文摘

在各种癌症细胞系,白血病细胞系HL-60紫草素最敏感,有证据显示prooxidative活动和proapoptotic微摩尔的紫草素浓度的影响。然而,参与细胞毒性机制submicromolar紫草素的范围没有充分的特点。利用生物化学和自由基生物学实验在体外,我们确定了紫草素的prodifferentiated概要文件和评估过程中的氧化还原内稳态HL-60分化。数据显示一个强大和紫草素暴露剂量反应关系的特点HL-60分化的形态变化,氮蓝四唑(电视台)还原活动,和表面抗原CD11b / CD14表达水平。药物暴露期间,细胞间氧化还原内稳态变化对氧化是必要的支持Shikonin-induced分化,这是证明额外的酶和non-enzymatic氧化还原调节器。一个统计上显著的增加存在剂量依赖的相关性()是记录方面的独特表达水平Nrf2 /下游靶基因在HL-60细胞发生分化,进一步恢复与紫草素治疗抗氧化剂使用。我们的研究表明,紫草素differentiation-inducing代理,和其机制涉及Nrf2 /通路调节细胞氧化还原内稳态,从而促进分化。

1。介绍

急性髓系白血病(AML)的特点是不受控制的未分化或低分化的骨髓增殖爆炸。分化疗法是另一种治疗AML基于诱导白血病细胞的成熟分化块之外,可恢复正常的细胞表型和细胞周期阻滞1]。HL-60细胞的研究进行一个细胞系,原本孤立的急性早幼粒细胞白血病病人,是一个良好的模型为研究终端分化事件。大量的化合物是已知的在HL-60细胞诱导分化,包括细胞因子、极坐标平面化合物,嘌呤和嘧啶类似物,化疗药物。这些药物通过各种机制发挥分化的影响,其中包括以下几点:染色质重塑,hypomethylating DNA,抑制组蛋白脱乙酰酶,抑制拓扑异构酶,干扰DNA和RNA合成,干扰信号转导(2]。

在AML的背景下,增加氧化应激在骨髓白血病可能确实代表一个治疗的目标,和早期的令人鼓舞的结果在体外研究和临床试验表明,活性氧(ROS)调制治疗骨髓白血病患者有必要进一步研究,特别是在信号转导(3]。然而,观察在这方面是有争议的,因为prooxidant或抗氧化剂的方法似乎是有益的。例如,三氧化二砷和雄黄被批准用于治疗复发急性早幼粒细胞白血病(APL)由于其prooxidant属性(4,5]。我们之前的研究表明,抗氧化剂isoliquiritigenin能够导致白血病细胞(单核细胞的分化6),但具体机制尚不清楚。细胞内巯基氧化还原环境被认为影响许多细胞过程包括分化。减少谷胱甘肽谷胱甘肽是最丰富的细胞内硫醇,因此细胞内氧化还原内稳态的主要监管机构(7]。有许多redox-sensitive转录因子,包括Nrf2 AP-1, c-Jun, Bach1 NFκB、IKKβ亚基,干扰素调节因子3、p53和Pax-8,每一个都可能导致氧化还原内稳态在细胞分化的影响。越来越多的证据表明,Keap1-Nrf2激活可以改变分化的结果;然而,影响不同的刺激来抑制分化根据细胞类型以及化学性质和剂量的刺激用来调节Nrf2 [8]。

在寻求新的治疗AML,天然产品源自中国传统医学(中医)临床人才的吸引力,由于久经考验在中国使用传统疗法的效果,也就是说,Pishuang(三氧化二砷)和Xionghuang(鸡冠石)。紫草erythrorhizon摘要。调查。,referred to as “Zicao” in Chinese and “Shikon” in Japanese, is a plant that grows in the western Xin Jiang region of China and is used as a “heat clearing and blood cooling” medicine. Zicao root extracts have been used in Chinese traditional medicine for many years as a cancer treatment [9]。其用于这个目的,然而,缺少从几个当前中医药典和可能比描述的应用程序已经不太常见。紫草素,Zicao根的主要萘醌化合物,最近有报道prooxidative活动和proapoptotic对各种癌症细胞的影响(10]。回顾文献在AML的治疗,没有数据被发现紫草素和prodifferentiated效应之间的联系。为了更好地理解紫草素的化疗效果,本研究旨在确定紫草素在HL-60细胞诱导分化。我们还研究了细胞氧化还原内稳态的作用与紫草素治疗。

2。材料和方法

2.1。试剂

紫草素购买从成都Biopurify植物化学物质有限公司(纯度98%,成都,中国)。胎牛血清(的边后卫)从四季青购买(杭州四季青有限公司,中国)。氮蓝四唑(电视台),甲基噻唑基四唑(MTT)、赫斯特33258年和33342年,phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), 2, 7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(H₂DCFDA),自旋,R-buthionine sulfoximine (BSO)、过氧化氢酶(CAT)、N-acetyl-L-cysteine (NAC)、超氧化物歧化酶(SOD)、钛试剂(4 5-dihydroxybenzene-1 3-disulfonate)、谷胱甘肽二乙酯(GSH-EE)和二甲亚砜(DMSO)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。5-chloromethylfluorescein二乙酸(CMF-DA)购买的分子探针(尤金,或者美国),和庆大霉素是来自山东日出药业有限公司,有限公司(淄博,中国)。所有其他化学试剂均为分析纯,商用。

2.2。细胞培养和治疗

从写明ATCC HL-60细胞购买(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养Iscove修改杜尔贝科的介质(写明ATCC)与谷酰胺,10%的边后卫和10μg / mL庆大霉素37°C的5%股份₂。对所有实验,HL-60细胞被播种在0.3×10⁶细胞/毫升。细胞治疗紫草素72 h表示浓度的单独或结合氧化还原调制器4 h紫草素治疗前预处理。预处理后,介质代替避免添加剂或氧化还原调节器之间协同互动和紫草素。使用的浓度氧化还原调节器如下:猫(25 U /毫升),南京(100毫米),钛试剂(200μ米),GSH-EE(2毫米),BSO(5毫米)。

2.3。细胞生存能力分析

紫草素的细胞毒性活动使用MTT试验评估。HL-60细胞收获指数增长阶段和镀在96 -孔板。紫草素制备在DMSO,随后用培养基稀释前使用。最后DMSO溶液的浓度小于0.1%。车辆对照组收到了相同数量的DMSO溶液。细胞暴露在紫草素72 h,然后10μL 5毫克/毫升的MTT被添加到每个4 h。150年的反应被添加μL (DMSO,吸光度(一个)在550 nm由分光光度法(美国3001年Varioskan Flash,热)。细胞抑制率计算×100%(对照组一个值−实验组一个值)/对照组一个值。

2.4。测定细胞分化

细胞分化的两个形态分析被用于这项研究。HL-60细胞培养0、50、75和100 ng / mL 72 h的紫草素。治疗后,单细胞悬浮体是准备和加载到一个离心管在1000×g cytospin离心机离心分离。幻灯片与甲醇固定、脱水和染色染色染10分钟了。解决方案。染色后,幻灯片是在去离子水冲洗之前再风干光学分析。观察细胞核的形态学变化,冷PBS Shikonin-treated细胞被洗两次,与4%多聚甲醛固定,沾染了赫斯特33258年(2.5毫克/毫升)。细胞被评估关于大小,规律的细胞边缘,和细胞核的形态特征11,12]。使用荧光显微镜观察样品(Axio观察者、蔡司、德国)。分化的程度是由细胞的能力减少化验氮蓝四唑(电视台)不溶性蓝黑色甲瓒在PMA刺激。每个细胞悬液(100μL)与同等体积的混合2含有1毫克/毫升溶解在PBS电视台μg / mL PMA和孵化为30分钟37°C。的反应是停止添加0.4毫升的冷2 M盐酸。甲瓒产品离心得到的样品在700 g×10分钟。上层清液被丢弃,有色甲于600年解散μDMSO的L。NBT-positive细胞的百分比与甲瓒存款在细胞质中由572海里的分光光度法。数据表示为控制的百分比值。

2.5。测定细胞内ROS、谷胱甘肽和GSSG /谷胱甘肽

细胞表明化学(s)治疗,疗程4 h, PBS清洗和处理20μM H₂DCFDA(例/ Em = 488海里/ 525海里)或5μM CMFDA(例/ Em = 492海里/ 517海里)30分钟的37°C。细胞与PBS洗两次,和相对荧光强度被分光光度法阅读。ROS、谷胱甘肽水平计算的平均荧光强度(MFI)每1000 nonnecrotic细胞,和测量的探针在单个细胞进行使用荧光显微镜。细胞数量的计算是通过染色与赫斯特和propidium-iodide(π)13,14]。标准曲线是由一系列的细胞数量在96 -孔板从5×10⁶5×10³。收集细胞,用混合与1.15μ赫斯特- 33342 g / mL或20μg / mL的π染料1:9比和保持在37°C为30分钟。DNA-associated赫斯特和π荧光测量在460 nm和620 nm,分别。减去坏死细胞(Pi染色细胞)细胞的总数(赫斯特染色细胞)给nonnecrotic细胞的数量在每个治疗。至于GSSG /谷胱甘肽的测定,Shikonin-treated细胞离心收集的500 g×10分钟,用PBS洗两次。收获细胞蛋白质去除试剂和涡大力resuspended。样本与液氮快速冻结,解冻两次37°C,然后在4°C 5分钟。上层清液通过离心收集在10000 g×10分钟。GSH / GSSG比率确定使用谷胱甘肽和GSSG分析工具包(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)根据制造商的指示。

2.6。RNA提取和实时rt - pcr

分析CD11b / CD14的表达水平(72 h紫草素治疗后)和Nrf2下游靶基因(4 h紫草素治疗后),细胞被视为表示,用PBS和收集。表中描述的引物序列1(12,15- - - - - -18]。RNA使用EZ-10旋转列从细胞中提取总RNA Minipreps超级装备(生物基本Inc .)根据制造商的指示。2微克的RNA /样本转化为互补使用PrimeScript RT试剂盒(豆类)。相对基因表达是量化使用实时PCR(美国试剂盒转子基因Q) SYBR-Green工具包(试剂盒),使实时PCR检测产品根据制造商的协议。使用底漆的互补脱氧核糖核酸是提交给实时PCR对如下考虑。PCR引物”(由上海Sangon合成生物技术有限公司)循环条件如下:5分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期30年代,Tm (°C) 30年代和30年代72°C。目标mRNA的相对量的计算方法。每个样本进行了分析使用glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内生参考基因mRNA正常化。

2.7。统计分析

有三个复制至少表现在每一个实验。获得的数据从不同的实验提出了均值±标准差的至少三个独立实验方差分析和评估。学生的t以及多个组间比较是用来识别差异。值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。紫草素抑制HL-60细胞的增殖

先前的研究已经确定最优proapoptotic紫草素的剂量范围是1.25到10μmol / L(360到2883 ng / mL) [19]。实验研究中使用较低的紫草素浓度范围(25到1600 ng / mL)研究其抑制HL-60增殖。

收集细胞的最佳时间点设定在72 h是基于以前的观测HL-60细胞(6]。HL-60细胞增殖抑制剂量依赖性的方式相比,对照组72 h后的治疗,而抑制率表现出明显的“S”形曲线(图1(一))。随着紫草素的浓度的增加从50到200 ng / mL,有一个快速增长的抑制率。在100 ng / mL,紫草素抑制率为48.1%,这几乎相当于IC₅₀价值。紫草素的低浓度(< 100 ng / mL)抑制HL-60细胞增殖,但是没有观察和坏死细胞有凋亡细胞(图1 (b))。这些结果表明,紫草素的抑制作用HL-60细胞增殖并不是由于HL-60直接杀死细胞。因此,我们选择了一个相对较低的浓度范围从0到100 ng / mL研究机制参与nonkilling影响下列实验。

3.2。紫草素诱发HL-60细胞的形态学变化

细胞生长的影响下迅速紫草素时表现出的特点更成熟的细胞的形态学变化,在单核细胞的途径。如图1 (b)染色和赫斯特染色未分化的控制HL-60细胞被发现与轮主要是髓细胞,正常细胞的利润率和大核,这表明细胞高度恶性的DNA合成和快速扩散。

治疗与紫草宁表示浓度导致了增加了细胞的大小和减少nuclear-cytoplasmic比率,表明这些细胞活跃度较低对DNA合成。没有马蹄形态学观察细胞核的未经处理的细胞,但这种形态显然是观察细胞核的细胞用紫草素治疗,这表明单核细胞的分化。此外,马蹄形的人口核紫草素治疗后显著增加剂量依赖性的方式(图1 (b))。

3.3。紫草素增加电视台还原HL-60细胞活动

HL-60细胞可以分化成吞噬细胞,当激活,产生超氧化物阴离子作为一个方法来消除吞噬病原体。测量生产超氧化物阴离子通过电视台分析提供的信息分化状态(20.]。因此,本试验进行了展示紫草素的诱导分化成熟。在Shikonin-treated细胞,电视台还原活动增加剂量依赖性的方式治疗72 h后,表明紫草素可以诱导HL-60细胞分化(图1 (c))。

3.4。紫草素增加CD11b和CD14的mRNA表达HL-60细胞

myelomonocytic和单核细胞的表面标记物的表达CD14和CD11b HL-60细胞分化的重要特征之一(12,15,21,22]。确认分化Shikonin-treated HL-60细胞,CD11b和CD14基因表达水平的确定。结果表明,CD11b和CD14的信使rna表达水平升高了紫草素治疗剂量依赖性的方式(图1 (d))。

3.5。细胞的氧化还原内稳态转向氧化Shikonin-Induced HL-60细胞分化

荧光探针H₂DCFDA和CMF-DA被用来评估的水平细胞内ROS、谷胱甘肽氧化还原产品HL-60细胞(图2(一个))。紫草素的曝光时间仅限于4 h, ROS事件发起的时间框架药物引起的分化之前,以前作品中描述(3]。荧光光纤的相对密度(平均ROS生产)显著增加紫草素治疗范围从0到100 ng / mL,而相对CMF荧光密度(平均生产谷胱甘肽)减少反向紫草素浓度(数据2 (b)和2 (c))。定义精确的变化在细胞间的氧化还原内稳态,总数的比率减少谷胱甘肽,谷胱甘肽氧化产品GSSG紫草素治疗后进行了分析。结果表明,用紫草素治疗持续减少了GSH / GSSG比率(图2 (d))。

3.6。细胞氧化还原内稳态密切与Shikonin-Induced HL-60细胞分化

理解细胞内氧化还原内稳态的变化是否Shikonin-induced细胞分化的重要因素,有必要关联产生的ROS水平和/或谷胱甘肽与事件的程度。添加prooxidant BSO,如所描述的方法,显著增强活性氧降低Shikonin-treated细胞中谷胱甘肽(数字3(一个)和3 (b))。Shikonin-induced细胞分化进一步促进增强超氧化物阴离子的生产和CD11b mRNA表达水平的增加和CD14(数字3 (c)和3 (d))。

在这项研究中,酶和非酶的抗氧化药物被用来识别关键氧化还原事件参与Shikonin-induced分化。当谷胱甘肽前体南汽和GSH-EE补充道,谷胱甘肽生产与减轻活性氧增加,并发(数字3(一个)和3 (b))。在BSO预处理相比,谷胱甘肽前体抑制Shikonin-induced细胞分化显著减少电视台还原活动和CD11b mRNA表达水平降低和CD14(数字3 (c)和3 (d))。钛试剂,另一个非酶的抗氧化剂,也抑制Shikonin-induced细胞分化和显示出非凡的恢复影响Shikonin-induced减少谷胱甘肽(数字3 (b),3 (c),3 (d))。

SOD和CAT酶抗氧化代理后,函数作为ROS食腐动物,紫草素治疗前预处理,添加一个类似的趋势在抑制活性氧的生产也在谷胱甘肽(数据的恢复3(一个)和3 (b))。电视台还原动力学活动与mRNA表达水平CD11b和CD14的区分HL-60细胞SOD和CAT的存在数据所示3 (c)和3 (d)。个人添加的酶抑制Shikonin-induced HL-60细胞分化,和SOD比猫更强的抑制。此外,所有氧化还原调节器在当前工作证明没有明显影响HL-60分化和减少基础水平的电视台和CD11b / CD14表达(数据未显示)。

3.7。Nrf-2 /是信号通路参与应对紫草素治疗

主要Nrf2 /监管基因产物是nad (H):奎宁oxidoreductase-1 (NQO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S-transferase(销售税)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和过氧化氢酶(CAT) (3,7]。确定紫草素的differentiation-inducing效应与它能够激活Nrf2 /途径,分析了这些酶的信使rna表达水平。如数据所示4(一)和4 (e)猫的信使rna表达水平GPX被紫草素显著调节剂量依赖性的方式。在一个集中的100 ng / mL,猫的表达水平控制相比高出6倍。然而,其他基因的表达水平包括GR、消费税NQO1、和GCL来配合紫草素浓度增加抑制100 ng / mL(数字4(一),4 (c),4 (e))。

根据这些观察,我们可以更好地理解Nrf2 /信号通路在动力学响应紫草素治疗HL-60细胞。然而,增强或抑制细胞分化介导的氧化还原调节器从Nrf2 /信号通路还需要进一步详细说明。如图4 (b)、BSO预处理促进细胞分化并显示GPX基因的表达水平最高和最低的GR基因的表达水平与所有紫草素治疗。在其他团体证明抑制Shikonin-induced细胞分化,GPX表达水平下降,但GR表达水平增加在所有的组除了Tiron-treated组。有趣的是,这两种酶和非酶的药物更有效地猫基因表达水平降低而独自紫草素治疗(图4 (f))。紫草素的作用抑制GR,销售税,NQO1、GCL基因表达水平在不同程度上被预处理的抗氧化剂除了BSO(数字4 (b),4 (d),4 (f))。

4所示。讨论

Zicao被广泛应用为中医几千年来中国传统“清算和血液冷却热的治疗效果。Zicao”作为一个主要组成部分,紫草素最初是由日本化学家Majima纯化和黑田,及其药理作用特点,如加速组织肉芽增殖和发挥抗菌、抗炎和抗肿瘤效果23]。紫草素对各种肿瘤细胞发挥细胞毒性的报道行(23]。我们目前的研究发现,IC₅₀紫草素的价值HL-60细胞大约100纳克/毫升(3.47×10⁻⁷米),类似于一个国家报告(HL-60(结核病),日志₁₀集成电路₅₀=−7.5)(http://dtp.nci.nih.gov/网上(见补充材料)http://dx.doi.org/10.1155/2012/781516)。之前报道的数据表明,白血病细胞系癌症细胞系紫草素最敏感。紫草素的屠杀活动中观察到360到2883 ng / mL的细胞凋亡或坏死(19]。这些细胞毒性事件也观察到在目前的工作时,紫草素浓度高于200 ng / mL(数据未显示)。细胞抑制的影响不仅与细胞死亡是由紫草素的应用低剂量(≤100 ng / mL),但也强调白血病细胞紫草素的敏感性。

白血病细胞表现出不成熟的特性,比如不成熟发展和分散,大,不规则的原子核以及其他生化功能错误(1,3,24]。细胞形态学、NBT-reducing能力和细胞表面抗原的存在CD11b / CD14被认为是特定的标记HL-60细胞分化[20.- - - - - -22]。这些标识符为分化时广泛使用的现代药理是努力寻找新的中医AML化疗药物。目前的研究表明,Shikonin-treated单核细胞的成熟分化的细胞表现出特征的相对较小,变形核以及加强生产超氧化物阴离子和基因表达的增加细胞表面抗原CD11b / CD14。紫草素在50毫微克/毫升(0.174μ米)显示显著prodifferentiation活动72 h后治疗。在一项研究中剑的et al ., 0.1μM ATRA可以诱导显著HL-60细胞分化具有相同时间(25]。虽然有很长一段参数的差异这两个研究紫草素被证明是一个有吸引力的主要化合物在搜索新的AML化疗。proapoptotic活动几乎是证明prodifferentiation活动前三氧化二砷等中医和雄黄4,5,26]。这些研究报告,细胞生长的程度限制额外的制剂的剂量密切相关。建议代理展示其最初在分化细胞毒性,细胞凋亡和坏死和增加剂量(7]。这种现象类似于观察prodifferentiation影响HL-60细胞处理低浓度的紫草素(50到100 ng / mL)。

独特的活性氧代谢骨髓白血病可能代表一个治疗目标3]。紫草素的多种活性氧水平治疗是本研究的重点。我们观察到迅速增强ROS生产谷胱甘肽耗竭的初步效果Shikonin-induced HL-60细胞分化,与以前公布的协议proapoptotic报告(19,27]。紫草素也被报道产生活性氧和亲电子分子(28]。然而,其他文献显示,紫草素显示高效抗氧化活动对几种类型的活性氧,如单线态氧(¹O₂),超氧化物阴离子自由基()、羟基自由基(),叔丁基过氧化氢自由基()以及iron-dependent微粒体脂质过氧化(29日]。在这种背景下,一个简单的解释Shikonin-induced差异化很难给定的生产多种类型的活性氧。三个最重要的氧化还原系统内的细胞NADPH /辅酶ii⁺硫氧还蛋白()、谷胱甘肽(GSH / GSSG)。在这些系统中,谷胱甘肽(GSSG是最重要,因为谷胱甘肽浓度大约500 - 1000倍高于NADPH和硫氧还蛋白;因此,减少/氧化谷胱甘肽缓冲区的变化直接反映细胞内氧化还原变化耦合的各种细胞过程(7]。氧化还原内稳态被认为HL-60凋亡和分化中发挥重要作用[1,3,8]。的氧化还原内稳态GSH / GSSG Shikonin-treated细胞转向氧化剂量依赖性的方式,表明高水平的氧化应激诱导分化之前。

在分化确定氧化还原内稳态的决定性作用而不是死亡,需要更多的证据来验证这个想法通过酶和非酶的抗氧化剂的活性以及prooxidants紫草素治疗。准确度和氧化还原调节器分别前药物治疗被证明是一种合理的方法根据文献[30.,31日]。研究Krance et al ., VD₃治疗细胞孵化与马来酸二乙酯(谷胱甘肽depletor)其次是BSO表达较高的分化标记CD11b比未暴露的细胞(8]。此外,单独治疗BSO对控制细胞没有影响。Krance谷胱甘肽耗竭的系统中,谷胱甘肽depletor BSO似乎是薄弱。为了避免自我复苏HL-60谷胱甘肽的细胞,100μM BSO受雇于整个治疗持续的谷胱甘肽耗竭影响其他试剂。在我们的实验中,BSO和其他谷胱甘肽调节器用于预处理仅为4 h,当选择更高浓度的BSO(5毫米)谷胱甘肽耗竭的影响(图3 (b))。在这样的背景下,它可以接受的BSO和其他氧化还原调节器对基底的水平没有显著影响细胞分化标记。此外,HL-60细胞分化是增强与特定的谷胱甘肽的耗竭当使用BSO, GCL的选择性和不可逆抑制剂,坐标执行细胞质中的谷胱甘肽合成谷胱甘肽合成酶(7]。然而,HL-60细胞分化抑制增强谷胱甘肽生产时使用谷胱甘肽前体NAC GSH-EE。SOD是一个超氧化物阴离子清道夫,它催化的反应2+ 2 h⁺→H₂O₂猫,清除各种过氧化物。这项研究表明,SOD产生更强的抑制在Shikonin-induced HL-60细胞分化与猫相比。ROS和谷胱甘肽的具体调节器都足以用独特的方式中断氧化还原内稳态。然而,钛试剂,维生素E模拟,显示非特异性清除活性氧,表现出抑制对Shikonin-induced细胞分化的影响。虽然直接生产紫草素的ROS和超氧化物阴离子释放的参与HL-60细胞NADPH氧化酶可以排除,这里给出的数据显示参与Shikonin-induced分化机制。增强活性氧产量除了submicromolar浓度的谷胱甘肽耗竭紫草素诱导轻微压力HL-60细胞,导致细胞间的精细调制氧化还原体内平衡促进分化(3,4,7,23]。

基于上述讨论,我们阐述了一个假说解释了可能的反应参与Shikonin-induced HL-60细胞分化。在各种信号通路,Nrf2 /通路和细胞内氧化还原体内平衡是紧密相连的1]。证据表明监管角色Nrf2 /途径提供抗氧化剂谷胱甘肽和其他缓冲ROS和其他亲电子分子(1,8]。艾哈迈德et al .,研究的结果表明,紫草素能够诱导Hsp70在0.1μM (28.8 ng / mL)的3 h治疗,这也显示出显著增加Nrf2-mediated氧化应激反应在骨髓细胞株U937、HL-60密切相关的一条线^”年代(32]。因此,我们试图确定紫草素的应用引起的微分表达式Nrf2下游靶基因参与氧化还原HL-60细胞的变化。谷胱甘肽系统的建设上面所提到的,GCL, GR执行谷胱甘肽合成的关键酶,催化亚基是一个异质二聚体,由一个(GCLC)和调节亚基(GCLM) [17]。GPX负责谷胱甘肽氧化GSSG, H₂O₂(7]。建议紫草素抑制基因表达的酶(GR、GCLC GCLM)但增强GPX基因表达水平,以弥补目前研究的谷胱甘肽耗竭。销售税还负责减少物质的转换和消费(谷胱甘肽)33]。的主要代谢功能NQO1是对苯二酚的醌类消费的减少还原性物质(NADPH)。嵌入式清除NQO1活动是有吸引力的,因为它可以发挥潜在作用的有害后果最小化代对苯二酚氧化还原活跃,也引出了这样的问题,这种效应的相关性在细胞有更高效的系统等超氧化物清除草皮(34]。我们观察到减少消费税和NQO1紫草素表达水平,由预处理明显恢复所有的测试除了BSO抗氧化剂。这些结果表明,生产对苯二酚和glutathione-S-conjugates减少。再加上紫草素的氧化应激诱导治疗,这些发现强调销售税的敏感性对谷胱甘肽耗竭的回应。紫草素的高剂量导致人类神经胶质瘤细胞凋亡通过阻断细胞内氧化还原内稳态,其中包括和差别的猫对这些SOD-1 upregulation以及减少bcl - 2和伯灵顿表达水平增加28]。然而,我们的研究表明,猫的基因表达水平显著调节结合GPX清除H₂O₂由紫草素治疗。我们注意到酶和非酶的抗氧化药物减少了猫,GPX基因表达水平独自紫草素治疗相比更有效率。此外,治疗BSO导致谷胱甘肽耗竭除了GPX基因的表达水平最高。这证据表明酶发挥重要作用在Shikonin-induced氧化应激反应加上谷胱甘肽耗竭以及H₂O₂生产。总之,如图5,这些变化主要Nrf2 /监管基因产物显示一个独特的方法Shikonin-induced HL-60分化。

总的来说,我们的研究是第一个调查的prodifferentiation紫草素对HL-60细胞,特别是氧化还原内稳态的作用在调节HL-60细胞分化。还需要进一步的研究来解释的确切机制,激活Nrf2信号通路和其他的参与C / EBP转录因子家族在紫草素治疗。

缩写

AML:	急性髓系白血病
是:	抗氧化反应的元素
BSO:	条件下,R-buthionine sulfoximine
猫:	过氧化氢酶
CMF-DA:	5-chloromethylfluorescein二乙酸
DMSO溶液:	二甲亚砜
的边后卫:	胎牛血清
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
GCL:	谷氨酸半胱氨酸连接酶
GCLC:	谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基
GCLM:	调节谷氨酸半胱氨酸连接酶的亚基
GPX:	谷胱甘肽过氧化物酶
格:	谷胱甘肽还原酶
谷胱甘肽:	减少谷胱甘肽
GSH-EE:	谷胱甘肽酸二乙酯
GSSG:	氧化谷胱甘肽
销售税:	谷胱甘肽S-transferase
H2DCFDA:	2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸
麻省理工:	甲基噻唑基四唑
南京:	N-acetyl-L-cysteine
电视台:	氮蓝四唑
NQO1:	是nad (H):奎宁oxidoreductase-1
Nrf2:	NF-E2-related因子2
PMA:	Phorbol-12-myristate-13-acetate
ROS:	活性氧
SK:	紫草素
SOD:	超氧化物歧化酶
中医:	中国传统医学
钛试剂:	4、5-dihydroxybenzene-1 3-disulfonate。

作者的贡献

这些作者的贡献同样。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。30960451),主要国家基础研究发展计划(2010 cb535003),新疆生产建设兵团关键技术项目(2010 gg36),问:郑的杰出青年科学家基金,以及国际合作项目(2012 bc001)。

补充材料