文摘
这项工作旨在研究特定效果的组织病理学分析海马(HC)和海马旁皮质(PHC)和氧化应激(OS)参数在海马等脑区(HC),前额叶皮层(PFC)和纹状体(ST)。瑞士老鼠(25 - 30 g)是管理一个单一的ip剂量的MCT(5、50或100毫克/公斤)在盐水或4%渐变80(对照组)。30分钟后,动物被斩首牺牲和大脑区域(HC、残杀威、PFC或圣)被移除组织病理学分析或解剖和测量操作系统参数的均质(脂质过氧化、亚硝酸盐和过氧化氢酶)分光光度法。组织学评价治疗的老鼠的大脑结构与MCT(50和100毫克/公斤)显示病变相比,海马体和海马旁皮层控制。脂质过氧化作用是明显的在所有特定管理后大脑区域。亚硝酸盐/硝酸盐含量降低在所有剂量HC、PFC、圣过氧化氢酶活性增加只在HC MCT组。总之,野百合碱导致海马区和海马旁皮质细胞病变区域和产生氧化应激在HC, PFC和圣在老鼠身上。这些发现可能有助于神经系统的影响与这种化合物有关。
1。介绍
野百合碱(MCT)是一个pyrrolizidine产生的生物碱Crotalaria属,导致的肝毒性作用在动物和人1,2]。Pyrrolizidine生物碱被激活在活的有机体内由肝细胞色素P450混合功能氧化酶类,生产一代亲电pyrrolic中间体(3]。Dehydromonocrotaline似乎解毒与谷胱甘肽共轭(谷胱甘肽)4]。Dehydromonocrotaline抑制呼吸链复杂的活动我NADH氧化酶。可能的机制是复杂的构象的变化我的代谢物(半胱氨酸巯基共同的5]。
人类暴露于特定消费后的草药茶或受污染的粮食1,6]。致命的毒性已经被报道在羊38 - 120 h后管理Crotalaria婆罗有些人克/公斤(7,8]。马是特别敏感中毒MCT和显示出典型的肝纤维化的照片和神经症状(金伯利马病)和慢性接触生物碱(9,10]。初步研究表明,MCT导致一些病变器官,如肝脏(11)和肺(12]。也有报道这些器官的组织学变化和MCT神经毒性与它的亲油性9,13),但有一个小的信息相关的组织学变化在中枢神经系统(CNS)。
氧化应激(OS)经典定义作为氧化剂的氧化还原失衡造成的过剩或缺乏系统中的天然抗氧化剂14,15]。正常的大脑消耗氧气每单位质量率较高的组织和含有低水平的抗氧化剂。在正常的大脑兴奋性氨基酸,这些氨基酸是重要的正常功能。另外,神经递质分子与氧化过程。例如,多巴胺和去甲肾上腺素与氧气反应形成奎宁和半醌,它可以消耗谷胱甘肽(16,17]。同样,在大脑多巴胺的氧化单胺氧化酶释放过氧化氢代谢产物会导致组织损伤,包括脂质过氧化、DNA损伤、酶失活(18]。脑脂质是高度富含多不饱和脂肪酸(16,19]。此外,某些地区的中枢神经系统,如纹状体和海马,可能特别敏感操作系统因为其内生低水平的维生素E,一个重要的生物抗氧化剂,相对于其他脑区(20.]。一些研究与MCT发现谷胱甘肽(GSH)的含量超过50%的增长后在大鼠肝脏MCT(65毫克/公斤,i.p)政府(4]。另一方面,其特定的强度增加细胞OS肺动脉内皮细胞(1,12]。基于上面引用的事实和其特定政府导致小鼠中枢神经系统的改变(21),我们决定评估特定政府在组织病理学的影响分析以及测试通过硫代巴比土酸氧化应激的活性物质(TBARS),作为脂质过氧化作用的指标,以及过氧化氢酶活性和亚硝酸盐/硝酸盐含量海马体,前额叶皮层和纹状体。这个想法是为了研究活性氧和活性氮物种的关系(RNS)与MCT毒害神经的效果。
2。材料和方法
2.1。植物材料
Crotalaria婆罗收集树叶Patos-Paraiba的地区(巴西),2009年11月,被植物学家Maria de法蒂玛阿格拉。凭证标本阿格拉e Gois 3607是保存在教授Lauro皮雷Xavier标本(Joao萨姆、PB、巴西)。
2.2。野百合碱的提取和分离
地面种子(640克)c .婆罗72年以95%的乙醇提取三次h。ethanolic提取在减压蒸发产生褐色粘性残留物(53.4 g),用3%盐酸洗,直到Dragendorff试剂是负面的。在酸性溶液碱性pH值(9)与氨(25%)和反复用氯仿提取。氯甲酸溶液与Na干2所以4无水、过滤、蒸发,直到干燥得到总生物碱部分(10.48 g)。薄层色谱分析显示一个生物碱的存在。干残留乙醇重结晶给无色棱柱晶体(收益率ca。1.4%基于种子干重的材料),融化在197 - 198°C。它被确认为野百合碱基于1 h NMR、13 c NMR、HMQC, HMBC光谱数据和报告的比较与巴雷罗et al .(1980)和程et al。(1986)22,23]。
2.3。动物
男性瑞士老鼠,25 - 35 g,动物屋的联邦大学的西阿拉。实验按照指南进行的实验动物保健和使用美国卫生和人类服务部,华盛顿特区,美国(1985年)和部门的同意和监督下进行联邦大学的生理学和药理学西阿拉的使用动物研究伦理委员会(CEPA N°10/08)。
2.4。药物治疗和动物
纯化MCT博士提供的是前首相何塞•玛丽亚•巴博萨球场从制药技术实验室,联邦大学的帕拉伊巴(巴西)。MCT乳化渐变为4% 80(美国σ)盐0.9%24]。
动物一旦与矿渣MTC治疗剂量的5,50或100毫克/公斤ip,分为3组,每组10个动物。对照组(车辆)收到4%渐变80溶解在0.9%盐水体积一样对待动物(10毫升/公斤)。24小时后药物管理局的动物被牺牲了,他们的脑区(海马旁cortex-PHC hippocampus-HC,前额叶cortex-PFC或striatum-ST)被移除的组织学分析或解剖和均质10%磷酸缓冲0.05 pH值7.4操作系统(HC、PFC或圣)参数决定。
2.5。组织病理学分析
大脑快速切割,neutral-buffered固定在4%多聚甲醛,并处理常规石蜡包埋。矢状部分,5μ米厚,被连续的海马,海马旁皮质,和选择部分被苏木精和伊红染色(H / E)光学显微镜检查。组织学观察结果(由病理学家使用双盲法评估)是通过病理评分量表得分的修改工作展会上et al。(2005)25]。下面是组织学评分量表。(0)正常的形态。(1)轻微损坏(水肿,很少有致密的细胞)。(2)中度破坏(结构混乱、水肿、温和的致密的细胞液泡化,炎性细胞浸润)。(3)强烈的伤害(结构混乱、水肿、强烈的致密的细胞,空泡形成,炎症细胞浸润)。
我们包括免疫组织化学分析结果。免疫组织化学使用streptavidin-biotin-peroxidase方法执行caspase-3 [26(4)在formalin-fixed,石蜡包埋组织部分μ米厚),安装在poly-L-lysine-coated显微镜幻灯片。部分deparaffinized,患者通过二甲苯和分级醇。抗原检索后,内源性过氧化物酶被封锁(15分钟)和3% (v / v)过氧化氢和清洗在磷酸盐(PBS)。一夜之间,部分被孵化(4°C)主要anti-caspase-3抗体(多克隆山羊anti-mouse)稀释1:200年PBS +牛血清白蛋白(PBS-BSA)。幻灯片被孵化与生物素化的山羊anti-IgG PBS-BSA稀释1:200。洗后,幻灯片与avidin-biotin-horseradish孵化过氧化物酶共轭(喉炎校正Vectastain复杂的试剂和过氧化物酶底物溶液)30分钟,根据Vectastain协议。Caspase-3与发色体可视化3 3′diaminobenzidine (DAB)。负控制部分同时处理如上所述,但与第一抗体PBS-BSA 5%所取代。没有负面的控制显示caspase-3免疫反应性。幻灯片和哈利的苏木精复染色,在梯度酒精脱水系列,清除在二甲苯和盖玻片。
2.6。测定脂质过氧化
脂质过氧化物的形成,分析了通过测量硫代巴比土酸反应物质(TBARS)匀浆(27]。样本添加到催化自由基的生成系统(FeSO40.01毫米和抗坏血酸0.1毫米),然后孵化为30分钟37°C。反应是停止0.5毫升的10%三氯乙酸,然后样本离心机(3000转/ 15分钟),和上层的检索和与0.5毫升的0.8%硫代巴比土酸混合然后在沸水浴中加热15分钟这段时间之后,他们立即洗澡保持冷的冰。脂质过氧化是由吸光度在532 nm,表示为μ摩尔的丙二醛(MDA) / g组织。
2.7。Nitrite-Nitrate决心
对亚硝酸盐的评估,源自一氧化氮(NO), 100年μL H格里斯试剂(1%磺胺的1%3阿宝4/ 0.1% N - H (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐/ 1%3阿宝4/蒸馏水,1:1:1:1)被添加到100μL脑匀浆或100μL纳米2在浓度范围从0.75到100μL(标准曲线)。读者的吸光度测量板在560海里。标准曲线是用于测定亚硝酸盐浓度样品(28]。结果表示为M。
2.8。过氧化氢酶活动的评价
过氧化氢酶活性测定的方法,采用过氧化氢生成H2O, O2(27]。活动是通过这个反应的程度来衡量的。过氧化氢的测定混合物包含0.3毫升50毫升0.05磷酸盐缓冲剂,pH值7.0。示例整除(20μL)被添加到980μ基质混合物的L。初始和最终吸光度被记录在230 nm 1和6分钟后,分别。建立了标准曲线使用净化过氧化氢酶(σ,密苏里州,美国)在相同的条件下。所有样本稀释0.1更易与L磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)引起抑制50%的稀释率(即。不羁的反应)。蛋白质决定使用牛血清白蛋白作为标准(29日]。结果表示为毫米/分钟/毫克的蛋白质。
2.9。统计分析
方差分析的结果分析(方差分析)与Student-Newman-Keuls测试(事后)GraphPad Prism 5.0版本Windows, GraphPad软件,圣地亚哥,美国。被认为具有统计显著性差异。
3所示。结果
3.1。组织病理学分析
组织学评价治疗的老鼠的大脑结构与MCT(50或100毫克/公斤)显示病变相比,海马体和海马旁皮层控制(得分:0 (0 - 1))。分数显示严重结构性瓦解,水肿,温和的致密的细胞,空泡形成,炎症细胞浸润在浓度50毫克/公斤(分数:2(2 - 3))和100毫克/公斤(分数:2(1 - 3))(图1)。免疫组织化学分析结果显示增加的半胱天冬酶3,表明细胞凋亡引起的特定关系来控制动物(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。氧化压力参数
3.2.1之上。脂质过氧化作用
MCT在脂质过氧化的影响呈现在图3。MCT管理,在这两种剂量(50或100毫克/公斤),MDA水平增加(脂质过氧化标记)在HC (;)、PFC (;)和圣(;)与控制(HC:;PFC:;圣:)和特定轴5毫克/公斤(HC):;PFC:;圣:)组。
(一)
(b)
(c)
3.2.2。亚硝酸盐含量
MCT在所有剂量(5,50或100毫克/公斤)导致低水平的亚硝酸盐在HC (;)和PFC (;)与对照组(HC:;PFC:)(数据4(一)和4 (b))。类似的效果在圣(图4 (c)),亚硝酸盐的含量只有高剂量的MCT(50或100毫克/公斤)与控制(;)。
(一)
(b)
(c)
3.2.3。过氧化氢酶活性
过氧化氢酶活性增加的MCT组,在所有剂量,在HC (;)与对照组(控制:)(图5(一个))。没有观察到的改变在PFC(过氧化氢酶活性;)或圣(;)经过政府的MCT(5, 50或100毫克/公斤)与对照组(PFC: 37.38 + 5.41;圣:23.99 + 5.52)(数据5 (b)和5 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
分子可能会引起肝毒素的生物碱,pneumotoxic,诱变和神经毒性效果4]。金伯利马病是在马陶醉与野百合碱(pyrrolizidine生物碱),它提出了神经系统症状与神经有关变更(30.]。在这种方式,诺等人观察到动物陶醉与MCT显示中枢神经系统如抑郁症相关临床症状,减少运动活动,和运动不协调(9,24]。
我们的组织病理学结果显示,50或100毫克/公斤的野百合碱导致海马区和海马旁皮质病变区域。病变观察到在我们的工作严重结构性瓦解,水肿,温和的致密的细胞,空泡形成,炎症细胞浸润。根据先前的研究显示这些结果液泡化,增加在皮质星形胶质细胞、神经元胞体主要co-ultures,指神经损伤引起的MCT (31日]。同样,另一项研究表明,pyrrolizidine生物碱野百合碱诱导的细胞毒性,形态变化,氧化和基因毒性损害神经胶质细胞,使用人类胶质母细胞瘤细胞系GL-15作为模型(32]。野百合碱的结果在两个剂量免疫化学显示增加半胱天冬酶3相比,大脑区域控制,表明细胞凋亡,因此这些结果是根据组织学的数据。细胞凋亡的特征是DNA碎片,膜起泡,细胞收缩,和拆卸成membrane-enclosed囊泡,从而防止宿主炎症反应细胞内组件(33]。在分子水平上,经典的激活细胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶家族被称为还在特定切割目标蛋白质的天冬胺酸。两个主要的凋亡通路的激活下游的刽子手还存在3 - 6 (34,35]。所以半胱天冬酶3细胞凋亡是一种免疫组织化学标记。
基于这些组织学改变海马,海马旁皮质区域和行为研究表明,MCT能够导致严重的改变在中枢神经系统9,13,24),我们决定研究氧化应激在HC, PFC和圣老鼠接受未经中华人民共和国交通部。这些大脑区域选择由于易受氧化应激和参与运动行为。
多项研究表明,活性氧在许多疾病的发病机制有重要的作用,尤其是神经和精神疾病(36- - - - - -38]。氧化应激可能是中枢神经系统常见的致病机制许多疾病,因为大脑相对更容易受到氧化损伤(39]。本研究中提供的数据表明,MCT(50或100毫克/公斤)的三个脑区TBARS增加,表明脂质过氧化反应的增加。膜脂质紊乱,包括脂质过氧化反应,已报告做出显著贡献的阵发性膜功能障碍在神经退行性疾病40]。McEwen表明压力是在海马体神经毒性效应,易诱发抑郁症的发展(41]。剂量的中华人民共和国交通部负责我们的研究结果表明,50或100毫克/公斤可能有助于改变中枢神经系统由于增加了脂质过氧化惠普、PFC、和圣事实上,除了大脑更容易受到比其他组织脂质过氧化产物,伤动物高操作系统增加前列腺素水平和生产过剩的化合物可以释放噢,•(42]。
许多研究把重点放在了生化和分子行为的一氧化氮(NO)在正常情况下,以及其潜在的变更在中枢神经系统37,43,44]。我们调查了MCT对亚硝酸盐含量的影响,观察到低水平的亚硝酸盐在所有研究大脑区域在特定管理。低反应的水平值的亚硝酸盐/硝酸盐和HC, PFC,圣可能发生因为一氧化氮是一种不稳定的分子45,46]。在中枢神经系统中,主要的活性氮物种(RNS)氧化应激的中介是过氧亚硝基ONOO−(47]。过氧亚硝基参与氧化应激是很难确定的,因为他们减少寿命和与其他分子的相互作用48]。然而,它已经表明,压力条件下产生的变化没有新陈代谢和glutamatergic受体产生刺激行动的一部分,在中枢神经系统49]。不,在生理水平,参与多种生理过程组成的神经传递和调节血管壁50]。
海拔在自由基的形成伴随着立即补偿增加自由基清除酶的活动(51]。在我们的实验情况下,过氧化氢酶活性增加后的脂质过氧化水平只有在HC。HC是极其敏感的操作系统的影响比其他大脑区域(52]。更大的敏感性HC压力相比其他组织可以解释的基础上微分这些区域血液供应,更深入地坐落在呼吸气体的扩散53]。这些结果可能代表一个神经保护机制的过氧化氢酶氧化作用引起的中华人民共和国交通部负责与政府相关TBARS增加大脑区域研究。
氧化应激被许多神经退行性疾病相关,如缺血和帕金森病(16]。鱼藤酮、异黄酮的化学物质,属于家庭自然中发现一些植物的根和茎,作为广谱杀虫剂(54]。特征相似的MCT,如线粒体的有效抑制剂complex-I穿过血脑屏障以及细胞膜容易因为其亲脂性的结构55]。目前的结果表明,未经中华人民共和国交通部增加油脂的过氧化反应和过氧化氢酶的活动,只有在HC,虽然减少亚硝酸盐/硝酸盐contente。海马体是可能影响更大,因为它是一个富有的地区线粒体。这些都是与生产有关的抗氧化防御当大脑受到有害的代理是野百合碱(56,57]。鱼藤酮,一种神经毒素作为帕金森模型,还可以将油脂的过氧化反应和长期治疗大鼠一氧化氮含量54]。这种物质也会增加过氧化氢酶活性在慢性政府大鼠(55]。
5。结论
我们的研究结果表明,野百合碱在HC和PFC地区引起细胞病变。它产生氧化应激在HC, PFC和圣在老鼠身上。这些改变可能导致神经影响相关化合物。
承认
作者承认巴西国家研究委员会的支持(CNPq)。