文摘

客观的。评估慢性ASA治疗以防止心脏病变的能力,增加氧化应激在cardiomyopathic仓鼠。方法和结果。男性叙利亚cardiomyopathic和年龄内在控制仓鼠ASA口头收到60天的时代。动物牺牲,享年150岁,250年,350天评估心脏肥大的时间进程和心血管组织超氧化物阴离子()生产。岁150天,心室重量/体重比值,静息心率和心血管疾病生产更高在cardiomyopathic仓鼠比控制。岁250天,除了这些参数随年龄的不断恶化,血压开始下降,心脏衰竭的迹象出现。在这些cardiomyopathic仓鼠,慢性ASA治疗(a)完全阻止升高生产和NAD (P) H氧化酶活动,(b)显著减慢心脏肥大和纤维化的发展。结论。慢性ASA治疗显著防止心脏功能和结构的恶化以及氧化应激增加cardiomyopathic仓鼠。我们的研究表明,亚撒了防止心脏功能障碍的治疗潜力。

1。介绍

叙利亚的黄金仓鼠cardiomyopathic应变是一个遗传性心肌病模型,模拟人类逐渐进展的充血性心力衰竭(1]。这个动物模型有一个进步nonpressure过载心脏疾病源自遗传代谢异常,诱发退行性损伤在所有横纹肌心中特别的一致性和强度(2]。这种类型的心肌病的特点是心室肥大进展到扩张的充血性心力衰竭疾病的后期。颞病理发展可分为四个阶段:prenecrotic(25 - 30天),坏死(70 - 75天),肥厚性(125 - 150天)与发展扩张(225 - 250天),和严重心力衰竭(325 - 350天)(1]。

疾病的生理病理学状态不是完全理解,但先前的研究显示一个应对肾素-血管紧张素系统的特点是较高的等离子体和心室血管紧张素ⅱ浓度(3),更高的心室血管紧张素转换酶(ACE)活性(4),和一个upregulation cardiomyopathic仓鼠的心脏血管紧张素ⅱAT1受体(5]。血管紧张素转换酶抑制剂如quinapril管理局(4)或卡托普利(6)保持收缩功能和/或增加在这些动物的存活率。

之前的数据显示,血管肾素-血管紧张素系统和氧化应激中发挥关键作用的产生原发性心肌病,心脏衰竭(7]。Angⅱ被证明能增加心血管组织NAD (P) H氧化酶活动和刺激心血管生产(8]。这种氧化机制被认为发挥重要作用在Ang-II-mediated营养心血管组织肥厚和高血压等心血管变化(9]。

阿司匹林(乙酰水杨酸(ASA))是一种抗炎药物和心血管保护与强有力的抑制特性cyclo-oxygenases负责花生四烯酸代谢和前列腺素的生产。虽然亚撒没有直接影响心血管功能,这种药物已报道提供有效有益的保护许多心血管病理条件下,如动脉粥样硬化、缺血性心脏病,心肌梗塞。我们先前的研究已经表明,亚撒是一种有效的抗氧化剂,显著降低了血管生产通过减少血管NAD (P) H氧化酶活动在正常和高血压大鼠(10]。因此,我们的假设是亚撒,通过抑制NAD (P) H氧化酶活动,防止心血管结构和功能改变cardiomyopathic仓鼠。

本研究的目的是评估长期的心血管和抗氧化效果的ASA在开发管理cardiomyopathic仓鼠的心脏结构和功能改变。

2。方法

2.1。动物

研究进行36岁男性cardiomyopathic仓鼠(厘米,瑞士法郎146)和叙利亚的同龄男性的内在控制(Cntrl CHF148)从加拿大购买混合农场(NS,加拿大)。单独的动物被安置在温控房间6点到下午6点光暗周期。每种类型的动物是分为安慰剂,ASA-treated组。ASA治疗60天岁开始,一直持续到实验的最后(除非另有说明)。动物被赋予自由获取饮用水。对于安慰剂组,他们的饮用水是免费的任何药物,而阿司匹林了饮用水的仓鼠。饮用水中阿司匹林的浓度调整在每个动物的饮酒卷以确保治疗剂量为100毫克/公斤/天。从每组六个仓鼠牺牲岁150天,250天,350天。

测量血压和心率与股动脉中空方法在全身麻醉下的氯胺酮和甲苯噻嗪(90/5毫克/公斤坜)前动物斩首。导管连接到压力传感器(MX860,助理医生Inc .卡尔斯巴德,CA)连续记录的动脉血压和脉搏率超过10分钟通过病人监护仪(型号206 el、协议系统,Inc .,俄勒冈州比弗顿的,或)。心脏和胸主动脉被迅速切除,沉浸在冰冷的Krebs-Hepes缓冲溶液包含(更易/ L): 99.01氯化钠,氯化钾4.69,1.87氯化钙,MgSO4 1.20, K2HPO4 1.03, 25.0 NaHCO3 Na-Hepes 20.0, 11.1(饱和与95%葡萄糖O₂和5%的公司₂,pH值7.40)。心脏被和切割后,心室重和主动脉periadventitial组织是小心地删除。心尖的部分切成0.5毫米厚,大约10毫克片在主动脉切成2毫米为O环段₂测量。其他心脏和主动脉组织在液态氮冷冻,保存在−80°C到化验。

在初步研究中,8个250天的CM仓鼠治疗与安慰剂或ASA(100毫克/公斤/天)为7天。与安慰剂组相比,ASA治疗没有修改任何心血管参数(心室/体重比值、心率、血压)。然而减少心室和主动脉观察生产(数据没有显示)。

所有实验程序依法进行指导的加拿大委员会动物保健机构和监控的保健委员会。

2.2。超氧化物阴离子测定

超氧化物阴离子()生产使用lucigenin-enhanced化学发光测定方法如前所述[11]。10分钟后,平衡在Krebs-Hepes缓冲在室温下,主动脉环或心肌片被转移到一家闪烁包含5瓶mol / L lucigenin确定基底的水平。化学发光是记录每分钟15分钟的液体闪烁计数器(图尔库Wallac 1409年,芬兰)转向out-of-coincidence模式。最后统计,新鲜心脏和主动脉瓣环组织称重。数据被表示为cpm每毫克组织。

评估的内在NAD (P) H氧化酶活动,一种NAD (P) H氧化酶抑制剂,diphenyleneiodonium (100 DPImol / L)是用来确定DPI-inhibitable生产。主动脉瓣环或心脏切片与DPI孵化第一10分钟前在室温下生产评估。DPI-inhibitable生产计算的差异生产的观察到的存在和没有DPI。

2.3。NAD (P) H氧化酶亚基p47phox免疫印迹分析

在液态氮冷冻心室组织。溶解和西方印迹进行如前所述[12)与20克的蛋白质在凝胶加载。蛋白质分离(迷你凝胶千变万化的II系统,Bio-Rad)然后转移electrophoretically硝基论文70 V 90分钟。转让后,膜被洗了两次,然后孵化PBS中含5%脱水牛奶在室温下2 h。这些墨迹被孵化与特定的抗体p47phox (H195, sc - 14015,圣克鲁斯生物技术)与1/2000稀释。antibody-antigen复合物被检测到第二抗体(山羊anti-rabbit IgG-HRP, 1: 4000年,圣克鲁斯生物技术)。膜暴露在柯达X-Omat蓝色电影(美国柯达,罗彻斯特,纽约)2分钟。的微凝胶扫描,乐队是评估使用接穗形象4.0.2 (Scion公司,弗雷德里克,医学博士,美国)。结果为每个条件的值除以正常近交仓鼠没有阿司匹林治疗估计的相对大小的变化。的肌动蛋白(42 kDa)用作p47phox表达我们的加载控制实验。缓冲溶液中使用的所有试剂购买从西格玛化工有限公司

2.4。心室纤维化

心被浸泡在福尔马林溶液24 h。两个横截面上的心得到1毫米的间隔之间的中途基地和心脏的顶点。心室纤维化决心从组织获得两个横截面。这些组织脱水和嵌入在石蜡,4部分被削减。代表两个截面的部分每个心沾picrosirius红色。这些部分被安装在一个幻灯片投影放大20 x。数字图像的整个部分是获得使用计算机软件(美国CA Aperio技术)。心肌纤维化的程度是评估使用积极的像素计数算法作为胶原蛋白染色的面积被表示为一个心肌组织总面积的百分比。

2.5。数据分析

数据表达的意思扫描电镜。统计比较是由单向方差分析多变量图基试验紧随其后。被设定为临界水平的意义。

3所示。结果

3.1。体重和心脏肥大

与纯系控制仓鼠相比,CM仓鼠的体重显著降低在所有年龄组(图1(一))。两个菌株的体重(控制和CM仓鼠)在研究期间保持稳定并没有修改ASA治疗。

心脏肥大是评估通过测量心脏心室重量/体重的比率在150年的年龄,(图250和350天1 (b))。心室/体重比值保持低而稳定的内在控制动物整个研究期间。在CM中这个比例随着年龄的增长逐渐增加仓鼠的初始值在150天在250天在350天(每个与它以前的数据)。ASA治疗减少心室/体重比因为岁150天,然后部分阻止这个比例随着年龄的增加在CM仓鼠(图1 (b))。ASA治疗没有任何影响心室/体重比内在控制仓鼠。

3.2。心率和血压

心率(HR)是稳定的内在控制仓鼠在整个研究期间(HR变化从199年到214年平均的击败/分钟),而人力资源是高厘米仓鼠比他们的年龄的内在控制动物时代以来的150天(击败/分钟),达成岁甚至更高水平的350天(击败/分钟)(与控制)(图2(一个))。ASA治疗显著放缓人力资源增加CM仓鼠。然而,亚撒没有任何修改的管理人力资源的内在控制的动物。

收缩压(SBP)、舒张压(菲律宾)血压控制和厘米之间的类似仓鼠岁150天(控制123/82与CM 120/79毫米汞柱)。此后,这些压力随着年龄不断下降的SBP和毫米汞柱和菲律宾和毫米汞柱在250和350天的CM仓鼠,分别显著低于同龄的控制()。与此同时,天生的控制动物的血压保持稳定。ASA治疗显著预防血压降低在CM仓鼠无需修改血压与内在控制仓鼠(图2 (b))。

岁开始的250天,CM仓鼠开始展示一些心力衰竭的迹象,如减少食物摄入量,水肿,腹水(数据没有显示)。

3.3。心室纤维化

心室组织纤维化的程度是评估在350天的控制和CM仓鼠治疗与安慰剂或亚撒。组织的纤维化的比例要高得多在CM组(与控制(%)相比%,,图3)。这种高水平的纤维化在CM仓鼠降低了35% (ASA治疗后与接受安慰剂的厘米),但没有改变ASA-treated对照组观察。

3.4。心室和主动脉超氧化物阴离子生产

心脏心室和主动脉组织生产是天生的控制和评估厘米仓鼠在150岁,250年,350天。心室生产高厘米仓鼠比他们的年龄控制。这种高水平的产量随着年龄的增加不断在CM组的基础水平cpm /毫克组织岁150天cpm /毫克组织岁350天,虽然水平保持低而稳定的对照组(图4(一))。ASA治疗规范化高架心室在所有年龄组的CM仓鼠(生产而与接受安慰剂的厘米),但只有略微减少了生产在所有年龄组的内在控制的动物。

类似的结果观察主动脉生产(图4 (b))。主动脉生产,,cpm /毫克组织在150 - 250和350 -天控制动物,分别。与对照组相比,主动脉产量提高了20%,26%,31% ()与CM仓鼠。ASA治疗完全规范化这个升高生产水平,,cpm /毫克组织3厘米仓鼠的年龄组(与安慰剂组厘米)。然而,ASA治疗效果不显著的天生的对照组。

3.5。NAD (P) H氧化酶活性和表达心脏NAD (P) H氧化酶亚基p47phox

NAD (P) H氧化酶活动被DPI-inhibitable生产估计阴离子在心室和主动脉组织从350天的控制和CM仓鼠。的DPI-inhibitable产量显著增加心室和主动脉组织由47厘米仓鼠和32%的正常价值和cpm /毫克组织获得相同的组织从内在控制动物(数字5(一个)和5 (b))。ASA治疗规范化这些高架心室和主动脉DPI-inhibitable作品在CM中仓鼠,但没有影响生产控制动物近亲繁殖。

心脏组织的表达NAD (P) H氧化酶亚基p47在350天的控制和测量厘米仓鼠用免疫印迹法。的表达比p47phox在CM内在控制的在CM组()。ASA治疗减少这个表达式比附近的控制水平升高()(图6)。

4所示。讨论

在目前的研究中,CM仓鼠的心肌病随着年龄的发展。岁150天,心脏功能仍处于代偿阶段呈现只有心脏肥大和心动过速。此后,SBP和菲律宾开始下降与年龄和心脏衰竭的迹象,如减少食物摄入量,水肿,腹水开始出现。这些老年性心脏损害与先前的报道是一致的1,13]。与此同时,心血管组织生产显著升高厘米仓鼠增加NAD (P) H氧化酶活性和表达的亚基p47phox NAD (P) H氧化酶。

目前研究的一个重要的发现是,慢性ASA治疗显著减慢心脏肥大的发展通过减少心室/体重比值和叙利亚CM仓鼠心室纤维化的程度。此外,ASA治疗预防人力资源增加以及血压减少表明改进的变时性和变力的心脏功能。符合我们以前的报告(10],ASA治疗在目前的动物模型演示了一个强有力的抗氧化效果完全由升高心脏和主动脉组织正常化生产在CM仓鼠。的DPI-inhibitable生产和亚基的表达p47phox NAD (P) H氧化酶都减少了ASA治疗表明ASA的抗氧化作用可能是主要由减少NAD (P) H氧化酶活性和表达。我们的研究结果也表明,DPI-inhibitable生产总量明显有助于心血管组织生产。然而,DPI不是一个特定的NADPH氧化酶的抑制剂可以抑制NO合酶和细胞色素P450。这两个酶可能会修改过氧化物和其他活性氧的水平通过改变没有水平或P450-related新陈代谢。这些DPI的非特异性反应可能导致不精确的估计的贡献NADPH氧化酶的氧化应激使用DPI-inhibitable过氧化物生产。然而,表达的增加p47phox强烈建议增加NADPH氧化酶活性。

心肌病的病理生理学的叙利亚仓鼠似乎是多因子的(7]。Overactivation肾素-血管紧张素II系统已经报道的CM模式,在这种高水平的血管紧张素转换酶活性和AT1受体在心血管组织观察在早期(4,5]。这些upregulations可能导致冠状动脉血管功能障碍,促进血管痉挛和短暂的缺血。后者被认为导致心肌坏死的早期阶段,肌肉分解(14]。越来越多的证据表明,激活血管紧张素ⅱ系统可以增加心血管组织生产和氧化应激通过NAD (P) H氧化酶途径(8,15]。众所周知,oxidative-stress-mediated心脏损伤的病理生理学和发展涉及心肌病和心脏衰竭通过诱导细胞损伤和凋亡,抑制心肌收缩性和破坏性的冠状动脉内皮功能,心肌血液供应(7,16]。

ASA已报告提供有效有益的保护许多心血管病理条件下,如动脉粥样硬化、缺血性心脏病和心肌梗死。我们先前的研究已经表明,亚撒是一种有效的抗氧化剂,显著降低生产心血管组织和预防高血压的发展,血管肥大,胰岛素抵抗在许多病理条件包括月、长期glucose-fed老鼠,Angⅱinfusion-induced高血压模型(17,18]。此外,废除了ASA治疗慢性和II infusion-induced氧化应激,在大鼠心肌肥厚和高血压。值得注意的是,亚撒没有任何影响心脏收缩性等功能,心率和肥大在健康动物。事实上,急性ASA政府对心血管功能或没有任何影响生产(10]。我们之前的研究已经证明,所有这些心血管疾病有益ASA的预防,需要长期治疗。在目前的研究中,短期ASA治疗(1周)没有改善心血管功能或减少心脏肥大在CM仓鼠。基于所有这些元素,我们假定ASA在CM仓鼠的保护心血管的影响是间接的,可能由其抗氧化性能。我们之前的结果还表明,亚撒的抗氧化和心血管保护特性对COX - 2可能是由其影响,没有共享的其他抗炎药无选择性的COX抑制房地产如布洛芬、消炎痛或水杨酸19]。

在目前的研究中,只有早期开始(60天)岁长期ASA治疗减缓心脏肥厚性发展和部分预防心功能的恶化。在早期的年龄,CM仓鼠的病理变化的特点是冠状动脉痉挛,心肌micronecrosis,没有任何迹象表明心脏功能损害(20.]。在那一刻,ASA的抗氧化性质可以保护和改善血管内皮功能,缓解血管痉挛和心肌缺血,并防止micronecrosis,减缓心脏肥厚和心力衰竭发展。

心肌病的病理生理学的叙利亚仓鼠还不是很清楚。我们的结果表明,长期ASA治疗可以减缓心脏功能恶化表明氧化应激可能在心力衰竭的发展起着重要的作用在这个CM模式。然而,尽管ASA治疗规范化心血管生产和NADPH氧化酶的活动,它只能部分防止心脏功能的恶化。这些结果表明,一些氧化stress-independent机制可能参与了疾病的发展。

值得注意的是,CM仓鼠的体重明显低于控制在本研究动物。这可能导致一个过高的心脏肥大的CM仓鼠。然而,心室/体重比值明显证明肥大的发展随着时间的推移以及ASA的保护作用对体重没有任何影响。

总之,长期ASA治疗显著防止心脏结构和功能改变的CM仓鼠。看来ASA的预防效果是由其抗氧化性能。因此,我们的研究结果表明潜在有益的治疗中使用ASA治疗心力衰竭。

确认

作者想表达他们的感谢黛安·帕潘和西尔维皮卡德的技术专长以及尚塔尔博士兰伯特对她有用的评论。本研究支持的基金从加拿大卫生研究院的研究尚普兰(CIHR)赠款j . h . Girouard和加拿大创新基金会(CFI) h . Girouard。j .尚普兰是职业investigatorship j·c·爱德华兹的持有者。h . Girouard是一个操作的持有人授予魁北克矫揉造作的en桑特从昏聩(FRSQ)、加拿大自然科学和工程研究委员会(NSERC),和一个新的调查员从FRSQ和HSFC奖。