文摘

本文旨在探讨松花粉对老化的影响在人类二倍体成纤维细胞(2 bs细胞和一个加速老化模型,由皮下注射建立D-galactose每日在C57BL / 6 j小鼠8周。松花粉(1毫克/毫升和2毫克/毫升)证明延迟2 bs细胞的复制衰老就是明证增强细胞增殖,减少SA -β加活动,逆转的senescence-associated分子标记的表达,如p53、,、PTEN和年末PD细胞。此外,松花粉逆转D-galactose-induced老化影响神经活动和炎性细胞因子的水平,表明通过提高内存延迟时间和降低错误率降压测试和il - 6和TNF -的浓度下降α在小鼠模型。类似的角色年龄(高级糖化成品)形成抑制剂氨基胍(AG)、松花粉抑制D-galactose-induced年龄水平的增加从而逆转衰老模型小鼠的表型。此外,拒绝对松花粉抗氧化活性明显逆转治疗,可能占其抑制作用在非酶的糖化(否定)在活的有机体内。我们找到了松花粉为一个有吸引力的代理与潜在人类延缓衰老和减弱与年龄相关的疾病。

1。介绍

啮齿动物长期注射D-galactose已被广泛用作脑老化或衰老动物模型抗衰老的药理学研究[1- - - - - -4]。晚期糖基化终末产物水平增加(年龄)被认为帐户至少部分年龄为底层机制抑制剂氨基胍(AG)可能会阻止大部分衰老表型的D-galactose-induced小鼠模型(5]。年龄是一个异质群体的反应产品形成蛋白质的主要氨基和carbohydrate-derived醛基通过减少糖,葡萄糖和D-galactose等,通过非酶的糖化(否定)在体外和在活的有机体内(6]。越来越多的证据表明,年龄加剧和加速衰老过程,导致衰老相关疾病的早期阶段,包括神经退行性疾病、白内障、肾衰竭、关节炎、老年性视网膜黄斑性病变(7- - - - - -9]。此外,年龄和他们的前身通常含有活性羰基化合物,可以产生活性氧(ROS)的行为(10,11]。

作为一种中药,松花粉,是松树的男性孢子,被用作药物和食物了数千年。松花粉有影响治疗不同的疾病,如感冒、前列腺疾病、贫血、糖尿病、高血压、哮喘和鼻炎12- - - - - -14]。松花粉收集人为马尾松羔羊。,Pinus tabulaeformis Carr.,它有一个花粉源的特点,纯粹的质量,是一种稳定的组件。松花粉粉,称为“自然的微量营养素储藏室”,富含多种body-demanding氨基酸、矿物质、维生素、酶和类黄酮(12]。尽管提出,松花粉可能有延缓衰老的作用由于其对人体健康的各种好处,直接支持的实验证据表明药物与衰老到目前为止很少报道。因此,有趣的是调查是否松花粉具有延缓衰老的作用在体外和在活的有机体内。

在这里,松花粉的抗衰老的效果在体外首先调查了使用人类的二倍体成纤维细胞(2 bs)细胞株,已经研究的很透彻,广泛用作细胞衰老模型(15- - - - - -17]。然后,加速衰老模型小鼠诱导D-galactose被用来评估松花粉对老化的影响在活的有机体内(1,5,18]。我们对待一群5个月大的孩子C57BL / 6 j小鼠每日与D-galactose D-galactose结合不同剂量的松花粉(500、1000、1500毫克/公斤,resp), D-galactose结合年龄形成抑制剂AG)和控制缓冲为8周。在治疗结束时,学习和记忆能力,血清和脑年龄水平,为抗氧化活性指标,测定促炎细胞因子水平。我们的研究结果表明,松花粉可以延缓衰老细胞和小鼠因此给松花粉为一个有吸引力的代理可能延缓人类衰老和减弱与年龄相关的疾病。

2。材料和方法

2.1。试剂

松花粉是请浙江非政府组织提供的生物技术有限公司(杭州),并暂停了0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)管理。牛血清白蛋白(BSA), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside(半乳糖苷),D-galactose,盐酸氨基胍(AG)从Sigma-Aldrich购买。Elisa试剂盒对年龄、白细胞介素- 6 (il - 6)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α美国)测定了从研发系统。杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM),胎牛血清(的边后卫),从Gibco获得和胰蛋白酶,美国。包的丙二醛(MDA)测定和总超氧化物歧化酶(SOD)活性的测量是购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。BCA蛋白质分析工具包是皮尔斯化工有限公司、美国。

2.2。细胞培养

2 bs细胞线隔绝人类胎儿肺成纤维细胞最初建立的国家生物制品研究所(中国,北京)和已经研究的很透彻,广泛用作细胞衰老模型(15,19]。细胞被认为是年轻的比人口翻倍(PD) 30并完全衰老PD55或更高版本。的细胞在DMEM补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升在孵化器37°C公司为5%₂。培养的细胞分裂的比率1:2或1:4当文化的融合是85%以上。累积人口倍增(cpd)计算,在那里和被定义为细胞的密度收获和播种的时候。

2.3。细胞增殖检测

细胞增殖是使用XCELLigence监控系统(瑞士罗氏应用科学,DP),细胞增殖的impedance-based无损检测。细胞上电极的存在会影响当地的离子环境在电极/溶液界面,导致电极阻抗的增加。越来越多的细胞增加了阻抗检测,显示为细胞指数(CI)值。这个系统曾被验证的准确性监控细胞数量长期孵化的20.]。200年五千个细胞被播种μL细胞培养基在每个盘子好吧,一式四份。松花粉在最后补充1毫克/毫升的浓度和2毫克/毫升24 h后,和一个额外的细胞培养显示时间。细胞培养条件与上面所描述的那样,和细胞增殖监控结束了四天。

2.4。Senescence-Associated牛乳糖(SA -β加)染色

2 bs细胞在DMEM有或没有松花粉(1毫克/毫升和2毫克/毫升)是彩色的修改方法Dimri et al。21]。SA -的百分比β加阳性细胞总数的细胞数。平均百分比获得三个独立的实验。

2.5。免疫印迹分析

2 bs细胞被洗冰PBS和细胞溶解和细胞裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(细胞信号技术,Inc .)、美国)。蛋白质浓度测定BCA分析工具包(皮尔斯化工有限公司)。总50μg蛋白提取的加载和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳在12%,转移到硝基纤维素膜(美国生物)。膜与anti-p53随后被探测,,、anti-PTEN和(美国细胞信号技术,Inc .),和反β肌动蛋白单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司、美国),分别。二次抗体用于检测与辣根过氧化物酶。增强化学发光(ECL)方法用于检测结合辣根过氧化物酶。

2.6。动物和治疗

五个月的C57 BL / 6 j雌性老鼠(Slaccas上海实验动物有限公司,中国),随机分为六组,每组十个。一周的适应期后,动物被给予每日皮下注射进行为期八周的准备:(I)车辆控制;(2)D-galactose 100毫克/公斤;(3)D-galactose 100毫克/公斤+松花粉在500毫克/公斤,胃内的注入;(IV) D-galactose在100毫克/公斤+松花粉在胃内的注入1000毫克/公斤;(V) D-galactose在100毫克/公斤+松花粉在胃内的注入1500毫克/公斤;在100毫克/公斤(VI) D-galactose + AG)在胃内的注入100毫克/公斤。老鼠牺牲在治疗结束时,血清,器官和组织立即为实验收集或储存在−70°C为以后实验。血清可用于直接检测时应该执行组织样本按照下列治疗。

组织均匀化:组织样本称重和均质在正常生理盐水(NS)的研究,和5%的人获得匀浆。组织匀浆是用近两次30秒,间隔。均化和声波降解法是在4°C。声波降解法后,匀浆生化研究在3 000转离心10分钟和15分钟12 000 rpm,分别。整除的上层清液用于研究。每毫克蛋白表达的化验参数,整除的蛋白质含量是由BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯化工有限公司)。在这项研究中使用的所有实验程序已经在我们医院伦理委员会批准,所有动物实验被执行按照道德标准制定1964年的赫尔辛基宣言。作者做了个实验给了他们的知情同意前研究和遵循“实验动物保健原则”发表的美国国立卫生研究院(NIH没有出版。86 - 23,1985年修订)。

2.7。分步测试获得的内存

我们使用降压被动回避试验来评估小鼠的学习和记忆能力根据前面的描述(22]。简单地说,它是由一个透明的有机玻璃圆形笼(40厘米高,直径30厘米)的网格层和一个圆形平台(直径4厘米)的中心。在训练期间,动物被放置在平台及其延迟和所有四个爪子测量下台。在网格后立即辞职,动物会受到电击(0.6 mA, 2秒)。保留测试会话进行24 h后培训。降压延迟测试日记录的索引抑制性回避记忆。300秒的截止时间,和内存错误的数量在5分钟也记录下来。

2.8。测量SOD活性和脂质过氧化的老鼠

血清中超氧化物歧化酶(SOD)和大脑的活动是根据黄嘌呤氧化酶法检测标准提供的分析工具(南京建成生物工程研究所、中国)作为描述(17]。试验用xanthine-xanthine氧化酶系统产生超氧化物离子,与2 - (4-iodophenyl)反应3 -(氯化4-nitrophenol-5-phenlyltetrazolium)形成一个红色甲瓒染料,和吸光度550海里。值被表示为单位每毫克的蛋白质和蛋白质浓度是由BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯化工有限公司),在一个单位的草皮被定义为SOD抑制反应的速率的50%在25°C。

脂质过氧化是评估通过测量MDA浓度根据硫代巴比土酸(稍后通知)方法作为商业推荐(南京建成生物工程研究所、中国)。的方法是基于光谱光度测量的测量过程中产生颜色反应和MDA稍后通知。MDA浓度的吸光度计算稍后通知活性物质(TBARS) 532海里。

2.9。协议的其他分析

ELISA测定年龄,il - 6和TNF -α进行了与商业套件(研发系统、美国)根据制造商的协议。

2.10。抑制年龄形成在体外

AGE-modified BSA准备如前所述[23]。简而言之,BSA(100毫克/毫升)是在无菌条件下孵化与0.2米0.5米D-galactose磷酸盐(PBS, pH值7.4)37°C为8周。松花粉或AG)抑制,样本加上松花粉(1.2毫克/毫升和2.4毫克/毫升)或AG(100毫米),在相同条件下孵化。控制BSA样本在相同条件下孵化D-galactose但没有补充。样本透析(10 kDa截止)对PBS然后BSA-AGEs的内容是由一个商业酶联免疫试剂盒如前所述。

2.11。数据分析

数据或表中列出的所有数据被表示为±SEM。单向方差分析分析(SPSS 15.0)是用于在多个组数据比较。在每种情况下,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。松花粉对累积人口倍增的影响2 bs细胞

在这项研究中,我们首先观察到的影响松花粉复制寿命和复制衰老相关生物标志物在人类胎儿肺二倍体成纤维细胞(2 bs)。松花粉明显2 bs细胞的复制衰老推迟了至少7 PDs(见表1)。两个浓度的松花粉(1毫克/毫升和2毫克/毫升)显示PDs类似的涨幅。松花粉治疗细胞的增长率相比大幅增加(表控制的细胞1)。与此同时,松花粉2 bs细胞的增殖,改善使用Xcelligence系统(罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士),细胞增殖的impedance-based无损检测。与松花粉细胞PD30孵化1毫克/毫升和2毫克/毫升为24 - 48 h显示海拔最高20%细胞指数(CI)与控制(图1)。

3.2。松花粉对股价的影响β加活动2 bs细胞

正如预期的那样,只有零星的SA -β加积极的细胞中观察到年轻的控制。如图2SA -β加积极的1毫克/毫升和2毫克/毫升松花粉治疗PD55细胞%,%,分别,这远低于PD55控制细胞(%)。这些结果表明间接松花粉推迟了人口2 bs细胞的衰老。

3.3。松花粉对表达的影响在2 bs细胞衰老相关的分子

激活p53-p21和p16-Rb通路导致复制人类二倍体成纤维细胞(细胞衰老17,24]。类似于我们之前的实验中,蛋白质含量升高的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和观察后期控制PD 2 bs细胞。然而,senescence-associated分子p53表达的增加,p21,年末p16 PD 2 bs细胞显著逆转的年轻控制松花粉治疗后(图3)。此外,新兴的证据表明,肿瘤抑制磷酸酶和tensin同族体PTEN及其下游效应器也复制衰老的关键(24,25]。因此,松花粉对该信号通路的影响也是当前实验检查。免疫印迹结果表明,PTEN蛋白表达和是表达下调对松花粉治疗PD年末2 bs细胞(图3)。

3.4。松花粉对年龄的影响形成老鼠

事实,松花粉制动2 bs细胞的衰老过程促进了我们检测松花粉是否对D-galactose-induced衰老延缓衰老的影响模型。的确,在松花粉治疗,鼠标未显示出显著异常,可以检测到视觉检查。所有组的老鼠体重通常在整个研究(表2)。正如所料,老鼠接受D-galactose显示明显增加血清水平和大脑年龄与控制(组2和组我,见下表2),AG),一种广泛接受的年龄形成抑制剂,显著逆转海拔D-galactose-treated小鼠血清和脑年龄(第六、组与组II,见下表2)。应该注意的是,在三个不同剂量的松花粉,低剂量(500毫克/公斤)治疗显示最佳效果,大大阻碍D-galactose-treated小鼠的血清年龄的增加(第二,第三组与组,见下表2)。尽管松花粉的剂量依赖性抑制作用在D-galactose-treated小鼠,观察脑时代形成的在体外试验表明,松花粉BSA-AGEs形成(图上几乎没有抑制作用4)。

3.5。松花粉对小鼠的神经活动的影响

接下来,我们测试是否松花粉引起的血清和脑年龄的衰减会逆转老化的影响,如神经活动,D-galactose-induced老化模型。学习和记忆能力被降压测试检查。D-galactose治疗显著降低年轻小鼠的学习和记忆活动与控制就是明证缩短延迟降压和高数量的内存错误在五分钟。与先前的研究一致(5),降低模型小鼠的学习和记忆活动可以逆转AG)治疗(图5)。五分钟内人数的增加内存错误D-galactose-treated年轻老鼠也阻止了松花粉治疗。同样,松花粉逆转降压的缩短延迟D-galactose-treated老鼠。明显,高剂量(1500毫克/公斤)的松花粉表现出同等效力的AG)治疗(见图5)。

3.6。松花粉对老鼠的促炎细胞因子水平的影响

能够很好的证明,老化是增加循环的促炎细胞因子水平。水平的提高老年人血清炎症标记物与神经退行性疾病相关,如痴呆、帕金森病(26]。如图6肿瘤坏死因子-α血清中il - 6水平和大脑显著升高D-galactose-treated老鼠与对照组相比。值得注意的是,松花粉治疗显著预防脑il - 6的增量与AG)的治疗。肿瘤坏死因子-一个下降趋势α水平血清和大脑也观察到在松花粉治疗模型小鼠,但差别无统计学意义。

3.7。松花粉对小鼠的抗氧化酶活性和脂质过氧化作用

据报道,D-galactose治疗导致海拔氧化应激在活的有机体内和在体外(2,27]。正如所料,SOD活性降低,MDA水平,血清中脂质过氧化反应的指标,增加和大脑在D-galactose-treated年轻的老鼠。然而,额外的松花粉治疗导致的增加脑SOD活性和MDA水平显著降低血清和脑D-galactose治疗小鼠(见表3)。与之前的研究一致(5),一个强有力的可逆AG对SOD和MDA的影响在这个衰老模型也观察到(表3)。

4所示。讨论

人力二倍体成纤维细胞分裂的次数有限在体外,这一现象被称为复制衰老(28]。衰老2 bs细胞的表型包括形态学变化,降低细胞增殖,积极的SA -β加染色(16],G1周期阻滞主要是蛋白水平升高引起的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和(17]。因此,我们选择这些senescence-associated标记评估松花粉的抗衰老的效果在当前的研究中。我们的研究结果表明,松花粉延迟2 bs细胞的复制衰老就是明证增强细胞增殖,减少SA -β加活动,扭转了p53的表达,p21和p16分子PD年末细胞(数字1,2,3)。与此同时,的表达也减毒在松花粉治疗,进一步支持我们的结论。松花粉的剂量(1毫克/毫升& 2毫克/毫升)用于本研究远高于先前的研究(10μg / mL) (14]他们用乙醇提取的松花粉(PPE),这是与我们的不同。我们使用了松花粉粉而不是它的提取。由于大量的活性物质在我们的材料是低于松花粉的乙醇提取物,高剂量必须用于我们的实验。然而,细胞毒性之间的松花粉0 ~ 5毫克/毫升察觉在2 bs细胞MTT试验显示(见图7)。

尽管松花粉表现出抗衰老的效果在体外,是否具有防止衰老的作用在活的有机体内仍然是难以捉摸的。这里我们选择一个D-galactose引起的加速老化模型在活的有机体内研究该模型类似于年龄控制同行(16 - 24-month-old)在生理和病理上都和被广泛用于抗衰老的药理学研究1,29日,30.]。我们之前的研究表明,D-galactose注射导致加速老化表型通过增加血清年龄水平(5,18]。治疗年龄形成抑制剂氨基胍(AG)和红景天甙D-galactose-induced衰老小鼠可以阻止大部分衰老表型,表明年龄可能账户至少部分加速老化的机制(5,18]。

在目前的实验中,松花粉显示不同的抑制作用在模型小鼠血清和脑年龄形成。当模型小鼠接受高剂量(1500毫克/公斤)的松花粉,年龄的最低水平的大脑和一个最好的反转效应降低神经活动观察(图5)。然而,松花粉较低剂量(500毫克/公斤)表现出最好的抑制功效血清年龄一代而不是其他两个高剂量(1000毫克/公斤和1500毫克/公斤)。此外,在体外试验表明,松花粉BSA-AGEs形成几乎没有抑制作用,它不同于AG)的角色,这种化合物可以抑制非酶的糖化(否定)在活的有机体内和在体外(表2和图4)。可能的原因不同的角色之间的松花粉和AG)列出如下。首先,松花粉含有多种成分,包括蛋白质、维生素、酶和辅酶、脂肪、类黄酮、核酸、单糖、多糖、磷脂等营养物质(12]。黄酮类化合物被报道为年龄形成强有力的抑制剂(31日,32),而蛋白质的成分和单糖的基质非酶的糖化年龄可能加速形成。因此,松花粉在时代形成的抑制作用将部分抵消本身。因为更高剂量的花粉含有更多non-enzymatic糖化基质,更好地抑制松花粉血清年龄形成显示在低剂量而不是更高的剂量体内。其次,松花粉表现出最佳的抑制在脑年龄高剂量(1500毫克/公斤);这可能是更多的活性物质,如类黄酮引起的松花粉经历进入大脑组织。第三,松花粉可能间接抑制年龄的形成在活的有机体内的抗氧化机制。增加年龄水平可以诱导细胞内氧化应激水平升高的水平,进而促进non-enzymatic糖化(11,33]。有效清除活性氧(ROS)可能会阻塞的形成年龄。事实上,D-galactose-treated老鼠显示海拔氧化应激在我们的实验中,大大减少了松花粉,表示的MDA浓度下降,和SOD活性下降(表的回复3)。

另一方面,老龄化是与增加循环的促炎细胞因子水平有关26),这至少在一定程度上源于年龄的增加老年人随着年龄增加炎症通过与受体结合多年(狂怒)。炎症介质通过年龄调节通路包括TNF -α、il - 6和c反应蛋白(34]。从而降低TNF -α和il - 6在我们的模型中小鼠松花粉处理在一定程度上由于其抑制作用在非酶的糖化类似导致模型小鼠被广为接受的年龄抑制剂AG)也观察(图6)。

然而,我们的研究可能是有限的几个方面。松花粉是一种复杂的混合物,有必要明确哪一种成分的松花粉负责NEG抑制活动,因此这种有益的影响可以通过使用从松花粉中提取相应的优化。进一步的工作关于NEG抑制活性和抗氧化剂之间的关系还需要这种药物的性质。

5。结论

综上所述,松花粉延迟证明人类二倍体成纤维细胞和块的复制衰老D-galactose-induced模型小鼠血清和脑年龄的增长水平,这可能导致D-galactose-induced老化效应的逆转在这两个神经系统和炎症。松花粉可能发挥其抗衰老的影响至少部分由其NEG-inhibiting效果在活的有机体内。我们的工作首次直接证明了自然剂的抗衰老的功效在活的有机体内和在体外从而激发这个药物在老年化领域的新应用程序。

确认

本文由基金支持来自中国卫生部(wkj2011 - 2 - 014),从浙江省卫生局基金(11-CX01)、浙江省科学技术厅项目(2008 c33046)和浙江省重点学科领域的老年病学计划。作者要感谢浙江非政府组织生物科技有限公司(杭州)提供松花粉。