文摘

遗传性出血性毛细血管扩张(HHT)是一种血管发育异常引起的突变endoglin (英格;HHT1)或激活素受体激酶(ALK1;HHT2)基因,编码转化生长因子- (TGF - )总科受体。我们之前证明endoglin ALK1与内皮没有合酶(以挪士)和影响其激活。内皮细胞缺乏endoglin或ALK1蛋白质显示以挪士解偶联,没有降低,增加了活性氧(ROS)的生产。在这项研究中,我们测量和H2O2在几个器官的成人水平英格和Alk1杂合的老鼠,确定是否没有降低,增加活性氧的生产是一个广义的表现遗传性出血性毛细血管扩张症。显著减少没有和ROS增加生产中发现的几个器官,患者受到影响。ROS在突变小鼠生产过剩是归因于以挪士,因为它是L-NAME的制约。被抗霉素,线粒体ROS的贡献是在肝脏NADPH氧化酶最高,被apocynin,其他组织中活性氧的主要来源。然而,在抗霉素-没有区别和apocynin-inhibitable ROS突变之间的生产和控制老鼠。我们的研究结果表明,eNOS-derived活性氧导致内皮功能障碍和可能易诱发疾病表现在多个器官的遗传性出血性毛细血管扩张症患者。

1。介绍

遗传性出血性毛细血管扩张症(Rendu-Osler-Weber-syndrome)是遗传的一种常染色体显性遗传方式,患病率约在5 - 8000人,在全球范围内。突变endoglin(ENG)和激活素受体激酶(ACVRL1或ALK1)分别负责HHT1和HHT2,占大约85%的病例(1]。endoglin和ALK1组件的转化生长因子-β(TGF -β)总科的受体,主要表达血管内皮。TGF -受体复合物β1,-β3亚型包含coreceptor endoglin与II型(TβRII)和I型受体ALK1或ALK5 [2]。Endoglin和ALK1直接绑定到骨形成蛋白BMP-9 BMP-10和调解的影响结合BMPRII [3]。Smads1/5/8 ALK1激活导致磷酸化,ALK5磷酸化Smads2/3。磷酸化Smads形式与普通Smad4 heteromeric复杂,积聚在细胞核,调节基因的转录。MADH4突变编码Smad4约占3% - -5%的遗传性出血性毛细血管扩张症,这些少年息肉病(常与4]。另外两个位点连锁不平衡与遗传性出血性毛细血管扩张症,5和7条染色体和代表HHT3 HHT4,分别为(5,6]。这些基因的识别可能会增加我们的理解的分子缺陷负责这种疾病。遗传性出血性毛细血管扩张症的特点是鼻出血、黏膜与皮肤的胃肠道telangiectases,动静脉畸形(avm)内脏器官1]。尽管基因检测要求确定患者的基因型,肺和脑avm的发病率是一般较高HHT1肝动静脉和肠道并发症更经常发生在HHT2 [7,8]。疾病的潜在机制haploinsufficiency,表明突变导致低水平的功能性endoglin或ALK1而不是突变蛋白的主要负面影响(9,10]。

老鼠完全缺乏endoglin或ALK1特点是胚胎致死表型是由于心血管缺陷(11,12]。Endoglin杂合的(英格+ /−)和ALK1杂合的(Alk1+ /−)小鼠作为模型用于HHT1 HHT2,分别让我们解剖疾病的潜在机制(11,12]。我们以前的研究表明,一氧化氮(没有)介导的血管舒张受损英格+ /−老鼠和endoglin是重要的在内皮没有合酶(以挪士)激活13,14]。此外,endoglin和ALK1联系和稳定以挪士激活复杂导致没有生产。在内皮细胞缺乏endoglin或ALK1,以挪士变成了非耦合,产生比没有更过氧化物,导致组织损伤和血管受损的语气13- - - - - -16]。

有趣的是,最近的研究也显示,成人英格+ /−和Alk1+ /−老鼠表现出肺动脉高血压(PAH)包括远端肺血管稀疏muscularization小动脉,增加右心室(RV)收缩压和房车肥大15,16]。这些症状是由于非耦合以挪士活动和增加超氧化物( )生产,如抗氧化治疗可以防止发病多环芳烃(15,16]。

众所周知,提高生物利用度的活性氧(ROS)和氧化还原信号一起减少没有特异表达生产可以促进内皮损伤血管疾病(17]。活性氧产量的主要酶来源内皮细胞线粒体呼吸酶,NADPH氧化酶类和非耦合以挪士(17]。过多的活性氧产量可能因此在内皮功能障碍的发病机制有重要的作用导致疾病,如遗传性出血性毛细血管扩张症和多环芳烃。因此,我们研究了抑制剂的帮助下,任何的贡献,ROS产生酶在不同器官的成人英格+ /−和Alk1+ /−老鼠。我们报告,没有一代减少氧化应激增加在几个突变小鼠的组织。线粒体活性氧的主要来源在肝脏,而NADPH氧化酶产生的ROS在其他组织,在突变体和控制老鼠。我们确定以挪士活性氧的主要来源生产过剩英格和Alk1杂合的老鼠。我们的研究表明,氧化应激可能使患者的血管内皮英格和ALK1haploinsufficiency疾病表现。抗氧化治疗应考虑为这些病人。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

磷酸缓冲盐(PBS) pH值7.4,来自生命技术公司,伯灵顿,加拿大;S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP50)从世界精密仪器有限公司萨拉索塔,佛罗里达州,美国;从费舍尔科学硫酸铜,渥太华,加拿大;精氨酸,NG-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME)、抗霉素A Apocynin,并从Sigma-Aldrich玫瑰,奥克维尔,在加拿大;从Ambion EDTA,生命技术公司;从Fermantas蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,伯灵顿,加拿大。Amplex红分析工具包包括辣根过氧化物酶分子探针,尤金,或者美国。

2.2。实验动物

所有协议都是批准的儿童医院和多伦多Phenogenomics动物保健中心委员会(AUP # 0067)按照加拿大动物护理和指导委员会发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生院(NIH出版。85 - 23日,修订后的1996年;A5047-01)。N28-N32英格+ /−和英格+ / +C57BL / 6小鼠所产生的连续回交,如前所述的基因(11]。Alk1+ /−和Alk1+ / +(N13-17)生成和这些描述(18]。老鼠从14至18周的年龄是用于所有测量。

2.3。组织收集

小鼠腹腔内注射麻醉的克他命(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)。对肺组织收集、灌注小鼠通过右心室与PBS。对于所有其他器官解剖,PBS灌注是通过左心室。器官保存在冷PBS和立即使用或Amplex红色检测。

2.4。没有测量

切除心脏、肺和肝组织中孵化Krebs-Henseleit缓冲2小时37°C L-NAME的存在与否。没有生产量化使用微传感器ISO-NOP700阿波罗4000自由基分析仪。微传感器的校准使用SNAP50硫酸铜的存在。

2.5。H2O2测量

H2O2水平估计使用Amplex红试验装备按照制造商的指示。仔细解剖组织与PBS和均质在25毫米刷新消息灵通的缓冲区,pH值7.4,+ 1毫米EDTA和蛋白酶抑制剂。在6000 g离心后5分钟在4°C,上层清液被孵化的微量滴定板在37°C 1小时Amplex红色,辣根过氧化物酶,精氨酸(NOS衬底,1毫米)。1毫米的影响L-NAME (NOS抑制剂),50μM抗霉素(呼吸链反应抑制剂),和100年μM Apocynin(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH氧化酶抑制剂)的反应进行了测试。荧光在544 nm量化使用激发,发射在590海里;数据归一化蛋白质含量。

2.6。在肺组织脂质过氧化反应测量

脂质过氧化产物的浓度8-iso PGF2α确定使用液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)[描述19]。

2.7。统计分析

比较是由适当的方差分析测试和显著差异进行评估事后使用Newman-Keuls测试。结果表示为均值±SEM, 代表的意义。

3所示。结果

3.1。减少生产的组织英格和Alk1杂合的老鼠

没有水平减少肺、肝和心脏组织英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,相比各自同窝出生仔畜控件(数字1(一)和1 (b))。L-NAME抑制生产的心脏、肺和肝的野生型小鼠,表明NOS参与。endoglin和ALK1主要通过内皮细胞,以挪士是酶最有可能参与其中。在英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,L-NAME没有抑制没有生产,建议以挪士异常激活和潜在的解偶联。

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图1
减少生产的组织英格和Alk1杂合的老鼠。没有水平测量使用微传感器的存在与否NOS抑制剂L-NAME, 1毫米。心里没有水平显著降低,肺,肝脏(a)英格+ /−和(b)Alk1+ /−老鼠控制相比,他们的同胞。一氧化氮抑制了生产L-NAME在所有组织的控制(a)的老鼠而不是组织英格+ /−或(b)Alk1+ /−老鼠。* 和* * * 与+ / +未经处理的小鼠; 8 /组英格老鼠和6 - 10 /组Alk1老鼠。
3.2。活性氧产量增加的组织英格和Alk1突变小鼠

Amplex红试验显示大幅提高H2O2生产在肺部、肝脏和结肠英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,而相应的野生型小鼠(数字2(一个)和2 (b))。这增加H2O2可能反映了ROS增加生产。H的最高水平2O2观察在高度杂合的老鼠的血管组织,如肝脏和肺,这表明内皮细胞活性氧的主要生产商。这也可以解释为什么尽管没有水平降低,活性氧水平没有差异变异和控制老鼠心脏组织,在心肌细胞总组织的代表~ 75%质量。

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图2
活性氧产量增加突变小鼠的组织。H2O2生产测量Amplex红,估计组织活性氧产量。H2O2一代增加在肺、肝和结肠组织(一个)英格+ /−和(b)Alk1+ /−相应的野生型小鼠相比老鼠。心脏ROS生产类似的突变和控制之间的老鼠。* ,* * 和* * * 与+ / +老鼠; -15 /组英格老鼠和7-20 /组Alk1老鼠。

确认H2O2反映ROS水平生产,我们估计的数量产品8-iso-PGF2脂质过氧化作用α肺的杂合的老鼠。我们发现高水平的产品英格+ /−肺( ng / g的组织)相比,同窝出生仔畜控件( ng / g的组织; , )。我们还观察到肺8-iso-PGF2水平增加α在Alk1+ /−老鼠之前报道(16]。这些结果证实肺的更高的氧化应激英格+ /−和Alk1+ /−老鼠相比,同窝出生仔畜控制和验证使用Amplex红试验作为一种评估ROS。

3.3。L-NAME减少ROS在组织生产英格和Alk1杂合的老鼠

确定ROS增加生产的源头英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,我们比较各种抑制剂影响H的能力2O2的水平。我们表明,NOS抑制剂L-NAME,显著降低H2O2代在肺部、肝脏和结肠英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,但对野生型小鼠(数据没有影响3(一个)和3 (b))。这一结果表明,以挪士是杂合的老鼠确实非耦合导致ROS生产而在控制老鼠,以挪士是正常的,不产生活性氧。

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图3
ROS生产被L-NAME突变小鼠的组织。H2O2生产是衡量Amplex红色和NOS抑制剂L-NAME。结果被表示为一个百分比的值(没有抑制剂)各自的控制。L-NAME显著抑制H2O2生产在肺、肝和结肠组织(一个)英格+ /−和(b)Alk1+ /−老鼠但没有影响组织控制的老鼠。在心脏组织,L-NAME效果没有明显不同突变体和控制老鼠。* ,* * ,__ 与相应的控制样本值; -13 /组英格和Alk1老鼠。
3.4。线粒体NADPH Oxidase-Mediated ROS生产类似突变和控制老鼠的组织

呼吸链抑制剂抗霉素,减少ROS的相同程度上组织生产英格+ /−,Alk1+ /−老鼠和它们各自的野生型控件(数字4(一)和4 (b))。影响最强的肝脏,50% - -75%的ROS antimycin-inhibitable其次是肺(25% - -50%)、心(25% - -30%),结肠(5% - -25%)(数据4(一)和4 (b))。然而,H的绝对水平2O2以antimycin-treated样品仍明显高于肺和肝的英格+ /−( ),Alk1+ /−( )各自野生型小鼠相比,控制,显示更高的整体ROS生产。Apocynin, NADPH氧化酶抑制剂,挡住了一半的活性氧产量突变体和野生型小鼠(数据的组织4 (c)和4 (d))。最大的抑制作用apocynin观察结肠,其次是肺、心脏和肝脏。没有显著差异NADPH-dependent H2O2生产之间的杂合的和野生型老鼠。

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图4
线粒体和NADPH-dependent ROS生产突变体和野生型老鼠之间并无不同。结果表达各自的比例控制在抑制剂的缺失值。(a)和(b)抗霉素,50μM,抑制线粒体ROS生产组织的同一水平英格+ /−,Alk1+ /−和相应的野生型老鼠。 -11 /组英格老鼠和5 - 15 /组Alk1老鼠,除了肝脏样本Alk1+ / +老鼠, 。(c)和(d) Apocynin, 100μ米,抑制NADPH-oxidase依赖H2O2生产组织的突变体和野生型老鼠。 8 /组英格和Alk1老鼠,除了两组小鼠的心脏样本, 。* ,* * ,* * * ,__ 与相应的控制(样品没有抑制剂)值。

4所示。讨论

我们的报告英格和Alk1杂合的老鼠没有减少生产和增加了几个器官的ROS水平,表明氧化应激会导致内皮功能障碍。这是第一个报告比较不同组织中产生的ROS水平的这些老鼠和建立没有降低,增加活性氧生成可以推广到多个器官。活性氧的主要来源生产过剩英格+ /−和Alk1+ /−老鼠没有合酶,这表明非耦合以挪士作为一个主要机制,增加氧化应激在肺、肝脏和结肠英格+ /−和Alk1+ /−老鼠。我们还表明,在肝、线粒体ROS而贡献NADPH氧化酶是其他组织的主要来源。然而,这两个源产生的ROS的比例是相似的遗传性出血性毛细血管扩张症和控制老鼠。

活性氧物种被认为是重要的球员在生理和病理生理条件。少量的ROS是必要的,作为生理调节胞内信号通路(20.]。然而,生产过剩的活性氧(如过氧化物、过氧化氢、羟自由基和过氧亚硝基)对不同疾病的发病机理(21,22]。氧化应激的最著名的角色是内皮功能障碍的病理机制在心血管疾病如高血压、高血脂、糖尿病、动脉硬化、血管炎,心肌炎,等等。尽管multiorgan血管发育异常和血管压力特征的遗传性出血性毛细血管扩张症(23),很少有研究调查ROS参与这种疾病的发病机制。我们以前报道,增加H2O2肺的一代英格+ /−老鼠加剧肺血管舒张(占24]。我们还展示了多环芳烃的发病英格+ /−和Alk1+ /−成年小鼠可归因于内皮细胞氧化应激增加,因为它可以通过抗氧化治疗(15,16]。这些发现是高度相关的个人ALK1和英格可以开发PAH突变,有或没有遗传性出血性毛细血管扩张症25- - - - - -27]。同时,突变基因编码BMP受体II型(BMPR2)构成大多数情况下的家族多环芳烃和特发性病例的40% (28]。此外,增加氧化应激已经观察到PAH患者(29日,30.]。这些发现表明endoglin功能作用,ALK1, BMPR2调节血管功能和氧化应激。

据我们所知,这是第一个报告显示ROS增加生产的几个主要的器官英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,包括肺、肝脏、结肠,在遗传性出血性毛细血管扩张症的影响。我们估计ROS水平通过测量H2O2由Amplex红试验。在之前的文献[16),我们观察到一个好的Amplex红色之间的相关性分析结果和ROS水平估计使用荧光探针(H2DCFDA和她),直接H2O2超灵敏探测器测量,分析产品8-iso-PGF2和脂质过氧化作用α。

我们确认号是活性氧的主要来源在组织的生产过剩英格+ /−和Alk1+ /−老鼠。我们以往的研究显示,以挪士解偶联的内皮细胞遗传性出血性毛细血管扩张症患者和英格和Alk1杂合的老鼠(14,16]。以挪士密切相关的小窝/内皮细胞脂质筏,endoglin和ALK1 colocalize一半寿命与以挪士作为脚手架分子以挪士/协会和以挪士激活(14,15,31日]。在突变小鼠,以挪士解偶联呈现监管TGF -酶耐火材料β/ BMP信号和代表一个关键事件导致过度的氧化应激。非耦合以挪士单体形式和生成活性氧,而不是没有,如我们建议的模型(图所示5)。神经元NOS没有观察到,几乎测不出和诱导NOS在小鼠组织(13,16];因此,我们得出这样的结论:观察增加L-NAME制约H2O2组织的遗传性出血性毛细血管扩张症小鼠(图3)是eNOS-derived。事实上,以挪士解偶联被建议作为一个主要pathomechanisms在广泛的心血管和肺部疾病等32]。我们的研究结果有力地表明,这种现象发生在突变小鼠的多个器官和不能解释的减少ROS增加生产(数字1和2)。我们之前也没有生物利用度降低系统性报道由等离子体硝酸盐水平较低英格+ /−老鼠(13,14]。NOS-dependent (L-NAME制约)H2O2生产也是ROS的唯一来源之间显著不同的突变体和控制老鼠。


图5
模型在突变小鼠氧化应激导致血管内皮损伤。在英格+ /−和Alk1+ /−老鼠,改变以挪士激活呈现监管TGF -酶耐火材料β/ BMP信号和代表一个关键事件导致过度的氧化应激。非耦合以挪士产生少量的没有和高水平的氧自由基( )。L-NAME NOS抑制剂,能抑制ROS生产突变小鼠的组织。超氧化物歧化酶(SOD)和SOD模拟复合Tempol转换 更少的有害的过氧化氢(H2O2)。ROS的很大一部分是由线粒体(Antimycin-inhibitable)和NADPH氧化酶类(Apocynin-inhibitable)不过这一比例并不在不同突变体和控制老鼠。没有细胞水平低也可能抑制线粒体K三磷酸腺苷通道(mitoK三磷酸腺苷)开放,触发渗透过渡毛孔(PTP)打开,并进一步增加氧化应激引起的线粒体活性氧释放。

长期以来一直被称为线粒体ROS的重要来源。少量的线粒体活性氧的作用在细胞信号最近被公认33),但普遍认为,线粒体ROS增加参与许多血管和神经退行性疾病的病理学34]。实验分离线粒体电子形成泄漏估计2%的-3% (35),主要是dismutated H2O2锰超氧化物歧化酶(SOD2)在线粒体基质(图5)。线粒体ROS的重要性及其去除由观察到强调SOD2零老鼠展览围产期死亡率由于心脏功能障碍(36]。我们发现抗霉素,线粒体复杂三世抑制剂(37),显著抑制H2O2突变体的生产组织和控制老鼠(数字4(一)和4 (b))。尽管antimycin-inhibitable ROS部分器官之间的不同,这是杂合的和控制老鼠之间的相似。然而,尽管相似比例的抑制,但绝对数量的H2O2估计在antimycin-treated样品高突变小鼠的肺和肝。这可能是解释为没有减少间接抑制线粒体K三磷酸腺苷通道开放(图5),引发的毛孔渗透过渡,进一步增加氧化应激引起的线粒体活性氧释放(38,39]。

NADPH氧化酶类已成为相关酶的来源。事实上,NADPH氧化酶是一个主要的ROS发电机在内皮细胞(40]。NADPH氧化酶酶复杂的包含两个膜结合组件,gp91phox(也称为Nox2)和p22phox,和几个胞质监管子单元,包括p47phox p67phox,小GTPase Rac(图5)。在内皮细胞Nox1 Nox2、Nox4 Nox5表达(40]。酶激活后,胞质单元把细胞膜和由此产生的复杂的转移电子从NAD (P) H氧气分子的形成 (41]。在内皮细胞活性氧产生的少量NADPH氧化酶可能有助于保持临界超氧化物和船只没有水平之间的平衡。最近,它已被证明,endothelium-dependent冠状血管舒张需要NADPH oxidase-derived ROS (42]。过量的活性氧产生的这些酶导致心血管疾病,包括高血压和动脉粥样硬化的发展41]。然而,NADPH氧化酶拮抗剂的使用仅限于动物研究,因为大多数这些化合物,包括apocynin用于这项研究和二苯基碘鎓,可能具有特异性的脱靶效应。新triazolo嘧啶,VAS3947等特定NADPH氧化酶类,但其可能的干扰替代来源的活性氧,如线粒体电子链,不能排除(43]。另一方面,众所周知,一些抗高血压药物(即有利影响。,angiotensin-converting enzyme inhibitors and AT1 receptor antagonists) are partly due to their ability to inhibit NADPH oxidase activation and expression [41]。我们的研究结果证实,NADPH氧化酶是生产活性氧的主要来源在心脏、肺、肝脏和结肠而不是。然而,apocynin-dependent H2O2生产相似的杂合的指示和控制老鼠的部分NADPH-dependent ROS不是变异的不同组织和控制老鼠(数字4 (c)和4 (d))。

众所周知,细胞内ROS水平受ROS生成酶和抗氧化酶之间的平衡,包括SOD(图5)和过氧化氢酶。在先前的研究中,我们已经表明,SOD1的表达,2,3和过氧化氢酶的肺相似英格+ /−(24),Alk1+ /−(16控制老鼠)小鼠相比。

总之,我们的研究表明氧化应激增加几个机关英格+ /−和Alk1+ /−老鼠和建议以挪士解偶联作为活性氧的主要来源生产过剩。这种过度ROS生成可能发挥关键作用的病理学内皮功能障碍的遗传性出血性毛细血管扩张症。我们的研究结果还表明,遗传性出血性毛细血管扩张症患者可能受益于抗氧化治疗。我们之前显示抗氧化剂Tempol能够防止PAH的发作英格+ /−和Alk1+ /−老鼠(15,16]。在遗传性出血性毛细血管扩张症患者,迄今为止唯一的审判进行的试点研究抗氧化剂防治作用是给患者12周(44]。这项研究的结果看起来很有希望,有一个重要的频率和严重程度的减少鼻出血治疗遗传性出血性毛细血管扩张症患者,改善他们的生活质量。然而,抗氧化治疗中使用的一些改善心血管疾病的临床研究显示[很少或根本没有改善45]。一般策略与抗氧化剂用于不同疾病可能不是很有效,因为ROS生产不同器官。有效抗氧化治疗应该量身定做不同的各种条件。我们的研究结果表明,抗氧化剂是遗传性出血性毛细血管扩张症有前途的治疗工具,并鼓励他们使用在实验和临床研究,这将有助于确定最有效的治疗策略。

5。结论

我们的研究证明英格和Alk1杂合的老鼠显示没有降低,增加eNOS-dependent ROS生产几个器官表明氧化应激的作用在这些老鼠的内皮功能障碍。我们的研究结果还表明,遗传性出血性毛细血管扩张症患者可能受益于抗氧化治疗。

利益冲突

作者宣称他们没有冲突的爱好。

确认

作者感谢m, d·雷诺和m . Leadley儿童医院,8-iso-PGF2多伦多α测量数据和专业知识和评论。他们感谢……哦,佛罗里达大学,给他们Alk1杂合的老鼠。这项工作得到了加拿大心脏与中风基金会(批准号T5598) m .今天早晨。