元被放置在舞台上的尼康TE200倒置显微镜连接到一个BIORAD 1000共焦扫描系统。孤立的神经元被认为一个60 x水浸的目标。ACSF是灌注实验开始前至少10分钟。俄勒冈州绿色fluophore很兴奋使用488 nm 20 mW氩激光强度设为3%,录音使用522 nm排放过滤器。JC-1实验用氩激光设置为1%强度为488 nm的滤波器组合励磁和522海里排放记录激发绿色荧光和514 nm和585 nm记录红色荧光发射。相对荧光情节分析了离线使用ImageJ软件。
2.7。统计数据
所有数据都意味着±SEM。4.02 GraphPad棱镜用于图形做准备。统计分析了SPSS 17.0版使用单向方差分析。
3所示。结果
3.1。Trolox和德勤LC神经元的自发发射和压敏电阻器的电流
我们首先研究了抗氧化剂在LC神经元自发放电的影响。应用100μ6日11 M Trolox没有显著影响神经元(图1(一))。奇怪的是,在同等条件下,2神经元放电率增加(数据1(一)和1 (c))和3神经元表现出强烈的超极化,废除自发发射。在这种情况下可以恢复发射再极化膜电位通过电流注入(数字1(一)和1 (d))。比较平均的动作电位(APs)从测试(100μM Trolox)和控制(ACSF)神经元表明没有差异美联社形状经过180年代的治疗(数字1(一)和1 (b))。神经元的电生理特性,没有回应,那些超极化比较检查是否hyperpolarizing神经元受损。这种比较显示没有静止膜电位的差异,输入电阻、发射频率、和超极化后振幅。这表明超极化神经元不仅损坏或不健康的神经元(见补充表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/820285)。
(一)
(b)
(c)
(d)
压敏电阻器的电流是首先调查使用去极化的坡道(40 mV / s)的斜率是为了模仿自然在峰电位去极化时间间隔(见[16])。在这些实验(LC神经元)Trolox诱导异构反应(图2(一个))和8个神经元呈现向外微分电流的电流去极化的潜力。相比之下,只剩下6神经元表现出向外微分电流(数字2 (b)和2 (c))。第二个协议外加电压的步骤旨在迅速激活/禁用范围广泛的离子通道。当这个协议应用于神经元举行−88 mV的超极化电位,也观察到类似的结果,但在这种情况下,更倾向于内向电流(6 8神经元,数字2 (d)来2 (f))。重要的是,这一步脉冲协议只向外或向内电流(图生成2 (f)),和两个电流的存在斜坡协议(图2 (c))。这些结果表明,混合不同的压敏电阻器渠道直接调制Trolox和/或螯合的抗氧化活性物种,这效果是异构的人口内LC神经元。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
二硫苏糖醇(DTT;1毫米)也产生了不同的对19 LC神经元的自发放电活动的影响(图3(一个))。美联社开火并没有显著改变10神经元和被废除由于超极化(请参见图43 (c)),3个神经元停止美联社射击没有明显超极化(数字3(一个)和3 (d))。的一小部分神经元去极化后(2/19)增加了AP燃烧率(2 19;图3(一个))。美联社比较证明在美联社的形状(图没有差异3 (b))作为Trolox的情况。
(一)
(b)
(c)
(d)
压敏电阻器的电流响应后,观察德勤应用更多的异构比Trolox应用程序。9 LC神经元去极化的坡道的应用表明,7展出大量进口以最小的如果任何初始电流极化电位电流外,只和2个神经元表现出向外电流(数字4(一)来4 (c))。电压步协议应用于进一步10 LC神经元产生相同的特征depolarization-induced反应表现出内在的和5向外展示差动电流(数字4 (d)来4 (f))。电流的大小引起的电压斜坡和步协议在德勤治疗被Trolox大于电流诱导治疗(比较数据2 (c)和2 (f)与数据4 (c)和4 (f))。
(一)
(b)
(c)
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(e)
(f)
3.2。Trolox和德勤Cotreatment期间与线粒体Protonophore CCCP Ramp-Elicited电流
我们接下来研究了线粒体的抗氧化作用的行为,因为这些细胞器中活性氧的主要来源神经元和在Ca也扮演着重要的角色2 +缓冲(21]。要做到这一点,我们摄动线粒体代谢利用线粒体protonophore羰基氰化物法(CCCP)没有和cotreatment Trolox或德勤。
斜坡协议作为他们可以揭示压敏电阻器电流,包括那些流在峰电位区间[16]。挺(1μ米)诱导一个初始外微分(~ 20 mV−)紧随其后的是一个斜坡去极化(图期间内向电流5)。Cotreatment Trolox (100μ米)引起了一场小减少CCCP-induced微分输出电流之间的膜电位30 ~ 40 mV ~−−mV(图5(一个))。德勤cotreatment相比之下有一个更深刻的对CCCP-induced微分输出电流的影响。它向外部分逆转当前和降低到不到一半的峰值(图5 (b))。德勤co-treatment也将逆转可能从60 ~ 80 mV ~−mV,建议招聘不同的渠道和/或调制通道的离子的选择性。这些结果表明,抗氧化剂Trolox和德勤可以影响线粒体功能直接或通过改变现有神经元自由基。
(一)
(b)
3.3。Trolox和德勤治疗对胞质钙的影响2 +在控制条件下,线粒体膜电位,当线粒体功能受损
由于异构反应的性质产生的两种抗氧化治疗,我们下一个调查如果不同电流的激活与胞质钙有关2 +浓度([Ca2 +]c)在两个控制条件和那些线粒体功能受损。图6(一)表明,在控制条件下,无论是Trolox或者德勤治疗能够增加(Ca2 +]c,这表明Ca2 +激活途径没有参与离子电流的感应/调制这些抗氧化剂。挺添加到损害线粒体功能的时候,Trolox (100μ米)进一步增强CCCP-induced增加引起的Ca2 +]c(图6 (b))。相比之下,与德勤cotreatment(1毫米)没有影响(Ca CCCP-induced增加2 +]c(图6 (b))。(Ca Trolox-induced增加的后果2 +]c尚不清楚鉴于Trolox在调制效果低于德勤CCCP-related电压依赖电流(图5(一个))。
(一)
(b)
(c)
鉴于线粒体功能通常是依赖于线粒体膜电位(Ψm) [22),我们调查是否能够调节Ψm抗氧化治疗。CCCP(1的应用μ米)减少Ψm(图6 (c))。Trolox (100μ米)或德勤(1毫米)也减少了Ψm在某种程度上是由损伤线粒体功能的区别挺孤独(图6 (c))。应用抗氧化剂一起挺似乎协同引起了深刻的减少Ψm,德勤的效果最为明显的一个~ 70%减少Ψm发生(图6 (c))。重要的是,荧光水平10分钟后部分恢复到同一水平的冲刷抗氧化剂控制和/或受损的条件(图6 (c))。总的来说,这些结果表明,线粒体可能参与Trolox和德勤治疗引起的电流,但是这样的行动不太可能依赖于(Ca2 +]c。
4所示。讨论
许多在中枢神经系统神经元群体自发活动,包括核如LC和黑质(SN) [23,24]。这样持续美联社解雇是严格控制的,考虑到核如在大脑(LC项目广泛25),对大脑功能有重要影响。
自由基和氧化应激参与发起和/或发展的多种神经疾病,如阿尔茨海默病和帕金森疾病(26- - - - - -28似乎,干扰线粒体代谢的关键事件的发生这样的病态(29日]。在这里,我们表明,抗氧化治疗LC神经元,神经元的数量,建议参与许多神经系统疾病的进展30.,31日),产生异构反应在这些神经元当标兵活动。我们的研究结果表明,在LC神经元有一个群,对自由基更敏感内容和顺向调制起搏器的活动。这将打开的可能性这个神经元族群尤其脆弱,可能发生细胞凋亡或坏死在特定的神经系统疾病的发病。
信用证是最集中的去大脑中的神经元,和it项目和跨许多大脑区域释放去甲肾上腺素(32,33]。LC神经元参与神经病理,尤其是帕金森病(PD),提出了由于高水平的LC神经元变性在PD患者和观察到,因为信用证中起着重要的作用在疾病的早期阶段31日,34]。提供进一步支持这一假设的事实病变LC神经元增加的敏感性SN神经元的侮辱(35,36),同时部分破坏SN和LC神经元放缓复苏在帕金森病动物模型(30.]。此外,药理刺激LC神经元传授一些抵抗SN神经元在动物模型;帕金森病(37)和转基因动物提高去神经支配似乎相对不受侮辱SN神经元(38]。因此LC神经元死亡的可能是一个主要因素在PD的发病与随之而来的损失去信号导致多巴胺能神经元的SN的损失。氧化应激是PD神经元死亡的主要原因之一(39)使LC神经元的发现有亚种群高度敏感的自由基的相当大的兴趣。
我们的研究结果表明,Trolox和德勤诱导异构反应LC神经元起搏(数字1- - - - - -4),建议一个微分灵敏度抗氧化剂(或自由基内容)在LC神经元亚种群。大部分的神经元表现出没有检测到的发射率(数据变更1(一)和3(一个))。然而,Trolox和德勤透露另外两个反应和推理神经亚种群:第一个超极化和减慢或停止起搏活动,而第二造成去极化和发射率(数字的增加1和3)。这些观察结果是令人惊讶的,因为LC神经元通常被认为是相当均匀对其电生理特性,和以前的结果从我们组发现没有神经电生理差异人口,我们的实验是由(14,16,40]。电压钳实验证实了异质性我们在实验中观察到的LC神经元,作为抗氧化剂的应用程序同时显示两种类型的反应在斜坡或脉冲应用(数字2和4)。另一个重要的发现来自我们的Ca2 +相比之下,成像实验,应用抗氧化剂(Ca没有产生变化2 +]c(图6(一))。这表明,我们观察到的影响是由于神经细胞自由基含量的变化而不是[Ca的变化2 +]c。Trolox治疗小影响压敏电阻器的电流(图5(一个)然而德勤)治疗产生了深远的影响。DDT部分逆转CCCP coapplication引起的电流(图5 (b)),这种效果不太可能由Ca2 +]c(图6 (b))。线粒体的作用被表示为抗氧化剂改变Ψm应用单独或结合CCCP(图6 (c))。
发现响应的两种神经元的亚种在LC抗氧化治疗可能是相当重要的我们的环境和生理条件的理解,导致神经系统疾病的发展。很难将描绘这群最不利影响自由基含量的变化。回应抗氧化剂的分组人口超极化将受抗氧化剂,保护,当标兵,因此燃烧速度会减慢或停止,从而节约能源,加速恢复时间在缺氧的情况下(41]。废除射击也防止压敏电阻器Ca的激活2 +渠道和随后的增加(Ca2 +]c。这将减缓活动在所有Ca2 +端依赖途径。
控制(Ca2 +]c是基本的重要的凋亡和/或坏死通路可以由不受控制的增加(Ca吗2 +]c(42,43]。相比之下,在神经元群抗氧化剂产生去极化和高发射率将强调这样的治疗。我们不知道一些细胞应对机制向内或向外电流后抗氧化剂的应用程序。然而,如果这些行为是由于改变自由基含量,然后“清理”自由基未必保护细胞。考虑到特定的神经病理与自由基的增加,然后强调了这样一个事实,即抗氧化治疗可能需要仔细评估。
总之,我们的研究结果表明,有一个小在LC神经元群响应抗氧化剂,以及在此基础上,这是由于改变自由基,这个族群的成员可能更受细胞凋亡或坏死。我们相信,这里给出的结果代表了一个重要的步骤为我们了解自由基导致的神经病理学(比如LC损失在帕金森疾病)和表明抗氧化剂治疗之前必须仔细评估管理。
缩写
| ACSF: | 人工脑脊液 |
| 记者: | 动作电位 |
| : | 胞质浓度 |
| 挺: | 羰基氰化物m-chlorophenyl腙 |
| 中枢神经系统: | 中枢神经系统 |
| 德勤: | 二硫苏糖醇 |
| LC: | 蓝斑 |
| 帕金森病: | 帕金森病 |
| TTX: | 河豚毒素 |
| 虚拟机: | 膜电位 |
| Ψm: | 线粒体膜电位。 |
确认
这项工作是支持的澳大利亚国家健康与医学研究理事会和猎人医学研究所。
补充材料
补充材料提供了一个比较LC神经元的电生理特性处理100µM Trolox超极化和神经元,提出了与这种治疗没有变化。结果显示没有分析参数的变化(美联社振幅除外),表明这个子的超极化是一种内在的反应神经人口。